专利名称：水貂IFN-γ基因的重组菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水貂IFN-Y基因的重组菌株。从分离的水貂外周 血淋巴细胞中(PBMC)扩增到y-干扰素基因，连接到pGM-T载体 上，构建了 pT-MiIFN-y重组质粒，转化大肠杆菌JM109，获得含水 貂IFN-y基因的重组菌株。
背景技术：
干扰素(Interferon, IFN)是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫 调节等活性的细胞因子。它是由脊椎动物的细胞产生的一类分泌型糖 蛋白，是发现最早，研究最多的细胞因子。它具有广谱抗病毒和增强 免疫应答的作用。能非特异性抑制多种病毒的增殖，在免疫应答调控 中处于中心地位。其抗病毒和抗肿瘤发生的特性使其具有用于免疫预 防和治疗的潜力。
根据IFN的基因序列，染色体定位，受体特异性，分为三型，艮口I 型、II型、和m型干扰素，I型IFN主要有a、 J3两个型，主要由淋巴细 胞和成纤维细胞产生；II型IFN为y-干扰素，主要由T细胞和NK细胞产 生。
与I型IFN相比，II型IFN有多种免疫学活性，具有促进MHCII类抗 原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强辅助T细胞和细胞 毒性T细胞的产生等诸多免疫调节活性，既可以单独作为生物制剂应用于疾病的治疗，也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。
Y-干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性，人Y-干 扰素在临床疾病的防治中早有应用，动物Y-干扰素作为生物制剂或疫 苗佐剂也具有较好的应用前景，许多国家已经将动物细胞因子的开发 利用作为研究重点。目前医学上干扰素已经广泛用于病毒性疾病的治
疗。研究发现IFN不仅能单独作为生物制剂应用于一些疾病的防治，
而且可作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果，还能与一些病源微生物 的保护性抗原基因共表达，从而增强和改善疫苗的免疫效果。
动物干扰素主要停留在基础研究和临床试验阶段。自1981年 VandenbroeckK等首次克隆了猪IFN-Y基因以来犬、牛、鸡、鸭等动 物的干扰素基因也被相继被克隆，并取得了一定进展，目前已有商品 化的猪、犬、鸡等重组干扰素产品在市场上应用。但国内外未见水貂 (Mink)的Y-干扰素基因克隆和相关制剂使用的报道。水貂(Martes， Mustelavison)在动物分类学上属于哺乳纲，食肉目，鼬科，貂属的 一种小型珍贵毛皮动物，在野生状态下，有美洲水貂和欧洲水貂两种， 我国现在人工饲养的水貂属美洲水貂。2007年9月加拿大的Ochi,A.报 道了驯养的雪貂IFN-Y的基因序歹lJ。由于Y-干扰素具有种属特异性，经 比较发现本发明所述的水貂IFN-Y与雪貂IFN-Y的基因序列个别位点 具有明显差异。
水貂具有很重要的药用与经济价值，其皮张与狐狸皮和波斯羔羊 毛命名为世界裘皮市场的三大支柱。目前我国养貂业发展较迅速，已 经成为我国农村产业结构调整和增加农民收入的重要产业。随着该产业发展，细小病毒肠炎、犬瘟热、阿留申等病毒性疾病严重危害水貂 养殖业的传染病时常发生，造成严重经济损失，限制了水貂养殖业的 发展；由于这些病毒性传染病发病死亡率高，普通药物治疗效果不理 想，因此研制和开发具有抗病毒活性和免疫调节活性的基因工程水貂 重组干扰素类生物制品,在水貂病毒性疾病防治上具有十分重要的意 义
发明内容
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本发明的目的在于提供一种水貂IFN-Y基因的重组菌株，克服了 现有技术上的不足，从分离的水貂淋巴细胞中扩增出水貂y-干扰素基 因，并将其插入克隆载体，转化大肠杆菌，进行单克隆筛选鉴定，获 得含水貂，干扰素基因的重组子，为研制和开发具有抗病毒活性和免 疫调节活性的基因工程水貂重组干扰素类生物制品奠定基础。
本发明的技术方案是这样实现的水貂IFN-y基因的重组菌株， 其特征在于是从经植物血凝素(pha)刺激的水貂外周血淋巴细胞 (PMBC)中克隆的水貂ifn，基因序列，它含有如下核苷酸序是一种含有核苷酸序列的重组质粒载体；即使用了质粒载体pGM-T， 由一种克隆载体在^boRV酶切为点处切开，再两侧的3'端加入"T"
