专利名称：：转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法
技术领域：
：本发明涉及一种重要花卉植物的抗病性育种技术方法，尤其是整合了来源不同的两种基因对非洲菊进行遗传转化，从根本上解决了非洲菊主栽地区真菌病害危害严重的难题。本技术属于生物技术育种领域。
背景技术：
：非洲菊("/^eraj'a历eso/7力'Bolus)，又名扶郎花，为菊科菊木族大丁草属多年生宿根草本花卉，世界著名五大鲜切花之一，起源于南非德兰士瓦地区。非洲菊约有42个种，主要分布于南非、马达加斯加、印度、中国、蒙古、日本、南美和澳大利亚，因其花色丰富、形态优美，深受世界人民喜爱。如今，非洲菊已成为重要的贸易商品，并与月季、菊花、康乃馨和郁金香成为世界著名的观赏植物种类。全世界30国家和地区广泛栽培，国内十多个省市均有栽培，面积约为800公顷，云南栽培面积为296公顷。随着非洲菊种植面积的扩大，真菌病害在其主要种植区均有普遍发生，且危害日趋严重，昆明地区一般发病率为10%-30%，重者达70%-80%。其中较为明显的有白粉病、斑点病、疫病、根腐病等，真菌病害发生严重影响了非洲菊鲜切花的产量及品质。由于污染环境、成本高、成效有限等因素，物理或化学土壤灭菌和使用内吸杀菌剂均不能满足花卉生产的要求。转基因育种技术的发展为其提供了新的解决途径。真菌细胞壁主要由几丁质和e-i,3-葡聚糖组成，几丁质存在于真菌细胞壁的内部，葡聚糖则在细胞内、外部均有，内部与几丁质形成复合物。通过对几丁质酶基因(Chitinasegene)和P-1，3_葡聚糖酶基因(e-1，3-glucanasegene)在植物中的转化能有效抵抗真菌病害造成的危害。几丁质酶及e-i，3-葡聚糖酶均分为三类，其中I类对真菌具有较强的抑制活性。大量实验证明，几丁质酶与e-i，3-葡聚糖酶具有协同抗真菌作用。此外，获得的转基因植株不仅能有效抵抗真菌病害，对线虫也有一定的抗性。因此，利用基因工程手段创造非洲菊抗真菌病害新品种对解决其真菌病害引起的生产问题有着主要的实际应用意义。
发明内容本发明的目的在于利用生物技术方法创造能有效抵抗真菌病害侵染的非洲菊新品种，以期获得自身高抗真菌病害，同时又不影响观赏价值的新型转基因非洲菊新品种。本发明通过下列技术方案完成一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步骤步骤l，以菜豆、烟草为试材进行Chi基因及Glu基因的分离、克隆及表达载体的构建(1)基因分离与克隆A、Chi基因扩增引物根据菜豆几丁质酶cDNA序列GenBankM13968设计引物如下Pl:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'B、Glu基因扩增引物根据烟草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600设计引物如下P3:5'AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3'P4:5'CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3'C、总RNA的提取及PCR产物扩增分别从菜豆及烟草中提取总RNA,经逆转录酶将RNA逆转录cDNA，并利用逆转录的cDNA在下列反应体系中进行PCR扩增，得所需的Per产物10XPerbuffer2.5uldNTP(2.OmM)2ulMgcl22ulPrimerl(10pmol/ul)lulPrimer2(10pmol/ul)lulTaq酶(lug/ul)0.5ulcDNA(25ng)2ulH20llulD、对Pcr产物补平利用Klenow片段对上述Per产物进行补平反应，其反应体系为Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPer产物70ul反应条件为37°C，lh，得到末端补平DNA产物；E、末端补平DNA产物的去磷酸化利用DNA片段末端碱基去磷酸化试剂盒对上述末端补平DNA产物进行去5'端去磷酸化反应后，回收补平DNA产物及T-载体克隆后，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector;(2)表达载体的构建A、pB-Chi、pB-Glu表达载体的构建分别用Chi/T-Vector和Glu/T-Vector,用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用&c/酶切，1%的电泳检测，回收958bp和940bp的目的片段；同时用577a/的酶切质粒pBI121,该质粒带有启动子CaMV35S，再用fee/酶切，回收载体大片段；T4DNA连接酶分别作载体与目的片段的连接，连接产物分别转化￡coh'DH5a，幼'/7o7Z7双酶切鉴定pB-Chi质粒的阳性克隆，////w/双酶切鉴定pB-Glu质粒的阳性克隆，获得连接方向正确的pB-Chi、pB-Glu表达载体；B、pB-Chi-Glu双价表达载体的构建用^bt^/酶切pB-Chi，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用历'/7o7/膽切后，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系补平，电泳回收2.0kb片段，此片段包括35S-Chi-Nos，然后按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化；用幼'/m7Z7酵切pB-Glu，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，无水酒精沉淀载体，溶解，按步骤l-(1)-E的过程去磷酸化，T4DNA连接酶作载体与目的片段连接，连接产物转化￡c^iDH5a，以尸"/酶切鉴定pB-Chi-Glu的阳性克隆，获得经检测的连接方向与预期目的一致的pB-Chi-Glu双价表达载体质粒；步骤2，非洲菊高效转化再生体系的建立(1)培养非洲菊愈伤组织选择离体培养条件下生长健康的非洲菊单株，以叶柄带有小愈伤组织的叶片为材料，在非洲菊愈伤组织诱导培养基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上进行培养，其培养温度为24士rC，光照为20001x;14-21天后在叶柄基部长出带有绿色生长点的愈伤组织。