专利名称：：一种抑制bax基因表达的siRNA序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及siRNA双链序列，具体为一种抑制bax基因表达的siRNA序列。技术背景RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。它已在许多不同种属的生物体中被发现，并在生物体细胞之间进行传递，具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用。RNAi技术不仅能大大推进人类后基因组计划的发展，还能高通量地筛选药物耙基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新的途径。RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，将对医学生物学的发展产生深远的影响。虽然RNA干扰技术的研究历程较短，但其发展速度却超乎人们的想象。在过去的几年时间里RNAi作为一种新基因疗法被广泛的应用于病毒感染、癌症、显性遗传病等医学研究中，开辟了"基因治疗(gene-specifictherapeutics)"的新理念，小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)甚至被称为"治病药物"。目前，人们已经开始利用RNAi技术从基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因，使我们可以更好地研究生物体内基因调控的网络系统，现在RNAi技术已经能够成功治愈哺乳动物细胞、器官及活体的病变，预示着不久的将来，RNAi会成功用于人类疾病的治疗，使得siRNA的"治病药物"的称号名副其实。公知，人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。目前的研究认为，细胞坏死是细胞接受剌激后的一种被动的细胞死亡方式，而细胞凋亡则是一种主动的程序性的细胞死亡方式，它是细胞的一种基本生物学现象，细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bd-2基因家族、caspase基因家族、癌基因等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚，而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如神经退行性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等。如果能应用RNA干扰技术特异性地阻抑凋亡相关基因的表达及其蛋白质水平，将可以有效沉默凋亡相关基因，帮助细胞减少凋亡，增进细胞活力。因此，对凋亡相关基因的RNA干扰的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，能有效地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗神经退行性疾病等与细胞凋亡相关的疾病开辟新的途径。使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰RNA(siRNA)，然后通过某种方式将siRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的。其优势在于只抑制疾病相关蛋白的表达，而不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。siRNA可用于治疗任何由于基因发生突变或过度表达引起的疾病，只要确定了与疾病相关的靶点，即靶基因，就可以通过siRNA特异性地使靶基因沉默，所以寻找最适宜的siRNA序列，对于RNA干扰的广泛应用至关重要。bcl-2基因家族是一类基因结构相似并参与细胞凋亡的一组基因，根据它们对细胞凋亡结果的不同分为两类，一类是抑制细胞凋亡的基因，如bcl-2，bcl-xl,mcll，bfel，al等，另一类是促进细胞凋亡基因，如bax,bak，bok，bcl-xs，bik等，己有大量的研究提示，此蛋白质家族主要通过调节线粒体膜电位的变化，影响线粒体膜的通透性，进而改变线粒体蛋白的释放，调控细胞凋亡。其中bax基因的过度表达能加速细胞发生凋亡，并对抗bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，从而促进细胞凋亡，因此对baxRNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义。但是作用于bax基因，即耙基因不同位点的siRNA的作用效果差异很大，可能与siRNA的碱基分布、两端自由能大小等有关，在siRNA沉默特定基因的实验中，为保证siRNA能有效降解靶基因，一般需要针对靶基因设计合成多条不同序列的siRNA，再从中筛选出有效序列，所以有效siRNA序列的设计筛选是该技术的关键点，到目前为止，还没有最适宜的抑制bax基因表达的siRNA序列。