而成；所述从水貂淋巴细胞中扩增的编码y-干扰素的核苷酸序列进行 TA克隆，构建含水貂y-干扰素的核苷酸序列的重组质粒。并将质粒 载体转化的大肠杆菌，大肠杆菌宿主。
本发明的积极效果是为研制和开发具有抗病毒活性和免疫调节 活性的基因工程水貂重组干扰素类生物制品奠定基础。
图l、水貂y-干扰素基因氨基酸序列
图2、 RT-PCR产物鉴定RT-PCR扩增产物；1、水貂IFN-Y扩增 产物，2、阴性对照，3、 DNA分子量标准
图3、 pT-MiIFN-y质粒酶切鉴定￡coR I双酶切产物琼脂糖凝胶 电泳鉴定；1、酶切产物，2， 3、 DNA分子量标准
图4、 pT-MiIFN-y质粒PCR鉴定；1、 DNA分子量标准，2， 3、 质粒PCR产物，4、阴性对照
图5、水貂y-干扰素基因测序图谱
图6、水貂与雪貂(登录号EF492064)、犬(登录号AF126247) 的IFN-y基因的氨基酸序列比较
具体实施例方式
1、材料与方法(1) 限制性内切酶、Taq酶、DNA分子量标准均购自宝生物(大连) 有限公司。细菌培养酵母提取物、蛋白胨购自英国Oxford。无 机盐世纪均为国产分析纯。
(2) 菌种与质粒，大肠杆菌DH5a为申请人保存。
质粒的制备，感受态的制备，DNA的转化及转化子的筛选，限 制性内切酶的水解等常见方法均参见(分子克隆)
2、鉴于水貂与犬在动物分类学上同属关系和亲缘关系较近的特 征，根据GenBank发表的犬科动物Y-干扰素基因序列，序列登录号 为(NM001003174)，设计合成了一对特异引物，引物序列为
pl: ATGACCAGTAGATGCATC，
p2: TTCAGTTCTGGAGATAAT。
3、 无菌采取健康水貂外周血5mL，置于加有抗凝剂(38g/L柠檬酸 钠)的灭菌容器中，然后在无菌条件下加入RPMI-1640培养液1: 1 稀释；取5mL稀释的外周血缓慢加入5mL人用淋巴细胞分离液上， 室温下2 000r/min水平转子离心40min;用折弯的灭菌长针头小心将 白细胞层移于另一试管，加2倍体积的RPMI-1640液混匀后2 000r/min离心10min，去上清，沉淀物再加入等量RPMI-1640，相同 方法洗涤沉淀2次，去上清，沉淀细胞用含10 OOOU/mL双抗、100mL/L 小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮；取lOiuL细胞悬液计数，按计数 结果将细胞悬液稀释至lxl(^个/mL浓度，置于24孔细胞培养板中， 37°C， 5。/。C02培养箱中静止培养2h后，加入PHA诱导物培养24 h;
4、 用植物血凝素(PHA)诱导后外周血淋巴细胞总RNA的提取收集诱导24h后的淋巴细胞于15ml离心管，2 000r/min离心10min，弃 上清，将沉淀用lmlTRIzolReagent重悬后冻存于-70。C备用。取出装 有淋巴细胞的冻存管，室温自然融化后，加入l/5Trizol体积的的氯仿， 充分混匀后静置3min， 12 000r/min离心10min，小心吸取上清，加入 1/2Trizol体积的异丙醇，充分混匀后放置于一2(TC沉淀lh， 12 000 r/min离心15min，将沉淀用75%的乙醇缓慢洗涤两遍，倒置控干后用 9.5pl的lmL/L的DEPC处理的灭菌水溶解沉淀，即获得淋巴细胞总 RNA。
5、水貂IFN-Y基因的扩增
采用RT-PCR方法扩增目的基因，具体操作如下
(1) 在9.5jli1的RNA溶液中加入1ili1 0ligo(dT)15引物(50pmol/jaL)， 混匀后置70。C水浴作用5min，立即冷却，依次加入10 mmol/L dNTP 5pL， AMV Buffer 4jiL, RNase Inhibitor 0.5)iL， AMVljiL充分混匀， 42'C反应lh， 95°C 3min灭活反转录酶，冷却后直接用于下一步PCR 反应；
(2) PCR反应体系10x五xTaq Buffer 2.5[il， 2.5mmol/|J dNTP 2[il， 上、下游引物(25pmol/nD各l!il， TaqDNA聚合酶(2u/!iD 0.125^1， 加入灭菌去离子水至25ul;将25(al反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为95。C预变性5min; 94。C45s， 52.5。Clmin， 72。Clmin， 32个循环后，72。C延伸6min;扩增完毕后，取6^于1.5%琼脂糖凝胶 电泳观察结果；
(3) 用胶回收试剂盒回收与理论值大小相同的基因片段，构建TA克隆，经PCR及酶切鉴定后，初步鉴定为阳性的克隆送上海英骏生物技 术有限公司测序，应用DNAStar对测序结果进行分析。 6、水貂IFN-y基因序列分析