(2)抗真菌基因对非洲菊的转化A、农杆菌感受态细胞的制备挑取农杆菌LBA4404，接种于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液体培养基中，LB培育基配方如下8g/1的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl，于28°C、200rpm培养过夜；取2ml培养物于相同LB液体培养基中继续培养，至0D600为0.4—0.6，将培养物冰浴30min，4°C、5000rpm离心5min，弃上清，用lml的浓度为20腸1/L的冷CaCl2悬浮，分装成50nl/管，加15%的甘油，液氮中冷冻后-70。C保存，得感受态细胞；B、质粒向农杆菌中的转化把上述制备好的感受态细胞在冰上融化，加入lug质粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速冻5min，37。C水浴35min至完全融化，冰上放置2min，加600ul上述A步骤的LB液体，28。C温度下200rpm恢复培养35h,5000rpm离心35min，收集菌体，留50100ul重悬，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g琼脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28。C培养2天，得根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落板；C、农杆菌对非洲菊愈伤组织(非洲菊小芽)的侵染挑取上述根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落，在含量为5080mg/LRif的下列LB培养基即8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl屮5080mg/L的Km+510mg/L的Rif中，震荡培养过夜，得活化菌液，用该活化菌液对步骤2—(1)的非洲菊愈伤组织进行侵染，侵染8-10min，转入Ms培养基中，黑暗下培养2天，得到侵染的非洲菊愈伤组织；D、转化植株的抗生素筛选:将上述侵染植株转到选择培养基即Ms+O.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50_80mg/L的Rif中，于28'C培养14天，分化出的正常非洲菊转化苗，转入分化培养基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT中，于28。C筛选培养20天，筛选出的生长正常的非洲菊株系在步骤三的继代培养基上进行扩繁，得经抗生素筛选的转基因阳性植株。所述步骤l-(1)-C的PCR扩增反应条件为Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s，Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此进行35个循环；72°C10min，反应结束即得所需的Per产物。所述步骤1-(1)-E去磷酸化反应按照DNA片段末端碱基去磷酸化试剂盒说明书进行1)在微量离心管中配制下列去磷酸化反应液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul补平DNA片段42.5ul2)65'C保温30分钟后，加入50p1的灭菌蒸馏水，补充体积至IOOyl;3)加入lOOul的下列混合物苯酚氯仿异戊醇=25:24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；重复本步骤一次；4)加入lOOyl的下列混合物氯仿异戊醇=24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；5)加入10u1pH为5.2的3MCH3C00Na(乙酸钠)，混合均匀；6)加入4n1的DNAmate溶液，混合均匀；7)加入250nl-2(TC的无水乙醇，充分混匀；8)离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀释。所述步骤1-(1)-E对补平DNA产物的回收按照胶回收试剂盒说明书进行；T-载体克隆按照pMD18-TVectorKit说明书进行，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector,之后再用5鹏/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector,分别切出329bp、690bp片段的克隆即为阳性正向克隆，对正向克隆作进一步的DNA序列测定。本发明选用的材料为(1)菌种和质粒PMD18-Tvector,大肠杆菌DH5a，表达载体pBI121，农杆菌LBA4404;(2)植物材料普通菜豆(户A"^omvw/g"r红)、烟草(7V/co"》"fltoZwcww)、非洲菊品种'红帽子'；(3)供试菌种隐地疫霉(,Ar"o力"orac/T/^^es)及恶疫霉(户/u^^力^wra(4)主要化学试剂乙烯、SDS(十二垸基硫酸钠)、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、逆转录酶及其Buffer、0ligdtu。)