发明内容本发明为了解决现有技术中还没有最适宜的抑制bax基因表达的siRNA序列的问题，提供一种抑制bax基因表达的siRNA序列。本发明是采用如下技术方案实现的一种抑制bax基因表达的siRNA序列，该序列为下述序列中的任意一条或一条以上siRNAl:反义链5，一UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg—3，正义链5，—GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt—3，；siRNA2:反义链5，一UCCACGUCAGCAAUCAUCCtc—3，正义链5，—GGAUGAUUGCUGACGUGGAtt—3，；siRNA3:反义链5，一CUUCUUGGUGGAUGCAUCCtg—3，正义链5，一GGAUGCAUCCACCAAGAAGtt—3，。上述序列中，最适宜的用于抑制bax基因表达的siRNA序列为siRNAl:siRNAl:反义链5，一UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg—3，正义链5'—GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt—3，。本发明所提供的抑制bax基因表达的siRNA由正义链和反义链组成，它的正义链和反义链中序列的自5'端的第1至第19位核苷酸均为核糖核苷酸，第20至第21位的核苷酸均为脱氧核糖核苷酸。序列表中的序列均由21个核苷酸组成，序列的方向从左至右均为5'端至3'端。本发明针对bax基因序列设计合成一组siRNA，筛选出三对baxsiRNA(siRNAl、siRNA2、siRNA3)，经QRT-PCR及免疫组织化学法检测，可以有效抑制bax基因表达，从而显著降低bax蛋白水平的表达，并在神经胶质细胞瘤细胞上验证了设计合成并筛选出的baxsiRNA对神经胶质瘤细胞的抑制作用，其中以baxsiRNAl效果最佳。本发明所提供的baxsiRNA序列不但可以用于体外培养细胞的RNAi，也可以用于体内实验。本发明所提供的siRNA双链序列可用于制备与bax基因相关疾病的治疗药物，如细胞凋亡相关疾病或退行性疾病的药物。该siRNA双链序列或由此得到的药物通过某种方式进入到动物体或人体内时，可以比以往任何手段更高效、特异、方便的抑制疾病相关蛋白的表达，使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的，其优势在于不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。本发明筛选出能高效抑制bax基因表达的siRNA序列，能对耙基因的表达进行有效敲除。图1为baxsiRNA转染细胞的光镜照片图2为baxsiRNA转染并经DAPI染核后细胞的荧光照片图3为baxsiRNA转染并经Cy3荧光标记后转染成功的细胞的荧光照片图4为baxsiRNAl在不同转染剂量下转染72h后对染铝细胞活力的影响图5为baxsiRNA2在不同转染剂量下转染72h后对染铝细胞活力的影响图6为baxsiRNA3在不同转染剂量下转染72h后对染铝细胞活力的影响图7为三对baxsiRNA以高剂量转染24h后对染铝细胞活力的影响图8为三对baxsiRNA以高剂量转染48h后对染铝细胞活力的影响图9为三对baxsiRNA以高剂量转染72h后对染铝细胞活力的影响图10为三对siRNA序列抑制bax基因表达扩增曲线图11为三对siRNA序列抑制(3-actin基因表达扩增曲线图12为QRT-PCR检测siRNA转染对bax基因表达抑制率图13为baxsiRNA在20mM染铝组细胞转染后的bax蛋白表达光镜图(X200)图14为baxsiRNAl在20mM铝+低剂量RNAi组转染后的bax蛋白表达光镜图(X200)图15为baxsiRNAl在20mM铝+中剂量RNAi组转染后的bax蛋白表达光镜图(X200)图16为baxsiRNAl在20mM铝+高剂量RNAi组转染后的bax蛋白表达光镜图(X200)图17为baxsiRNA体外转染后bax蛋白表达量检测示意图具体实施方式实施例l:抑制bax基因表达的siRNA的合成用Ambion公司在网上提供的免费软件(htto:〃www.ambion.com/)，根据Reynolds的原则编写了siRNA的预测程序。