专利名称：：生育酚合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生育酚合成相关蛋白及其编码基因与应用。技术背景维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素，具有重要的生理功能。它能够清除脂质过氧化所产生的自由基而稳定和保护生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物的伤害(Brigeliusb-flohER，TraberMG，VitaminE:functionandmetablisra,TheFASEBJ，1999,13，1145-1155)。因而被作为一种有效的抗氧化剂广泛地应用在医药、食品、饲料等行业中。大量动物实验证明，在每公斤饲料中添加40-IOOIU(国际单位)的维生素E，具有提高动物免疫力，改善肉质，提高动物的繁殖性能，缓解其应激反应等显著效果。另外，在饲料中添加维生素E能增加肉品的稳定性，防止肉类腐败、变味、变色，并延长上架时间。近20年来的临床研究表明，维生素E对于人体健康更具有重要作用。每天吸收100—1000IU的维生素E则可提高机体免疫力，延缓人体衰老，降低或防治心血管疾病和癌症的发生。维生素E的生产主要通过化学合成和天然提取获得。化学方法合成的产品主要以醋酸酯的形式存在，副产物多且生物活性低。天然维生素E主要从植物油或其精炼副产物中提取获得。在生理活性和安全性上均明显优于合成维生素E，活性效力约为合成维生素E的l.31.4倍，因而正逐渐代替合成产品成为主流。天然维生素E由8种生育酚异构体组成。根据侧链饱和度可分为生育酚(tocopherol)和三烯生育酚(tocotrienol)两大类。每类依芳香环上甲基数目和位置的不同又分别分为a、0、Y、S生育酚和ct、3、Y、5三烯生育酚。在植物组织当中尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)是维生素E合成途径中的关键酶，催化叶绿醇焦磷酸(phytyl-PP)与尿黑酸(HGA)縮合生成2—甲基一6—叶绿醇质体醌(MPBQ)。它是所有生育酚合成的公共中间前体，此产物由MPBQ甲基转移酶(MPBQMT)催化生成2,3—二甲基一6—叶绿醇苯醌(DMPBQ)。DMPBQ和MPBQ在环化酶的作用下生成Y—生育酚和S—生育酚，二者再由Y—生育酚甲基转移酶分别生成a—生育酚禾口P—生育酚[DeanDellaPenna，BarryJPogson.Vitaminsynthesisinplants:tocopherolsandcarotenoids.」朋wa7Tew'ero/"/7朋f^/oZc^,2006，57:711738]。不同植物组织中生育酚的总量和成分差异很大。在绿色的叶片组织中，a-生育酚是含量最丰富的生育酚,但这些组织的总生育酚水平却非常低[1050iig-g-l(鲜重)]，在种子中总生育酚含量相对较高，但高活性的a-生育酚含量却比较低。
发明内容本发明的目的是提供生育酚合成相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的生育酚合成相关蛋白，命名为GmHPT，是如下a)或b)的蛋白a)其氨基酸序列是序列表中序列2;b)在序列表中序列2限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与生育酚合成相关由(a)衍生的蛋白质其中，序列表中序列2由411个氨基酸残基组成。为了使a)中的GraHPT便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>上述b)中的GmHPT可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的GmHPT的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第173-1408所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。GmHPT蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述的基因具体可是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第173-1408位；3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码生育酚合成相关蛋白的DNA分子；4)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码上述生育酚合成相关蛋白的DNA分子。所述步骤4)中的基因，与l)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1567个碱基组成，自5'末端第173-1408位为编码区，编码序列表中序列2的蛋白质。上述严格条件可为在6XSSC，0.59f)SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。扩增上述GinHPT基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述GmHPT基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有GmHPT基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pC細IA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的GmHPT基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。使用GmHPT基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。本发明的另一个目的是提供一种培育高生育酚含量植物的方法。本发明所述的一种培育高生育酚含量植物的方法，是将所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到高生育酚含量的转基因植物。