专利名称：：检测pou3f4基因499c>t突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于检测POU3F4基因4990T突变基因的试剂盒。本发明还涉及新的POU3F4突变基因及其诊断和/或治疗人类遗传性耳聋的应用。
背景技术：
：遗传性聋分为非综合征型耳聋(nonsyndromichearingimpairment，NSffl)和综合征型耳聋(syndromichearingimpairment,SHI)。全部NSHI和绝大部分SHI是孟德尔遗传单基因病，极少部分SHI是染色体病。耳聋是导致交流障碍最常见的疾病。估计全世界约有7亿人口听力损失至少达55dB，其中，学语前聋是常见的发病形式，也是社会影响较重的一类，发病率为1/1000，约半数是遗传因素所致，此人群已超过27/万，其中70。/。是NSHI，3(f/。是SHI。遗传性聋在16世纪就有文献记载，但由于内耳部位深，体积小，研究手段受到限制，因此认识和理解控制听觉系统的基因研究进展很慢。近10多年来，随着现代科学技术的发展及分子生物学、遗传学的飞速发展，人们对遗传性聋的认识不断加深，并取得了显著进步。X-连锁遗传NSHI以DFN表示，已报道8型(DFN1DFN8)，DFN2、DFN4、DFN63型已基因定位，DFN1和DFN3已基因克隆。DFN1在儿童早期开始进行性听力下降，以后可合并进行性肌张力障碍、痉挛、吞咽困难、精神障碍、偏执狂、皮质盲，该型耳聋实质上属于SHI，因疾病早期仅出现听力受损，遗传性聋分型时被纳入了NSHI。DFN3是X-连锁遗传NSHI最常见的类型，临床表现为伴有镫骨固定的混合性聋，神经性聋呈进行性下降，内耳道和前庭异常扩大，小耳蜗，半规管半径变小，高分辨CT扫描可发现内耳道异常扩大、蜗轴异常、蛛网膜下腔与外淋巴腔直接相通，镫骨底板切除或卵圆窗开窗后发生外淋巴液"井喷"，有导致全聋之虞，为手术禁忌。DFN1和DFN6在儿童期开始出现进行性高频感音神经性聋，成年后可达累及全频率的中深度聋。X-连锁遗传NSHI女性携带者多表现为不完全显性，成年后可出现轻-中度听力受损，可进行性加重。根据Shine和Watson在1967年的报道，在一个夏威夷-华裔家系的两代人中，9个个体患有传导性耳聋、前庭系统障碍，术中发现镫骨底板固定。当镫骨底板活动后，大量的外淋巴和脑脊液涌出，提示耳蜗导水管异常开放。Nanceetal.(1970,1971)在欧洲观察到一个相似的家系，在这个家系中，听力下降为混合型。Phelps等(1991)研究了7个X连锁形式的耳聋家系，多数患者内听道的末端膨隆和内听道末端与耳蜗基底转之间的骨质缺损。Phelpsetal.(1991)认为这是由于内听道蛛网膜下腔间隙和耳蜗外淋巴之间的交通导致了外淋巴"水肿"，如果镫骨受扰，则会出现镫井喷。一些女性携带者表现较为轻微。deKok等(1995)总结了DFN3的特征，指出耳聋为镫骨固定引起的传导性耳聋和进行性的感音神经性听力下降引起的混合型，有时极重的感音神经性聋会掩蔽传导性成分。CT扫描显示内听道异常扩张和内听道与内耳之间的异常沟通，因此形成了在打开镫骨底板时出现镫井喷的原因。Bitner-Glindzicz在POU3F4基因发现了特殊的突变，他认为DFN3应以极重的感音神经性聋伴或不伴传导成分，伴随独特的耳发育障碍为特征，极重度的感音神经性聋是这种疾病的必要条件。Douville等(1994)报道小鼠的基因Brain-4(Pou3f4)编码一种转录因子定位在Plp和DXMit6标记之间，这一区域在小鼠和人类的染色体高度保守，因此提示人类POU3F4基因位于Xql3-q22之间。POU3F4在小鼠中的同源基因——RHS2，在胚胎发育过程中，受孕后15.517.5天在脑、神经管和听泡表达，因此胚胎早期它的定位和空间/时间表达模式上都提示是X连锁混合型听力下降伴外淋巴井喷的候选基因。在5位无关的DFN3患者中，deKoketal发现了2个错义突变和2个无义突变，这些突变导致了蛋白截短或非保守氨基酸替代。而在50位对照者中没有发现POU3F4基因突变。说明POU3F4突变是DFN3的分子基础。由POU3F4基因突变导致的X-连锁遗传的耳聋曾有多个家系的报道，包括一个中国家系，家系患者具有特征性的临床表现，该基因是一个值得关注的耳聋相关基因。目前尚无关于在耳聋患者中发现POU3F4基因4990T突变的报道。
发明内容本发明的一个目的在于提供用于检测POU3F4突变(499C>T)基因的试剂盒。本发明将为在中国耳聋人群，特别是X连锁遗传形式的先天性聋桠患者中开展耳聋基因筛查提供方便确实的方法；并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种人类遗传性耳聋相关基因的检测试剂盒。所述检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在POU3F4基因499C>T突变(R167X)，而判断该患者的耳聋发生原因及类型。其中，所述R167X是指POU3F4基因的4990T碱基改变引起表达产物Brn-4蛋白的编码终止于167位氨基酸，不成熟的表达产物诱导启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。发明人应用候选基因筛査的方法在一个中国X连锁遗传的先天性极重度听力下降家系中发现与X连锁遗传性耳聋相关的POU3F4基因新的突变位点——4990T(R167X)。在这个X连锁遗传的耳聋家系中，先证者(男性)和其舅舅(先天性极重度听力下降)以半合子存在，先证者的母亲，姨妈和外婆均为携带者，未发病，突变与耳聋共分离，说明该突变位点是导致耳聋的原因。目前中国已经发现两个由该基因突变导致的先天性极重度听力下降家系，说明了该基因的突变在先天性极重度听力下降患者中比较常见，具有重大研究意义。目前，国际上尚无P0U3F4基因499OT(R167X)突变的报道。图1给出POU3F4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出突变位点(方框标记处)，该突变位于POU3F4基因的499位碱基，原有的胞嘧啶变为胸腺嘧啶(OT)，使得原有编码精氨酸的密码子CGA变为终止密码子UGA(方框标记处)，突变发生后基因表达产物产生一个仅有167个氨基酸的短肽链，原有的两个重要结构域(DNA特异性结构域和同源结构域)均丧失，也因此失去了转录因子的功能。检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)一测序法、采用标记的POU3F4基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等等。