从http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/上获得bax的cDNA序列(GenBANK号NM—001188)，然后使用预测程序预测siRNA。在对比预测siRNA序列的结果之上，选择一些siRNA。对这些选定的siRNA的两条链都进行Blast搜索(数据库选用NBCI的nr数据库)，在搜索结果中随机选定抑制bax基因表达的三条siRNA序列，即siRNAl、siRNA2、siRNA3，选用一条随机序列作为阴性对照。baxsiRNA序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。baxsiRNA序列及阴性对照均购自美国Ambion公司，合成的三对siRNA如下siRNAl:反义链5'—UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg—3，正义链5'—GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt—3，；siRNA2:反义链5，—UCCACGUCAGCAAUCAUCCtc—3，正义链5，一GGAUGAUUGCUGACGUGGAtt—3，；siRNA3:反义链5，—CUUCUUGGUGGAUGCAUCCtg—3，正义链5，-GGAUGCAUCCACCAAGAAGtt—3'。实施例2:baxsiRNA的最佳序列筛选及最佳转染剂量和转染时间选择使用Ambkm公司的转染试剂进行转染，所有操作均按Ambkm公司提供的操作规程。具体步骤为将实施例1所得到的三对baxsiRNA粉末分别溶于RNAase-free无菌水中，配成终浓度为20pmOl/L的浓縮液，使用时稀释为2拜ol/L的应用液。将神经胶质细胞瘤细胞接种于6孔培养板中(300,000个细胞/孔)，用含10。/。胎牛血清的DMEM培养液培养24小时后，将细胞培养液换为含5%胎牛血清的DMEM培养液。转染时，分别将0，2.5，5,7.5^1siRNA溶液(2|omol/L的baxsiRNA或2nmol/L的阴性对照)和0,2.5,5,7.5(^1的转染试剂溶液分别稀释于250jil无血清培养液中(Opti-MEM)中，并在室温下孵育10分钟后，然后将上述siRNA和转染试剂混合，复合物于室温孵育10分钟，加入细胞混悬液(细胞融合度为50%70%)，37°C5。/。C02孵育，分别于转染后24，48，72h收集细胞进行细胞活力检测。检测步骤为取对数生长期SH-SY5Y细胞，制成1.5xl()S个/ml起始浓度细胞悬液，加到96孔细胞培养板(Coming公司)上，每孔加100^1，设2pmol/L阴性对照组，siRNAl组，siRNA2组，siRNA3组，每组5L。每个siRNA转染组依据转染试剂的浓度(10，20，30nmol/L)分为低、中、高转染剂量组，每组5孔。按分组在转染后，吸去上清，加入5^1CCK-8试剂及100nl新鲜细胞培养液，37。C孵育4小时，450nm酶标仪读取吸光度值。细胞抑制率=(实验组吸光度值/对照组吸光度值一l)xl00%。图1、图2、图3中显示了baxsiRNA转染细胞的光镜及荧光照片，DAPI染核进一步清晰显示了转染的细胞，Cy3荧光标记后转染成功的细胞，计数细胞数量并计算转染效率，转染效率的计算公式为转染效率-Cy3荧光标记的细胞数量/相同视野下DAPI染色的细胞数量xlOOM。结果表明，转染细胞数多于细胞总数的90%。说明三对baxsiRNA序列的转染效率均大于90%。图4、图5、图6分别显示了三对baxsiRNA转染后的细胞活力，选取图中20mM染铝细胞转染后48h的原始数据计算其抑制率，结果见表1，数据表明，siRNAl、siRNA2、siRNA3在高剂量转染时的细胞活力抑制率高于中、低转染剂量组，说明高剂量组转染是baxsiRNA转染的最佳转染剂量。图7、图8、图9显示了baxsiRNA的不同序列在转染后不同时间对细胞活力的影响，分别计算不同时间点20mM染铝细胞的高剂量组转染后细胞活力抑制率，具体结果见表2，数据显示，baxsiRNAl在转染后72h对20mM染铝细胞的细胞活力抑制率显著高于48h和24h的抑制率，而且也高于siRNA2和siRNA3的抑制率(P<0.05)。提示baxsiRNA转染的最佳序列为siRNAl，最适转染剂量为高剂量组(30nM)，最佳检测点为转染后72h。