专利名称：在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种 子真空侵染法。
背景技术：
近年来以植物作为生物反应器瞬时表达外源蛋白以其周期短、易操作和低成本等优点成 为一个研究热点。到目前为止利用植物瞬时表达体系的主要方法有叶片直接涂抹法、叶片真 空侵染法和叶片注射法三种。其中直接涂抹法和叶片注射法需要逐个叶片操作耗时比较长； 叶片真空侵染法主要是在离体叶片上进行，外源蛋白的表达只能限定在被侵染的叶片上，而 且真空侵染后需要后续的工作来维持叶片的新鲜度。
作为生物反应器瞬时表达体系的植物有很多种，包括烟草、西红柿、黄瓜、水稻和生菜 等。其中以茄科植物作为生物反应器的研究居多，但茄科植物体中含有烟碱，在后期蛋白纯 化过程中可能污染目的蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一个方便、快捷可以在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白方法。 本发明的具体方案如下 1.以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系。
首先将豌豆早褐病毒载体pCAPEl和pCAPE2-GFP转入农杆菌GV3101中，挑取经转 化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl单菌落，分别接种于LB液体培 养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬，将GV3101-pCAPE2-GFP和 GV3101-pCAPEl两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，侵染后将种子 播种于土壤中，8-20天在紫外灯下观察豌豆植株中绿色荧光蛋白的表达情况以确定侵染条 件。选择适当的真空压力、真空时间、菌液浓度和伤害处理四个因子进行体系的优化，在无伤 害处理条件下，重悬液浓度OD60(pl.0-1.2，真空压力为0.06-0.lMPa,真空时间为1-15分钟， 于侵染后12-14天收获外源蛋白。
2.以发芽种子真空侵染法在豌豆中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子
4将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列连入豌豆早褐病毒表达载体pCAPE2中 构建得至lj pCAPE2-aFGF ，将其转入农杆菌GV3101中，挑取经鉴定的农杆菌 GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养， 离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬，将GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl 两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，在无伤害处理条件下，侵染时 重悬液浓度OD6()()=1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，侵染后将种子 播种于土壤中，并以1中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬 时表达体系为参照依据，于侵染后12-14天收获外源蛋白。并以Western blot检测外源蛋白 人源酸性成纤维细胞生长因子。
豆科植物是非常重要的经济作物，多数的豆科植物蛋白质含量比较高，而且很多豆科植 物都是非常优质的牧草，因此以豆科植物作为生物反应器具有重要意义。本发明周期短、易 操作、成本低、无污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白。
具体实施方案
本发明的实施例包括以下内容
1. 以绿色荧光蛋白GFP为报告基因构建并优化豌豆发芽种子真空瞬时表达外源蛋白体系 将豌豆种子在清水中浸泡6-8小吋，之后置于湿润的滤纸上于25-28'C黑暗条件下进行催芽，
以根长为2-3厘米的豌豆种子为实验材料进行真空侵染。挑取经转化和鉴定的农杆菌 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl单菌落，分别接种于5 ml含有50 mg /L卡那霉素， 12.5 mg/L四环素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 °C过夜培养。次日，按照1:50 的比例将1 ml的菌液加入50 ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，选择OD,值范围 在1.0-1.2的菌液于常温下4000 rpm， IO分钟离心收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100 乙 酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2，， 250 pl Tween20、 pH 5.6的无菌水溶液重悬，将 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl两种菌体的重悬液l : 1混合，于室温放置90分钟 后侵染豌豆发芽种子。将侵染后的种子播种于土壤中，8-20天后在紫外灯下观察GFP的表达 情况。通过设置伤害处理和不同的侵染时间、真空压力以及菌液浓度对豌豆发芽种子真空侵 染体系进行优化，我们确定最佳侵染条件为无伤害处理，菌液浓度OD6orl.0-1.2，真空压力 为0.08MPa，真空时间为1分钟。侵染后12-14天绿色荧光蛋白表达量最大，此为外源蛋白 收获的最佳时间。
2. 以发芽种子真空侵染法在豌豆植株中表达人源酸性成纤维细胞生长因子
对pCAPE2载体进行改造，通过PCR方法在原载体上引入BglII酶切位点，根据AaFGF序列设计引物(正义引物5'-GGAAGATCTACATGGCTAATTACAAGAAGCC-3'反义引物 5'-CGGAATTCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3').经PCR扩增出的aFG尸片段。PCR参 数94。C 3min;94。C 35 sec， 54°C 30sec，72。C 1 min共30个循环；72°C 1 min; 4 。C10min。 双酶切后将"FGF片段连入pCAPE2得到目的载体pCAPE2-aFGF。将其转入农杆菌GV3101 中，挑取经鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl单菌落，分别接种于5ml 含有50mg/L卡那霉素，12.5 mg/L四环素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28。C过 夜培养。次日，按照l:50的比例将lml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养 基中，选择OD6oo值范围在1.0-1.2的菌液于常温下4000 rpm， 10分钟离心收集菌体，菌体沉 淀用含有终浓度100pM乙酰丁香酮、10mMNaCl、 1.75 mM CaCl2，、 250 pl Tween20、 pH 5.6 的无菌水溶液重悬，将GV3101-pCAPE2-aFGF禾tl GV3101-pCAPEl两种菌体的重悬液1 : 1 混合，于室温放置90分钟后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，用于在豌豆中瞬时表达。根 据报告基因表达情况在侵染后12-14天后提取豌豆植株可溶性总蛋白。方法如下