、T4连接酶及其Buffer、质粒片断提取试剂盒、胶回收试剂盒、Km(卡那霉素)、Amp(氨苄青霉素)、Cb(羧苄青霉素)、Rif(利福平)、Pcr扩增引物、Taq酶及其buffer、dNTP、DL2000Marker、限制性内切酶及其Buffer、Klenow片段及其Buffer等；本发明具有以下的优点及效果1、构建以pBI121表达载体为的Chi-Glu双价表达载体，为今后构建相应的双价表达载体研究工作提供了思路及研究基础；2、建立以'红帽子'品种为代表的非洲菊高效再生转化体系，经Per检测结果表明，转化率达8%。该项工作的完成为后续开展的非洲菊转基因工作提供了较为丰富的经验及工作基础；3、对非洲菊真菌病害低抗品种进行了Chi-Glu基因的转化，有效提高其协同抗真菌作用，与同期接种对照株系相比，疫霉根腐病发病程度明显降低，表明转基因株系能有效抵抗由隐地疫霉(尸力/top/t/orac/Tpfogea)及恶疫霉(/^ytop/^/oraca"fW7;/n)引起的非洲菊真菌病害，降低了非洲菊栽培管理中的成本，对实际种植生产有实际意义。具体的实施方式为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。步骤l，以菜豆、烟草为试材进行Chi基因及Glu基因的分离、克隆及表达载体的构建(1)基因的分离与克隆A、Chi基因扩增引物根据菜豆几丁质酶cDNA序列GenBankM13968设计引物如下:P1:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'B、Glu基因扩增引物根据烟草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600设计引物如下P3:5'AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3'P4:5'CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3'以上2对引物由北京奥克生物公司合成；C、总RNA的提取及PCR产物扩增按照常规Tizol法分别从乙烯利诱导四叶期菜豆及接种TMV幼苗期烟草中提取总RNA,用ReverTraAce逆转录酶将RNA逆转录cDNA，并利用逆转录的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为lOXPcrbuffer2.5uld證(2.0mM)2ulMgcl22ulPrimerl(10pmol/ul)lulPrimer2(10pmol/ul)lulTaq酶(lug/ul)0.5ulc腿(25ng)2ulH20llul反应条件为Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s，Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此进行35个循环；72°C10min，反应结束后，获得所需的Per产物；D、对Pcr产物补平利用Klenow片段对上述Pcr产物进行补平反应，其反应体系为-Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPer产物70ul反应条件为37'C,lh，得到末端补平DNA产物；E、末端补平DNA产物的去磷酸化利用DNA片段末端碱基去磷酸化试剂盒对上述末端补平DNA进行去5'端去磷酸化反应，其过程为1)在微量离心管中配制下列去磷酸化反应液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul补平DNA片段42.5ul2)65。C保温30分钟后，加入50ii1的灭菌蒸馏水，补充体积至100u1;3)加入100wl的下列混合物苯酚氯仿异戊醇=25:24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；重复本步骤一次；4)加入100nl的下列混合物氯仿异戊醇=24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；5)加入10u1pH为5.2的3MCH3C00Na(乙酸钠)，混合均匀；6)加入4u1的DNAmate溶液，混合均匀；7)加入250ul-2(TC的无水乙醇，充分混匀；8)离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀释；补平DNA产物回收及T-载体克隆目的DNA片段的回收按照胶回收试剂盒说明书进行；T-载体克隆按照pMD18-TVectorKit说明书进行，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector;T-载体克隆的酶切鉴定和序列测定用Sza/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector，分别切出329bp、690bp片段的克隆即为阳性正向克隆，对正向克隆送北京奥克生物公司作进一步的DNA序列测定；(2)表达载体的构建A、pB-Chi、pB-Glu表达载体的构建分别用Chi/T-Vector和Glu/T-Vector，用Klenow片段按步骤1-G)-D的体系对其补平，再用5"ac/酶切，1%的电泳检测，回收958bp和940bp的目的片段；同时用5i/7a/的酶切质粒pBI121，该质粒带有启动子CaMV35S，再用5"ac/酶切，回收载体大片段；T4DNA连接酶分别作载体与目的片段的连接，连接产物分别转化EcoWDH5a，历V7rf/Z/双酶切鉴定pB-Chi质粒的阳性克隆，Za6/Atto/双酶切鉴定pB-Glu质粒的阳性克隆，获得连接方向正确的pB-Chi、pB-Glu表达载体；B、pB-Chi-Glu双价表达载体的构建用化o7/酶切pB-Chi，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用历'/7dffl酶切后，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系补平，电泳回收2.0kb片段，此片段包括35S-Chi-Nos