表1不同对siRNA序列及不同的转染剂量对20mM染铝细胞转染后48h的细胞活力抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*:与低剂量组和中剂量组相比有显著性差异，P<0.05tt:与siRNA3组相比有显著性差异，P<0.05表2不同时间点20mM染铝细胞的高剂量组转染后细胞活力抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*:与24h组和48h组相比有显著性差异，P<0.05与siRNA2和siRNA3组相比有显著性差异，P<0.05实施例3:baxsiRNA抑制神经胶质瘤细胞bax基因表达效率检测及最佳序列筛选使用Ambion公司的转染试剂进行转染，转染后的72小时进行转染效率的检测。所有操作均按Ambion公司提供的操作规程，具体步骤为将实施例1所得到的baxsiRNA及阴性对照粉末分别溶于RNase-free无菌水中，配成终浓度为20Kimol/L的浓縮液，使用时稀释为2pmol/L的应用液。将神经胶质瘤细胞接种于6孔培养板中(300,000个细胞/孔)，用含10。/。胎牛血清的DMEM培养液培养24小时后，将细胞培养液换为含5%胎牛血清的DMEM培养液。转染时，分别将5ji1siRNA溶液(2nmol/L的bax-siRNA或2pmol/L的阴性对照siRNA)和5^1的转染试剂溶液分别稀释于25(^1无血清培养液中(Opti-MEM)中，并在室温下孵育10分钟后，然后将上述siRNA和转染试剂混合，复合物于室温孵育10分钟，加入细胞混悬液(细胞融合度为50°/。70%)，37"C培养48小时，收集细胞进行mRNA表达水平检测。用反转录试剂将mRNA反转录为cDNA，用荧光定量PCR法检测bak基因的表达。具体检测步骤为按分组在转染后，吸去上清，加入胰酶消化并收集细胞。用Trizol法抽提细胞的mRNA，具体步骤为收集细胞悬液，1500rpm离心10min，弃上清。加入60(HdTrizol混匀，室温放置20min。加入0.12ml氯仿,充分振摇15s至乳白色。室温静置3min，12,000rpm4。C离心15min。取上清，加入300^1异丙醇，室温静置10min。12，000rpm4。C离心10min。弃上清，加入600W75%乙醇，混匀，7500rpm4。C离心5min，弃上清，室温开盖放置30min，加入RNase-free无菌水50ial，1:1000稀释于260nm及280nm处测定其吸光度值，计算mRNA的纯度及含量。计算公式为mRNA纯度-A26o/(A28。一本底)，mRNA含量0ig/ml"A26()X40x100。如mRNA纯度>1.8，则进一步进行反转录。加入10xRT缓冲液2^1，dNTP混合液(2.5mM)4pl，01igo-dT引物(10nM)2pl,RNase抑制齐U(10U4d)ljxl，QuantReverseTranscriptase1^1，RNase画free无菌水4jxl，模板RNA6pl,充分混匀,37'C孵育60min。取扩增后的cDNA产物3pl,加入上、下游引物各lpl，2xPCRmaster12.5pl及RNase-free无菌水7.5jal,混匀，短暂离心。扩增条件为:94°C5min，94。C50s,57。C50s，72。Clmin,35循环to2,72°C5min。QRT-PCR检测三对siRNA序列转染抑制bax基因表达扩增曲线见图10，图11为三对siRNA序列抑制j3-actin基因表达扩增曲线，三对siRNA序列转染对bax基因表达抑制率的具体结果见图12。结果表明，siRNAl,siRNA2，siRNA3的抑制率分别为62.3%,53.21%,50.13%。根据不同对siRNA对bax基因的抑制率可知，siRNAl的抑制率高于其余两组，优选siRNAl。实施例4:免疫组织化学法检测Bax蛋白的表达量各组细胞以1.5xl()S个/ml起始浓度细胞悬液接种于6孔培养板，内置一块1.5cmxl.5cm细胞培养用盖玻片，按上述培养方法转染后，继续培养48h，弃上清，4。/。多聚甲醛固定30min，0.01MPBS漂洗。用3%压02-甲醇溶液室温孵育510min,以封闭内源性过氧化物酶；O.OIMPBST漂洗，5minx3;510%正常山羊血清封闭，室温孵育30min;倾去血清勿洗，加15^BSA稀释的一抗，4°C过夜；0.01MPBST漂洗，5minx3;加HRP标记的二抗室温孵育lh;力卩0.01XH2O20.05XDAB显色；经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。baxsiRNA转染对Bax蛋白表达的影响见图13、14、15、16。baxsiRNA的转染抑制Bax蛋白表达量具体结果见图17。