专利名称：：具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用，属生物农药
技术领域：
。
背景技术：
：松材线虫(Sw^a//2e/e"c/zz^j^/o;/2z7^)原产北美，是中国重要的外来入侵种(alieninvasivespecies),由它引起的松材线虫病对中国森林构成了严重的威胁。松材线虫病又称松树萎蔫病，是由松材线虫寄生在松树体内导致松树木质部组织细胞受到破坏，水分输导受阻，呼吸作用加强，树脂分泌减少直至最后停止，蒸腾作用减弱至松树迅速死亡。松材线虫病被称为松树的癌症，是松树的一种毁灭性病虫害，通常感病后40天左右即可造成松树枯死，35年可摧毁成片松林，被列为重要的危害性森林病害。中国大陆于1982年在南京中山陵的黑松上首次发现松材线虫病，当时仅在1省1市1区发生，发生面积200hm2，病死树仅256株。在短短20多年的时间里，疫区范围大大地扩大了。据国家林业局在2006年2月的报告，疫区发生省市为江苏、浙江、安徽、江西、山东、湖北、湖南、广东、重庆、云南、贵州等ll个省、直辖市的95个县、区、市，2005年发生面积达7.7万hm2，当年致死松树154万多株。松材线虫病的迅速扩散漫延，给我国的森林资源及生态环境、自然景观造成严重破坏，并对广大适生区的森林构成严重威胁。目前国内外对松材线虫尚无有效的药剂及防治方法，一些对植物寄生根结线虫和胞囊线虫有效的生物制剂，对松材线虫则根本没有活性。寻找对松材线虫有效的防治方法和药剂，已经迫在眉睫。在国内外专利文献报道中，均未涉及化合物CerebrosideA和CerebrosideB杀松材线虫的活性报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有毒杀松材线虫活性的化合物。为实现上述目的，本发明提供的具有毒杀松材线虫活性的化合物，由拟青霉菌(P^cz7om;;cM)，采用固体发酵及提取分离的方法获得；该化合物的结构式为HOH2S式中R的结构式如A或B所示oAR=B所述的化合物，其中，A式和B式的物化常数如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmax3279(br)，2955,2921,2851，1640，1534，AC41H75N09725，1467,1084cm'1BC4IH77N097273285(br),2955,2920，2851，1650，1542,1467，1079cm"本发明的化合物可应用于松材线虫农药制剂。具体实施例方式本发明在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，发现了拟青霉菌(/^e"7om^")的大米发酵液具有杀松材线虫活性，通过活性跟踪，进一步分离纯化，得到了具有杀线虫活性的两种化合物CerebrosideA和CerebrosideB。与专利文献报道的其它类杀松材线虫化合物相比，CerebrosideA具有很好的杀松材线虫活性，而CerebrosideB具有弱的杀松材线虫活性。本发明的生产菌株为拟青霉菌(尸ae"7omyc")，该菌已于2007年12月27日保藏在中国科学院微生物所，保藏号为AS6.34。本发明的具有毒杀松材线虫活性的化合物是从生产菌株的固体发酵培养物中提取分离得到的化合物CerebrosideA和CerebrosideB，其结构式为H，OHN'ROHOH在化合物CerebrosideA中，结构式中的R为o2<化合物CerebrosideB中，结构式中的R为o本发明的该类活性化合物的物化常数、氢谱和碳谱数据分别见表1和表l.化合物A和B的物化常数分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09BC41H77N097257273279(br),2955，2921,2851，1640,1534,1467,1084cm-13285(br),2955,2920,2851,1650,1542,1467,1079cm-'表2.化合物A和B的氢谱和碳谱数据_^_positioni5Ha(mult.,>/hh)5cbla4.15,dd(10,5,2)69.7，CH2l卩3.71,dd(10，3.4)23.98,m54.6,CHB4.14,dd(10,5,2)69.7,CH23.72,dd(10，3.4)3.99，m54.6,CH<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中，在处理时间为24小时，化合物A和B对松材线虫的LCso分别为49.4pg/ml和543.8iig/ml。