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤1)采集待测个体的样本，例如血液、体液或组织，提取基因组DNA;2)以该DNA为模板，以针对POU3F4基因或POU3F4基因第499位碱基附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与POU3F4正常基因的序列进行比较，确定是否存在POU3F4突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否为POU3F4基因突变4990T导致的遗传性耳聋。进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在R167X氨基酸突变位点。在发明人进行的实验中，收集耳聋遗传资源，建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20。C保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer3设计引物，包含POU3F4整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。得到的序列与Genbank中的序列(登录号Z82170)比较确定POU3F4突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定POU3F4的突变位点。上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的POU3F4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，也可用限制性酶切的方法筛査是否存在已被确定的突变。在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为1530个碱基，GC含量为4550%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用引物设计软件设计了一对PCR引物，其序列为上游引物POU1-F:5'匿TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5，國GAACCTGCAGATGGTGGTCT匿3，(nt87773-nt87792)POU3F4正常基因的标准序列可以参考例如Genbank:Z82170。根据本发明的另一个方面，本发明进一步提供了用于检测POU3F4基因4990T突变的试剂盒，试剂盒中可以包含以下试剂用于扩增样本DNA中POU3F4基因或POU3F4基因第499位碱基附近编码区的PCR引物；以及以下一种或几种试剂的组合从待测样品中提取DNA的试剂；PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行直接测序的试剂。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测POU3F4基因4990T突变的试剂盒，容器内装有用以检测P0U3F4基因499OT突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中POU3F4基因4990T突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对PU3-F和PU3-R引物，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(1)提取待测血样的DNA，利用上述的一对POUl-F和POUl-R引物，进行PCR反应；(2)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；(3)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在Bm-4氨基酸突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测POU3F4突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋诊断或治疗方法中。根据本发明的再一个方面，提供了POU3F4突变基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在POU3F4基因499C>T突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供参考；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测为发生了POU3F4基因4990T突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明提出了通过检测患者中是否存在POU3F4基因新的突变而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法，这将有利于在临床上开展耳聋患者，特别是X连锁遗传形式的先天性聋哑患者的POU3F4突变筛査工作，为耳聋患者提供诊断和治疗服务。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。附图的简要说明图l为POU3F4基因编码区氨基酸与核酸碱基的对照突变位于POU3F4基因第499位碱基，用方框圈起来的是突变的碱基和氨基酸，突变后的碱基序列(下划线部分)使氨基酸的编码终止于167位氨基酸；图2为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间；图3为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置；图4为本发明方法中POU3F4基因测序结果，上方为野生型序列，中间为女性携带者杂合突变序列，下方为患者半合子序列，箭头所指为4990T突变位点位置。发明的具体实施方式本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。待测血样提取与POU3F4基因编码区的PCR扩增实施例1一、待测对象血样DNA的制备1、研究对象一个中国X连锁遗传先天性极重度听力下降家系，患者表现为先天性极重度听力下降，颞骨CT检查显示内听道膨大，呈X连锁隐性遗传模式。共调查家系成员17人，男性10人，女性7人。患者2人，均为男性，听力学表型一致。按照下述方法对其中8名成员，包括5名女性、3名男性进行POU3F4基因检测，发现2名男性患者均为突变半合子，另一名正常男性基因为野生型，在5名女性中共检测到3名杂合携带者分别为先证者的母亲、外婆和姨妈。