所述植物为油料作物，具体可为油菜或大豆或花生或芝麻或向日葵。本发明构建了含有GmHPT基因cDNA编码区的重组表达载体，通过农杆菌介导的方法转化烟草，并获得转GmHPT基因cDNA编码区的植株。经高效液相色谱分析结果表明转GmHPT基因cDNA编码区的拟南芥叶片中生育酚含量提高了3.0-4.4倍，平均提高了3.94倍。说明GmHPT是与生育酚合成相关的蛋白。本发明所述的生育酚合成相关蛋白及其编码基因可在培育富含维生素E植物中应用。具体实施方式实施例l、大豆生育酚合成相关的蛋白(GmHPT)cDNA的获得选取生长20天的大豆中黄13，提取总RNA，总RNA的提取按Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsolationSystemkit进行。取5g的总RNA反转录获得cDNA的一链，反应体系如下总RNA10叱(5Pg)、Oligo(dT)(20Wnol/L)1.5叱、10Xbuffer2.5叱、dNTPmix(2.5,1/L)2叱、灭菌水8ML。42。C水浴lmin后向反应体系中加入l叱(200U)SuperscriptIIRT，轻轻混合，42r保温50min;7(TC水浴15min，终止该反应；获得cDNA的第一链。根据大豆EST序列经电子拼接获得的大豆生育酚合成相关蛋白的基因(HPT)序列，设计引物进行扩增，引物序列如下sHPTFL:57AGAAATTAAGAATGGACAGCGGCA;sHPTRL:5'TTTCATCCCAAAAGAAATATATCTTCA。PCR扩增条件为:先94。C3min;然后94。Clmin，55°C45s，72°C2min，30个循环；最后72'C10min。PCR扩增出约1500bp的片段，回收后连接到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒pT-GmHPT，并转化大肠杆菌DH5ct，提取酶切鉴定正确的阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，克隆得到的cDNA序列如序列表中序列l所示，其编码序列是序列表中序列1自5'末端第173-1408位，编码序列表中序列2所示的蛋白。根据克隆到的cDNA序列设计引物，进行PCR扩增，扩增大豆尿黑酸叶绿醇转移酶cDNA编码区序列。上游引物GmHPTPl:5'7T7^W兀CAGCAGTATATATGGATTC3'(斜体部分为/&1识别位点)；下游引物GmHPTP2:5'""T6CATCCTCATCTAACAAAAGG3'(斜体部分为fecl识别位点)。PCR扩增条件为先94。C4min;然后94。Clmin，58°C45s，72°Clmin20s，30个循环；最后72'C10min。PCR扩增出约1000bp的片段，回收后连接到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒pT-HPTlb,鉴定出阳性克隆并进行测序。测序结果表明大豆生育酚合成相关蛋白的基因的cDNA编码区如序列表中序列l自5'末端第173-1408位所示，编码序列表中序列2所示的蛋白。实施例2、转GmHPT植株的获得分别用/力al和5^cI对载体pBI121和重组质粒pT-HPTlb进行双酶切，回收约lkb的大豆GmHPT基因的cDNA编码区片段及llkb的载体片段，进行连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5ct，酶切鉴定。将酶切鉴定结果表明大豆GmHPT基因的cDNA编码区片段插入pBI121的J&I禾口5"acI位点间的重组质粒命名为pBI121-HPTlb。将重组质粒pBI121-HPTlb电击转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，感受态细胞中加入lmlYEB液体培养基28。C培养3小时，取200u1涂YEB抗性平板(卡那霉素50mg/l,利福平50mg/l),28。C培养。挑取单菌落提取农杆菌质粒，并通过PCR和酶切鉴定获得含质粒pBI121-HPTlb的农杆菌。挑取鉴定正确的含pBI121-HPTlb的农杆菌单菌落，接种于5mlYEB(卡那霉素50mg/l，利福平50mg/1)液体培养基中28。C，250rpm培养36小时。按照l:300转接至200mlYEB(卡那霉素50mg/l，利福平50mg/1)液体培养基中，28。C培养至0D6。。"2.0。5，000rpm离心收集菌体，然后重悬于2倍体积的10%的蔗糖溶液，加入O.02呢的SilwetL-77(美国GE公司)。选取具有大量未开放花蕾的co/顺^'s生态型拟南芥进行农杆菌介导的遗传转化。将拟南芥倒置使花蕾朝下浸入菌体悬浮液中，停留20-40秒。在22t培养，直到拟南芥开花结荚收集种子。将收集到的种子(T。代)消毒处理后播种在1/2MS培养基上(含有卡那霉素50mg/1，1%蔗糖)。用封口膜封好平皿，4t:春化48—72小时后22C培养(16小时光照)。抗性幼苗长出2-4片真叶时将其移至土中，培养到幼苗长出8—10片真叶且较粗壮时剪取叶片，提基因组DNA，进行PCR检测。PC財广增所用的引物如下位于pBI121-HPTlb的GmHPT基因的引物(GmHPTP2):5'^6"(^6CATCCTCATCTAACAAAAGG3'禾口位于pBI121-HPTlb的35S启动子区的引物(35Sfw):5'TCTGCCGACAGTGGTCCCAA3'。扩增条件为先94。C3min;然后94。Clmin、58°C45s、72°C2min、30个循环；最后72。C10min。扩增出约l.2b片段的植株为转大豆GmHPT基因的cDNA编码区的阳性植株。鉴定结果表明30株T。代转大豆GniHPT基因拟南芥中有21株阳性转大豆GmHPT基因株。按照上述方法，将pBI121导入co7咖&'a生态型拟南芥中，PCR鉴定结果表明28株T。代转pBI121拟南芥中有20株阳性转pBI121植株。