以PHA诱导培养水貂外周血淋巴细胞总RNA作为模板，经 RT-PCR获得MiIFN-Y基因。取RT-PCR产物于1.5。/。 (m/v)琼脂糖凝 胶上电泳，结果显示，获得的PCR扩增产物为501bp的基因片段，与 预期的目的基因片段大小相符；测序结果表明，克隆MiIFN-Y基因大 小为501bp，含有501bp的开放阅读框，与GenBank上发表的雪貂 (EF492064)和犬(AF126247)的IFN-Y序列核苷酸同源性分别为 99.4%和93.8%，氨基酸同源性分别为98.2%和88%;由SignalP 3.0 Server和SIG-Pred软件预测编码的前20个氨基酸为信号肽。
序歹ij表
Mink (Mustela putorius fbro) IFN-y碱基序歹ll: 序列长度501bp
链 数双链 序列种类DNA 起源生物水貂 序列特征
表示特征的记号CDS 存在位置1-501
决定特征的方法和鼬科及其它犬科动物对比 表示特征的记号信号多肽 存在位置1-60
决定特征的方法与雪貂和犬科比对 表示特征的记号寡肽 存在位置61-501GTGTGTTTCCCGGCCGCAGAGCATCGAAATAA Mink (Mustelaputoriusfuro) IFN誦y氨基酸序歹ij:
DLQVQRKAINELIKV画DLSPRSNLRKRKRSHSVFPGRRASK.
权利要求
1、水貂IFN-γ基因的重组菌株，其特征在于是从经植物血凝素(PHA)刺激的水貂外周血淋巴细胞(PMBC)中克隆的水貂IFN-γ基因序列，它含有如下核苷酸序列ATGAATTATACAAACTATATCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGATTTTCTGTTCTTCTGGCTATTACTGTCAGGCCATGTTTTTTAAAGAAATAGAAGACCTAAAGGAATATTTTAATGCAAGTAATCCAGATGTAGCAGATGGTGGGCCTCTTTTCTTAGATATTTTGAAGAACTGGAGAGAGGAGAGTGACAAAACAATCATTCAAAGCCAAATTGTCTCCTTCTACTTGAAACTGTTTGAAAACTTCAAAGATAACCAGATCATTCAAAGGAGCATGGATACCATCAAGGAAGACATGCTTGTCAGGTTCTTCAATAACAGCAGCAGTAAGCGGGAGGACTTCCTTAAGCTGATTCGAATTCCCGTGAATGATCTGCAGGTCCAGCGCAAAGCGATAAATGAACTCATCAAAGTGATGAATGATCTCTCACCAAGATCTAACCTAAGGAAGCGGAAAAGGAGTCACAGTGTGTTTCCCGGCCGCAGAGCATCGAAATAAGGCCGCAGAGCATCGAAATAA
2、根据权利要求1所述的水貂IFN-Y基因的重组菌株，其特征 在于所述的序列是含有核苷酸序列的重组质粒载体。
3、 根据权利要求2所述的水貂IFN-Y基因的重组菌株，其特征 所述的重组质粒载体，是使用了质粒载体pGM-T，是由一种克隆载体 在5boR V酶切为点处切开，再两侧的3'端加入"T"而成；所述从 水貂淋巴细胞中扩增的编码Y-干扰素的核苷酸序列进行TA克隆， 构建含水貂Y-干扰素的核苷酸序列的重组质粒。
4、 根据权利要求2所述的水貂IFN-y基因的重组菌株，其特征 在于所述的质粒载体转化的大肠杆菌。
5、根据权利要求4所述的水貂IFN-Y基因的重组菌株，其特征在于所述的大肠杆菌为大肠杆菌宿主。
全文摘要
本发明涉及一种水貂IFN-γ基因的重组菌株，其特征在于是从经植物血凝素(PHA)刺激的水貂外周血淋巴细胞(PMBC)中克隆的水貂IFN-γ基因序列，是一种含有核苷酸序列的重组质粒载体；即使用了质粒载体pGM-T，由一种克隆载体在EcoR V酶切为点处切开，再两侧的3’端加入“T”而成；所述从水貂淋巴细胞中扩增的编码γ-干扰素的核苷酸序列进行TA克隆，构建含水貂γ-干扰素的核苷酸序列的重组质粒。并将质粒载体转化的大肠杆菌，大肠杆菌宿主。是为研制和开发具有抗病毒活性和免疫调节活性的基因工程水貂重组干扰素类生物制品奠定基础。
文档编号C12N1/21GK101531986SQ20081005101
公开日2009年9月16日 申请日期2008年7月23日 优先权日2008年7月23日
发明者张海玲, 立 易, 柴秀丽, 王凤雪, 罗国良, 赵春霏, 闫喜军 申请人:中国农业科学院特产研究所