由图13、14、15、16可见，20mM染铝组神经胶质瘤细胞中Bax蛋白的表达量最高，细胞的形态不整，细胞膜破裂，细胞突触减少，20mM染铝神经胶质瘤细胞用低、中、高剂量RNAi组神经胶质瘤细胞的形态随RNA干扰剂量的增高，Bax的蛋白表达量逐渐减少，细胞的形态逐渐恢复正常。图17为软件分析细胞的光密度值所做的柱形图，其结果与形态学的观察结果相一致，显示了各组蛋白表达量的差异，说明BaxsiRNA体外转染后可以显著降低Bax蛋白的表达。综上所述，本发明所述siRNA序列可以有效抑制bax基因表达，从而显著降低Bax蛋白的表达。本发明所提供的siRNA序列不但可以用于体外培养细胞的RNAi，也可以用于体内实验。此外，本发明所提供的siRNA可以提供一种抑制神经细胞凋亡的药物，也可以用于制备治疗神经退行性疾病的药物。SEQUENCELISTING<110>山西医科大学<120>—种抑制bax基因表达的siRNA序列<160>6<170>Patentinversion3.2<210>1<211>21<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNAl序列的反义链<400>1Ucgauccuggaugaaaccctg21<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNAl序列的正义链<400>2ggguuucauccaggaucgatt21<210>3<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNA2序列的反义链<400>3uccacgucagcaaucaucctc21<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNA2序列的正义链<>4ggaugauugcugacguggatt21<210>5<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220〉<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNA3序列的反义链<■>5<210>6<211>21<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bax基因为靶标的siRNA3序列的正义链<400>6ggaugcauccaccaagaagtt2权利要求1、一种抑制Bax基因表达的siRNA序列，其特征是该序列为下述序列中的任意一条或一条以上siRNA1反义链5’-UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg-3’正义链5’-GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt-3’；siRNA2反义链5’-UCCACGUCAGCAAUCAUCCtc-3’正义链5’-GGAUGAUUGCUGACGUGGAtt-3’；siRNA3反义链5’-CUUCUUGGUGGAUGCAUCCtg-3’正义链5’-GGAUGCAUCCACCAAGAAGtt-3’。2、根据权利要求1所述的一种抑制Bax基因表达的siRNA序列，其特征是该序列为siRNAl:反义链5，一UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg—3，正义链5，一GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt—3，。全文摘要本发明涉及siRNA双链序列，具体为一种抑制bax基因表达的siRNA序列，解决现有技术中没有最适宜的抑制bax基因表达的siRNA序列的问题，该序列为siRNA1反义链5’-UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg-3’正义链5’-GGGUUUCAUCCAGGAUCGAtt-3’；本发明所提供的siRNA双链序列可用于制备抑制神经细胞凋亡或治疗神经退行性疾病的药物。该siRNA双链序列通过某种方式进入到生物体内时，比任何手段更高效、特异的抑制疾病相关蛋白的表达，使有关疾病基因发生沉默，能对靶基因的表达进行有效敲除，达到治疗目的，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。文档编号C12N15/11GK101255422SQ20081005450公开日2008年9月3日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者张勤丽,侨牛申请人:山西医科大学