，然后按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化；用HindIII酶切pB-Glu，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，无水酒精沉淀载体，溶解，按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化，T4DNA连接酶作载体与目的片段连接，连接产物转化Eco^DH5a，以户M/酶切鉴定pB-Chi-Glu的阳性克隆，获得经检测的连接方向与预期目的一致的pB-Chi-Glu双价表达载体质粒；步骤2，非洲菊高效转化再生体系的建立(1)培养非洲菊愈伤组织选择离体培养条件下生长健康的非洲菊单株，以叶柄带有小愈伤组织的叶片为材料，在非洲菊愈伤组织诱导培养基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上进行培养，其培养温度为24土rC，光照为20001x;14-21天后在叶柄基部长出带有绿色生长点的愈伤组织。非洲菊抗生素本底试验根据表达载体pBI121的结构组成特性，选择卡那霉素Km为该非洲菊转化材料的筛选抗生素，在步骤三的继代培养基中分别添加20、25、30、40、50tng/1的Km，植入非洲菊愈伤组织块及单株培养14天，经观察含有25mg/l的Km的继代培育基有利于对非洲菊转基因阳性植株进行筛选；(2)抗真菌基因对非洲菊的转化A、农杆菌感受态细胞的制备挑取农杆菌LBA4404，接种于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液体培养基中，LB培育基配方如下细菌培养用胰蛋白胨8g/L+细菌培养用酵母提取粉5g/L+NaCl10g/L;于28°〇、200rpm培养过夜；取2ml培养物于相同LB液体培养基中继续培养，至0D600为0.4—0.6，将培养物冰浴30min，4°C、5000rpm离心5min，弃上清，用lml冷的浓度为20mmol/L的CaCl2悬浮，分装成50ul/管，力卩15%的甘油，液氮中冷冻后-7(TC保存，得感受态细胞；B、质粒向农杆菌中的转化把上述制备好的感受态细胞在冰上融化，加入lug质粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速冻5min，37。C水浴35min至完全融化，冰上放置2min，加600ul与上述A相同的LB液体，28'C温度下200rpm恢复培养35h,5000rpm离心35min，收集菌体，留50100ul重悬，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g琼脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28。C培养2天，得根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落板；C、农杆菌对非洲菊愈伤组织的侵染挑取根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落，在含量为5080mg/LRif的下列LB培养基即8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+5080mg/L的Km+510mg/L的Rif中，震荡培养过夜，得活化菌液，用该活化菌液对步骤2_(1)的非洲菊愈伤组织进行侵染，侵染8-10min，转入Ms培养基中，黑暗下培养2天，得到侵染植株；D、转化植株的抗生素筛选-将上述侵染植株转到选择培养基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50-80mg/L的Rif中，于28。C培养14天，分化出的正常非洲菊转化苗，转入分化培养基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT中，于28。C筛选培养20天，筛选出的生长正常的非洲菊株系在步骤三的继代培养基上进行扩繁，得转基因植株；步骤3，转基因植株的Pcr检测(1)对经抗生素筛选存活的非洲菊植株进行Per检测；转化的非洲菊植株的总DNA的提取在无菌条件下，取转化材料的叶片，置于离心管中，在液氮条件下进行研磨，加入DNA提取缓冲液(lOOmMNaCl，50mMEDTA，0.5%SDS，50mMTris，PH7.4)，混匀，6(TC水浴lh，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，10000rpm离心4min，重复抽提2-3次；取上液水相层，加入2倍体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-2(TC放置。经琼脂糖电泳检测，结果表明获得转化非洲菊植株的总DNA。非洲菊对照植株的总DNA的提取选择未经农杆菌转化的材料，进行DNA的提取，提取方法与转化非洲菊植株的总DNA提取方法相同。经琼脂糖电泳检测，结果表明获得对照材料非洲菊植株的总DNA。总DNA的Per扩增以转化材料中提取的非洲菊总DNA及对照非洲菊DNA为模板，以Chi基因序列为依据设计引物，进行Pcr扩增扩增引物为P1:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'Per反应系统无菌Pcr管中加入10XPcrbuffer2ul4XdNTP(2mM)2ulPrimerl(10pmol/ul)2ulPrimer2(10pmol/ul)2ulTaq酶(lug/ul)lul模板DNA(约25ng)2ulD2H209ul总体积20ul上封石蜡油，按以下程序进行扩增反应条件为94。C预变性4min;94°C30s，64-60°C30s，72°C3min，35个循环；72。C延伸10min。反应结束后，取Pcr产物在1.0y。琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以未经转化的非洲菊'红帽子，DNA的Per产物为阴性对照。