实施例3、转大豆GmHPT基因的cDNA编码区植株中生育酚含量的测定转大豆GmHPT基因的cDNA编码区的阳性植株4株(其名称为GmHPTlbl弁、GmHPTlb2井、GmHPTlb3弁和GmHPTlb4弁)和野生型植株2株(WTl和WT2)、4株转pBI121阳性植株(其名称为pBI121-l、pBI121-2、pBI121-3和pBI121-4)，分别取它们的叶片各100mg，用液氮研磨后转入含600wL甲醇-氯仿(2:1)抽体液的l.5mL离心管中，充分震荡混匀，然后加入200uL氯仿和200uL无菌水，充分混匀。然后12000rpm离心15rain，取下层有机相转入新的离心管中，氮气吹干，溶于400uL无水乙醇中，进行高效液相色谱分析，高效液相色谱采用如下方法高效液相色谱仪的泵使用日本岛津公司的LC-10ATvp、荧光检测器使用日本岛津公司的RF-10Axl、柱温箱使用日本岛津公司的CTO-10Asvp和系统控制器使用日本岛津公司的SCL-10Avp。以体积比为9:1的正己垸和异丙醚混合液为流动相，色谱柱采用4.6X25cm，粒度5ul的硅胶柱，柱温为40。C，流速1.5ml/min，分析时间为20min，激发波长为298nm;发射波长为325nm。实验重复3次。高效液相色谱分析结果表明，转大豆GmHPT基因的拟南芥植株叶片中生育酚的含量普遍提高，见表l。表l中个数值为三次重复的平均值。转GmHPT的拟南芥中生育酚含量提高了3.0-4.4倍，平均提高了3.94倍。拟南芥a-生育酚(lig/g)野生型(WT1)43.728野生型(WT2)32,898pPBI121-l33.798pPBI121-235.136pPBI121-334.753pPBI121-438.842GmHPTlb1#159.962GmHPTlb2#155.741GmHPTlb3#151.535GmHPTlb4#124.911:i.生育酚含量对比Y-生育酚s-生育酚(11g/g)(ug/g)1.6060.4740.6790.0380.7690.1830.9760.2111.6970.0781.2970.3388.7753.7230.9942.8977.1922.6044.9551.848总含量平均含量(ug/g)(ug/g)45.80839.7133.61534.7536.32337.0236.52840.477172.460159.631156.28161.330131.714序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所〈120〉生育酚合成相关蛋白及其编码基因与应用<130>CGGNARW81294<160>2<210〉1〈211〉1567<212〉DNA<213>大豆属大豆f67ycj'/3e;naj^<400>1agaaattaagaatggacagcggc3C3gceicgt卿g3犯gaa^gaeigaag60ttttggtactatagtaaaagttgaagttgggg犯gt8ita^agtgaagtgtggtgttattg120ggttcatg肌attgaaatctga^ctgaacatcagcctccgcagcagtatatatggattc180actgcttcttcgatctttcccaacgcttcttctctcgccaccactggtgc240aaatttctccaggactaaatctttcgccaacatttaccatgcaagttcttatgtgccaaa300tgcttcatggaaatccaaaaagsatata^ttttttgaggtttcggtggcc360aagtttg肌ccaccattacaa<ggagggtgtaatgtaatat420aaaWttgttgtgaaagcgacctctgaaaaatctcttgagtctgaacctcaagcttttga■attttggactctgtcaaga^ttccttggatgctttctacaggttttccag540gtt3ttggC8cagcattaagcataatttctgtgtccctccttgctgttga600gatatatctccattattttttactggtgtgttggaggctgtggttgctgc660cctgtttatgaatatttatattgttggtttga3tca^ttgtctgatgttg720ccgtatcttccattagcatctggggaatattcctttgaaactggtgtcac780tattgttgcatctttttcaattctgagtttttggcttggctgggttgtaggttcatggcc840attattttgggccctttttgtaagctttgtgctaggaactgcttattcaatcaatgtgcc900tctgttgagatggaagaggtttgcagtgcttgcagcgatgtgcattctagctgttcgggc960agtaeitaigttcaacttgcatttttccttcacatccagactcatgtatacaagaggccacc1020tgtcttttcgiagatcattgatttttgctactgcattcatgagcttcttctctgtagttat1080agcactgtttaaggatatacctgaic3ttga_gtatttggcatccaatcttt1140ttcagtgcgtttaggtcagaagccggtattctggacttgtgttatccttcttga^atagc1200ttatggagtcgccctcctggtgggagctgcatctccttgtctttggagcaaaattgtc3C1260gggtctgggacacgctgttctggcttcaattctctggtttcatgccaaatctgtagattt1320gcttcgatascatccttctatatgtttatttggaagctattttatgcaga1380atacttactcattccttttgttagatgaggatgcagcggcaatattgacttgagaattag1M0ttttgtttaaatggtgctgcctttgtcacaggccggcttggagtcgctacattagtttta1500agtttttaattgctaatttaaatgaagatatatttcttttgggatgaaaaaaaaaaaaaa1560aaa^a^31567<210〉2〈211>411〈212>PRT〈213〉大豆属大豆(^7戸'/e<400〉2MetAspSerLeuLeuLeuArgSerPheProAsnlieAsnAsnAlaSer151015SerLeuAlaThrThrGlyAlaAsnPheSerArgThrLysSerPheAla202530AsnlieTyrHisAlaSerSerTyrValProAsnAlaSerTrpHisAsn354045ArgLyslieGinLysGluTyrAsnPheLeuArgPheArgTrpProSer505560LeuAsnHisHisTyrLysSerlieGluGlyGlyCysThrCysLysLys65707580CysAsnlieLysPheValValLysAlaThrSerGluLysSerLeuGlu859095SerGluProGinAlaPheAspProLysSerlieLeuAspSerValLys100105110AsnSerLeuAspAlaPheTyrArgPheSerArgProHisThrVallie115120125GlyThrAlaLeuSerlielieSerValSerLeuLeuAlaValGluLys130135140lieSerAsplieSerProLeuPhePheThrGlyValLeuGluAlaVal145150155160ValAlaAlaLeuPheMetAsnlieTyrlieValGlyLeuAsnGinLeu165170175SerAspValGlulieAspLyslieAsnLysProTyrLeuProLeuAla180185190SerGlyGluTyrSerPheGluThrGlyValThrlieValAlaSerPhe195200205SerlieLeuSerPheTrpLeuGlyTrpValValGlySerTrpProLeu210215220PheTrpAlaLeuPheValSerPheValLeuGlyThrAlaTyrSerlie225AsnValCyslieHislieLeulie290LeuPhe305GinSerVallieAlaSerValLeu370SerLys385TyrAlaProLeuGin275PheLysPheLeuPro355AlaAlaGluLeuAla260ThrAlaAspSerLeu340CysSerSerTyrLeu245ValHisThrlieVal325GluLeulielieLeu405230ArgArgValAlaPro310ArglieTrpLeuThr390LeuTrpAlaTyrPhe295AspLeuAlaSerTrp375SerlieLysValLys280MetlieGlyTyrLys360PhePhePro235ArgPheAlaVal250lieValGinLeu265ArgProProValSerPhePheSer300GluGlyAspLys315GinLysProVal330GlyValAlaLeu345lieValThrGlyHisAlaLysSer380TyrMetPhelie395PheValArg410240LeuAlaAlaMet255AlaPhePheLeu270PheSerArgSer285ValVallieAlaValPheGlylie320PheTrpThrCys335LeuValGlyAla350LeuGlyHisAla365ValAspLeuLysTrpLysLeuPhe400权利要求1、一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白a)其氨基酸序列是序列表中序列2；b)在序列表中序列2限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与生育酚合成相关由(a)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第173-1408位；3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码与生育酚合成相关的蛋白的DNA分子；4)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码上述与生育酚合成相关的蛋白的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的出发载体为pPBI121。6、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。7、一种培育高生育酚含量植物的方法，是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到高生育酚含量的转基因植物。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物为油料作物，优选为油菜或大豆或花生或芝麻或向日葵。9、扩增权利要求2或3所述编码基因的全长及其任意片段的引物对。10、权利要求l所述蛋白及其编码基因、权利要求4或5所述重组表达载体、权利要求6所述转基因细胞系或重组菌、权利要求7或8所述的方法在提高植物中维生素E含量中的应用。全文摘要本发明公开了生育酚合成相关蛋白及其编码基因与应用。该酶是如下的蛋白a)其氨基酸序列是序列表中序列2；b)在序列表中序列2限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与生育酚合成相关由(a)衍生的蛋白质。编码所述蛋白的基因是；1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第173-1408位；3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码与生育酚合成相关的蛋白的DNA分子；4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与生育酚合成相关的蛋白的DNA分子。本发明所述尿黑酸叶绿醇转移酶及其编码基因可在培育富含维生素E植物中应用。文档编号C12N15/29GK101265295SQ200810106450公开日2008年9月17日申请日期2008年5月13日优先权日2008年5月13日发明者兰张,磊王,范云六申请人:中国农业科学院生物技术研究所