可见化合物A具有很好的杀松材线虫活性，而化合物B具有弱的杀松材线虫活性。其中化合物A可单独或组合用于制备农药制剂，化合物B也可组合用于制备农药制剂。因此，本发明的化合物可作为制备农药杀线剂应用。下面列举实施例作详细说明。实施例1化合物A和B的分离制备a)真菌拟青霉菌(Paec/fomyc^)的活化PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25。C培养7天；b)真菌拟青霉菌(尸m"7o^;cm)的固体发酵培养大米培养基(制备过程为将100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用)。将制备好的菌悬液(孢子浓度为1x1C)S个/mL)5mL接种于大米培养基上，25。C培养40天；c)待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物。d)将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析。e)在活性跟踪指导下，将活性组分(乙酸乙酯甲醇=10:1)通过Sephdex-LH20分离，将活性馏份通过HPLC制备得到化合物A和B。实施例2采用液体浸泡法检测本发明的化合物的抗线虫活性的试验1)试验用药剂将2mg供试样品先溶于1OOpL有机试剂丙酮中，再用纯水稀释成2000pg/mL、200^g/mL和20;/g/mL浓度的供试药液。2)松材线虫的培养与制备在PDA平板培养基上接种灰霉即葡萄孢菌于25。C下培养4-5天，灰霉基本长满平皿；将松材线虫(Swwfl;/^/enc/n^;qy/o;/H7z^)接种到长满灰霉的PDA平皿中，在25"C条件下培养1周；待线虫将菌落吃完，用贝曼浅盘法收集线虫(即将培养好线虫的PDA培养基用解剖刀切成块，放入8层纱布中，将纱布包好，放入带胶管的直径为20cm的漏斗中，加入无菌水，静置后收集)；将收集到的线虫液离心去上清，在显微镜下用无菌纯水将线虫液调整到合适的浓度，立即使用。3)试验方法取100//L本发现的化合物药液(浓度分别为2000^g/mL、200^g/mL禾口20/^g/mL)加入到24孔板中，再加入100/^L松材线虫(30-50条)悬液，使供试样品的最终浓度分别为1000pg/mL、100//g/mL和10^g/mL，待药液和线虫液混和均匀，将培养板放置于25。C的培养间中，于黑暗条件下培养24小时后在倒置显微镜下计数活、死线虫数目。线虫死亡率。/^死线虫数/总线虫数x100。/。将含5%丙酮的水溶液作为对照，实验三次重复，取三次的死亡率计算出平均死亡率。4)试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明本发明的化合物A具有很好的杀松材线虫活性，而化合物B具有弱的杀松材线虫活性。其中化合物A可单独或组合用于制备农药制剂，化合物B也可组合用于制备农药制剂。权利要求1、一种具有毒杀松材线虫活性的化合物，由拟青霉菌(Paecilomyces)，采用固体发酵及提取分离的方法获得；该化合物的结构式为式中R的结构式如A或B所示2、如权利要求1所述的化合物，其中，A式和B式的物化常数如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09725BC41H77N097273279(br)，2955,2921，2851,1640，1534,1467,1084cm"3285(br)，2955,2920，2851，1650,1542,1467,1079cm-i3、权利要求l所述的化合物用作松材线虫农药制剂的应用。全文摘要本发明涉及一种具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用，该化合物，由生产菌株，采用固体发酵及提取分离的方法获得。其生产菌株为拟青霉菌(Paecilomyces)，该菌已于2007年12月27日保藏在中国科学院微生物所，保藏号为AS6.34。本发明的该类活性化合物由CerebrosideA和CerebrosideB两种化合物组成。本发明的该类化合物，能有效的毒杀松材线虫，可单独或组合制备毒杀松材线虫农药的应用。文档编号C12P13/02GK101481712SQ20081005578公开日2009年7月15日申请日期2008年1月9日优先权日2008年1月9日发明者刘杏忠,刘述春,向梅春,张永刚,车永胜申请人:中国科学院微生物研究所