另外两名女性未发现突变。另外选取听力正常，没有听力减退遗传背景正常对照110名，进行POU3F4基因突变检测，结果没有发现任何突变。对所有参加者详细调査其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检査包括耳镜检査、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样510ml。2、基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天1)抗凝血用PBS作1倍稀释。2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18。C28。C)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温，1000xg,离心20分钟。3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000xg,离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000xg，离心10分钟。4)将细胞悬于2mlTE缓冲液(10mMTris.HCl，lmMEDTA，pH8.0)中，加10%的SDS(十二垸基硫酸)至终浓度0.5%(100(^1)，蛋白激酶k100200pg/ml(10mg/ml)，50。C水浴35小时。5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000xg,离心10分钟。6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000xg,离心10分钟。7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000xg，离心10分钟。8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9)加入2.5倍体积的无水乙醇。10)-20。C沉淀DNA过夜。第二天11)高速离心，10000xg，10分钟，4°C。12)弃上清液，加入75。/。乙醇2ml，高速离心10000xg，5分钟13)弃上清液，吹干。14)用TE缓冲液溶解(200(^1TE/5ml全血，400TE/10ml全血)。15)分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。二、POU3F4基因编码区的PCR扩增1、引物序列上游引物POUl-F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5'-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3，(nt87773-nt87792)注POU3F4基因序列检索号Z821702、PCR反应体系的建立(表l)表1POU3F4基因的PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，缓冲液、普通Taq酶从宝生物基因公司购得，dNTP从宝生物公司购得，引物由上海生工公司合成。反应条件PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示。POU3F4基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量实施例2一、PCR产物的纯化——96孔板法1、向装有PCR产物的96孔板中加入50pl无菌水，混匀。2、将其转移到Mimpore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。3、向纯化板中再次加入5(Hil的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入2(^1的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。5、保存在-2(TC冰箱中。1、样品准备取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6pl，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2|il)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。2、流程1)配胶(0.8%琼脂糖)称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml0.5xTBE中(500ml锥形瓶)。2)溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。3)凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至6(TC左右，加入1滴EB(约10^1，10mg/ml)，摇匀。4)铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶将平板放入已盛有电泳液(0.5xTBE，液面距胶面l至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。6)加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。7)走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8)定量当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL2000，如图3所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp,1000bp,750bp,500bp，250bp,100bp，DL2000的总浓度是300ng/5pl。电泳时取5jilDL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3pl(PCR产物)+5^1(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。纯化的POU3F4基因编码区PCR扩增产物的直接测序实施例3一、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求DNA纯度OD260/OD28。