(2)转基因植株的抗病性检测a、菌株培养从非洲菊发病株上采集疫霉根腐病发病植株，将新鲜病组织剪取根茎部2cm左右，经过表面清洗接种在V8培养基上，置于24i:暗培养5-7d后，观察有菌丝体产生但无孢子囊，待菌丝长满整个培养基表面后，用皮氏培养液诱导产生孢子囊，将其制备成孢子悬浮液备用；b、材料种植将苗龄相同的鉴定材料栽种在灭过菌的土壤中，每个品种栽种10-20盆，8-10盆用于接种，2-4盆用于对照，放置在温室中种植，温度在19-3(TC之间，待植株生长稳定后即可接种；c、接种方法(土壤接种法)用注射器吸入lml孢子悬浮液灌入植株的根茎部，把接种过的植株放在适温下栽培，每天浇水1次使土壤保持潮湿。D、病情调査接种10d后开始调査发病情况，此时植株表现出萎蔫，叶片呈现紫红色或黑褐色，陆续枯萎，严重时整株枯死。每隔4d调査一次，共调査9次，出现初期病症的记"V"，萎蔫记"V-"，枯死的记"X"，未发病的记为"0"。选择2个转基因阳性株系与对照的接种非洲菊发病株上采集疫霉根腐病测试结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1、一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步骤步骤1，以菜豆、烟草为试材进行Chi基因及Glu基因的分离、克隆及表达载体的构建(1)基因分离与克隆A、Chi基因扩增引物根据菜豆几丁质酶cDNA序列GenBankM13968设计引物如下P15’GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3’P25’CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3’B、Glu基因扩增引物根据烟草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600设计引物如下P35’AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3’P45’CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3’C、总RNA的提取及PCR产物扩增分别从菜豆及烟草中提取总RNA，经逆转录酶将RNA逆转录cDNA，并利用逆转录的cDNA在下列反应体系中进行PCR扩增，得所需的Pcr产物10×Pcrbuffer2.5uldNTP(2.0mM)2ulMgCl22ulPrimerl(10pmol/ul)1ulPrimer2(10pmol/ul)1ulTaq酶(1ug/ul)0.5ulcDNA(25ng)2ulH2O11ulD、对Pcr产物补平利用Klenow片段对上述Pcr产物进行补平反应，其反应体系为Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPcr产物70ul反应条件为37℃，1h，得到末端补平DNA产物；E、末端补平DNA产物的去磷酸化对上述末端补平DNA产物进行去5’端去磷酸化反应后，回收补平DNA产物及T-载体克隆后，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector；(2)表达载体的构建A、pB-Chi、pB-Glu表达载体的构建分别用SalI酶切Chi/T-Vector和Glu/T-Vector，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用SacI酶切，1％的电泳检测，回收958bp和940bp的目的片段；同时用SmaI的酶切质粒pBI121，再用SacI酶切，回收载体大片段；T4DNA连接酶分别作载体与目的片段的连接，连接产物分别转化E.coliDH5a，EcoRI/HindIII双酶切鉴定pB-Chi质粒的阳性克隆，XabI/XhoI双酶切鉴定pB-Glu质粒的阳性克隆，获得连接方向正确的pB-Chi、pB-Glu表达载体；B、pB-Chi-Glu双价表达载体的构建用EcoRI酶切pB-Chi，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用HinIII酶切后，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系补平，电泳回收2.0kb片段，此片段包括CaMV35S-Chi-Nos，然后按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化；用HindIII酶切pB-Glu，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，无水酒精沉淀载体，溶解，按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化，T4DNA连接酶作载体与目的片段连接，连接产物转化coliDH5a，以PstI酶切鉴定pB-Chi-Glu的阳性克隆，获得经检测的连接方向与预期目的一致的pB-Chi-Glu双价表达载体质粒；步骤2，非洲菊高效转化再生体系的建立(1)培养非洲菊愈伤组织选择离体培养条件下生长健康的非洲菊单株，以叶柄带有小愈伤组织的叶片为材料，在非洲菊愈伤组织诱导培养基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上进行培养，其培养温度为24±1℃，光照为20001x；14-21天后在叶柄基部长出带有绿色生长点的愈伤组织，无菌条件下切下长出的愈伤组织(2)抗真菌基因对非洲菊的转化A、农杆菌感受态细胞的制备挑取农杆菌LBA4404，接种于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液体培养基中，LB培育基配方如下8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl，于28℃、200rpm培养过夜；取2ml培养物于相同LB液体培养基中继续培养，至OD600为0.4-0.6，将培养物冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，用1ml的浓度为20mmol/L的冷CaCl2悬浮，分装成50μl/管，加15％的甘油，液氮中冷冻后-70℃保存，得感受态细胞；B、质粒向农杆菌中的转化把上述制备好的感受态细胞在冰上融化，加入1ug质粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速冻5min，37℃水浴3～5min至完全融化，冰上放置2min，加600ul上述A步骤的LB液体，28℃温度下200rpm恢复培养3～5h，5000rpm离心3～5min，收集菌体，留50～100ul重悬，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g琼脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28℃培养2天，得根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落板；C、农杆菌对非洲菊愈伤组织的侵染挑取上述根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落，在含量为50～80mg/LRif的下列LB培养基即8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+50～80mg/L的Km+5～10mg/L的Rif中，震荡培养过夜，得活化菌液，用该活化菌液对步骤2-(1)的非洲菊愈伤组织进行侵染，侵染8-10min，转入Ms培养基中，黑暗下培养2天，到经侵染的愈伤组织材料；D、转化植株的抗生素筛选将上述侵染植株转到选择培养基即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA+0.2～0.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50-80mg/L的Rif中，于28℃培养14天，分化出的正常非洲菊转化苗，转入分化培养基即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA++0.2～0.4mg/L的KT中，于28℃培养20天，筛选出的生长正常的非洲菊株系在步骤三的继代培养基上进行扩繁，得抗生素筛选的转基因阳性植株。2、根据权利要求1所述的转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步骤1-(l)-C的PCR扩增反应条件为Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s,Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此进行35个循环；72°ClOmin，反应结束即得所需的Per产物。3、根据权利要求1所述的转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步骤l-(1)-E去磷酸化反应按照DNA片段末端碱基去磷酸化试剂盒说明书进行1)在微量离心管中配制下列去磷酸化反应液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul补平DNA片段42.5ul2)65。C保温30分钟后，加入50u1的灭菌蒸馏水，补充体积至100u1;3)加入lOOyl的下列混合物苯酚氯仿异戊醇=25:24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；重复本步骤一次；4)加入100wl的下列混合物氯仿:异戊醇=24:1，充分混匀，离心后取上层水相转移至另一微量离心管中；5)加入lOu1pH为5.2的3M乙酸钠CH3C00Na，混合均匀；6)加入1的DNAmate溶液，混合均匀；7)加入250ul-20。C的无水乙醇，充分混匀；8)离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀释。4、根据权利要求1所述的转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步骤l-(1)-E对补平DNA产物的回收按照胶回收试剂盒说明书进行；T-载体克隆按照pMD18-TVectorKit说明书进行，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector，之后再用5izs/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector，分别切出329bp、690bp片段的克隆即为阳性正向克隆，对正向克隆作进一步的DNA序列测定。全文摘要本发明涉及一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法。它经过抗真菌基因几丁质酶基因Chi和β-1，3-葡聚糖酶基因Glu的分离、克隆和双价表达载体的构建，以及非洲菊高效遗传转化再生体系的建立、抗真菌基因对非洲菊的转化等步骤，获得转基因植株。本发明以CaMV35S为启动子，将Chi、Glu、NptII在内的基因转化到切花非洲菊品种‘红帽子’中，获得了转基因植株，从而为获得大量的抗真菌病害的转基因非洲菊株系提供技术支持。该方法在有效提供抗真菌病害非洲菊转基因株系的同时，还将为非洲菊基因工程育种提供一条快速、有效、稳定的技术路径。文档编号C12N15/56GK101289670SQ20081005855公开日2008年10月22日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者婷张,颢张,晏慧君,涵李,李绅崇,王继华,霞黎申请人:云南省农业科学院花卉研究所