取碗豆植物全株，快速称量后放入研钵，加入液氮进行充分研磨。成粉末后转移到 Eppendorf管中,加入预冷的蛋白提取缓冲溶液，颠倒混匀置于冰上。12000转/分在4。C条件 下离心，取上清检测；Western杂交分析，在分子量约17 kDa处有阳性信号，说明该体系能 够有效的表达人源酸性成纤维细胞生长因子。
权利要求
1、在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法，其特征是1). 以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽种子真空侵染瞬时表达体系首先将豌豆早褐病毒载体pCAPE1和pCAPE2-GFP转入农杆菌GV3101中，挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1两种菌体的重悬液混合后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子；侵染后将种子播种于土壤中，8-20天在紫外灯下观察豌豆植株中绿色荧光蛋白的表达情况以确定侵染条件，选择适当的真空压力、真空时间、菌液浓度和伤害处理四个因子进行体系的优化，在无伤害处理条件下，重悬液浓度OD600＝1.0-1.2，真空压力为0.06-0.1MPa，真空时间为1-15分钟，于侵染后12-14天收获外源蛋白；
2、按照权利要求1所述的在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法，其特征是1).以绿色荧光蛋白GFP为报告基因构建并优化豌豆发芽种子真空瞬时表达外源蛋白体系将豌豆种子在清水中浸泡6-8小时，之后置于湿润的滤纸上于25-28i:黑暗条件下进行催 芽，以根长为2-3厘米的豌豆种子为实验材料进行真空侵染；挑取经转化和鉴定的农杆菌 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl单菌落，分别接种于5 ml含有50 mg /L卡那霉 素，12.5mg/L四环素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28。C过夜培养；次日，按照、1:50的比例将1 ml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，选择006<3()值 范围在1.0-1.2的菌液于常温下4000 rpm， 10分钟离心收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100 乙酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2，、 250 |al Tween20、 pH 5.6的无菌水溶液重悬； 将GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl两种菌体的重悬液1 : 1混合，于室温放置90 分钟后侵染豌豆发芽种子；将侵染后的种子播种于土壤中，8-20天后在紫外灯下观察GFP 的表达情况；设置侵染条件为无伤害处理，菌液浓度OD6o『1.0-1.2，真空压力为0.08MPa， 真空时间为1分钟；侵染后12-14天绿色荧光蛋白表达量最大，为外源蛋白收获的最佳时间； 2).以发芽种子真空侵染法在豌豆植株中表达人源酸性成纤维细胞生长因子 对pCAPE2载体进行改造，通过PCR方法在原载体上引入BglII酶切位点，根据/^FGF 序列设计引物，正义引物5'-GGAAGATCTACATGGCTAATTACAAGAAGCC-3'反义引物 5，-CGGAATTCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3，，.经PCR扩增出的片段，PCR 参数94°C 3 min; 94°C 35 sec, 54°C 30 see, 72°C 1 min共30个循环；72°C ,1 min; 4 °C10 min,双酶切后将aFGF片段连入pCAPE2得到目的载体pCAPE2-aFGF，将其转入农杆菌 GV3101中，挑取经鉴定的农杆菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl单菌落，分别 接种于5 ml含有50 mg /L卡那霉素，12.5 mg/L四环素和50 mg/L利福平的LB液体培养基 中，28。C过夜培养；次日，按照l:50的比例将lml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的 LB液体培养基中，选择OD6oo值范围在1.0-1.2的菌液于常温下4000 rpm， 10分钟离心收集 菌体，菌体沉淀用含有终浓度100 pM乙酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2,、 250 pl Tween20、 pH 5.6的无菌水溶液重悬；将GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl两种菌 体的重悬液1 : 1混合，于室温放置90分钟后侵染根长2-3厘米的豌豆发芽种子，设置侵染 条件为无伤害处理，菌液浓度OD6Q(rl.0-1.2、真空压力为0.08MPa、真空时间为1分钟；将 侵染后的种子播种于土壤中，并以l)中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因建立和优化发芽 种子真空侵染瞬时表达体系为参照依据，于侵染后12-14天的最佳时间收获外源蛋白。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及在豌豆中瞬时表达外源蛋白的发芽种子真空侵染法 首先，建立发芽种子真空侵染法并进行优化，选择根长2-3厘米的豌豆种子为侵染材料，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因对真空时间、真空压力及菌液浓度进行优化得到表达外源蛋白的最适条件。然后进行人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建，将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列连入改造的植物病毒表达载体，转入农杆菌GV3101中用于在植物中瞬时表达。在最佳条件下侵染豌豆发芽种子，侵染后12-14天收获外源蛋白。本发明周期短、易操作、成本低、无污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬时表达外源蛋白。
文档编号C12N15/83GK101457236SQ20081005144
公开日2009年6月17日 申请日期2008年11月20日 优先权日2008年11月20日
发明者朱筱娟, 伟 李, 王兴智, 范亚军 申请人:东北师范大学