=1.6~2.0。DNA浓度PCR产物10ng/nl。DNA用量PCR产物100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng〉2000bp40-100ng二、测序反应1、测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3、目前的反应体系为5pl，各种试剂加入量如表2所示。表2POU3F4基因PCR扩增产物的测序反应体系模板纯化的PCR产物(实施例2中制备)200-500bp3-10ng<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*BigDye3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。4、样品放于PCR仪上，所作反应的过程见表3。表3POU3F4基因PCR扩增产物的测序反应过程<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5、反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4。C冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-2(TC冰箱冷冻。三、测序反应物的纯化和测序1、向每孔中加入20|1180°/。乙醇，4,000rpm离心30min;将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1,000rpm;2、在每孔中加入30|1170%乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；3、重复第2步的操作；4、重复第2步的操作；5、将样品板放于千净的抽屉中，避光干燥30min;6、加入5pl甲酰胺，封膜，离心后置于-2(TC冰箱中；7、上机器前95。C变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。测序图如图4所示。检测耳聋相关基因POU3F4-499QT突变位点试剂盒及其应用实施例41、试剂盒的组成(1)扩增用引物上游引物POU1-F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5'-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3，(nt87773-nt87792)注POU3F4基因序列检索号Z82170(2)PCR扩增用Taq酶5U/|il(3)10x缓冲液(含15mlMgCl2)(4)dNTP2mM(5)Big-Dyemix2、使用方法主要包括如下步骤1)PCR扩增用软件Primer3对POU3F4基因的编码区设计PCR引物，反应条件为94°C预变性4分钟，94。C变性l分钟，退火温度50。C分钟，72。C延伸2分钟，35个循环，反应结束后再72。C延伸5分钟，4。C保存。2)PCR产物纯化将含有PCR产物的MpMScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MpltiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中。3)测序反应及验证以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABIPRISM3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与Genbank中的标准序列比较以确定突变位点是否存在。具体方法参见实施例1、2、3、4。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。权利要求1、一种用于检测与听力损失相关的位于POU3F4基因的499C＞T突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测位于POU3F4基因的499C＞T突变的试剂和任选的用于扩增POU3F4基因的试剂。2、如权利要求1所述试剂盒，所述试剂盒包括下述试剂的组合从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA中包含POU3F4基因499位碱基片段的PCR引物及相应的PCR反应试剂；检测PCR扩增产物的试剂。3、如权利要求2所述的试剂盒，其中所述的PCR引物为POUl画F:5,-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3'POU1-R:5，画GAACCTGCAGATGGTGGTCT画3'。4、如权利要求2所述的试剂盒，其中所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性弓I物检测试剂以及探针杂交检测试剂。5、如权利要求l所述试剂盒，所述试剂盒用于检测位于POU3F4基因的499C>T突变的步骤包括1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA;2)以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；POUl画F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT画3'POUl曙R:5,-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3'3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与POU3F4正常基因的序列进行比较，确定是否存在POU3F4基因的4990T突变位点。6、如权利要求5所述试剂盒，所述步骤还进一步包括4)按照正常阅读框架进行翻译以确定R167X氨基酸突变位点。全文摘要本发明涉及具有499C＞T突变的POU3F4突变基因，此突变基因与人类遗传性耳聋相关，本发明提供了检测POU3F4基因499C＞T突变的试剂盒，通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展耳聋患者的POU3F4突变筛查工作，为耳聋患者的诊断和治疗提供服务。文档编号C12Q1/68GK101250589SQ200810102709公开日2008年8月27日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者王秋菊,赵亚丽,韩东一,韩明鲲申请人:中国人民解放军总医院