专利名称：一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种重组人干扰素oc2b的高密度 发酵方法。
背景技术：
我国目前的高密度发酵水平和国外差距较大，发酵后菌体浓度和产物的 产量上与国际水平有很大的差异，例如生产重组人生长激素的重组大肠肝菌 发酵国内能够达到发酵后菌液OD600在50_60,而国外能够达到120的水平， 目的产物的产量国内只有0.4g/L,而国外能够达到1.1g/L的水平。毕赤酵 母的高密发酵更有优势，可以在合成培养基中生长到OD值500以上，菌体体 积可占到发酵液体积的一半以上。
在高密发酵方面，大肠杆菌是最具代表性和应用最广的宿主系统，重组 大肠杆菌的高密度发酵技术在生产实践中得到了广泛应用，并且取得了令人 惊喜的成果。但是在该技术实际应用中还存在许多需要解决的问题。其中最 为严重的就是培养过程中菌体过早地衰老、自溶和外源基因不能充分表达、 比活性较低，这主要是细菌产生的有害的代谢废物对重组菌的抑制作用。比如 乙酸是大肠杆菌的主要副产物，它对细菌生长和产物的表达都有抑制作用。乙 酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。 一般认为细菌在低比生 长速率条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求, 不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的 能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH2。这就产生过多乙酸。目前以 重组人干扰素a 2b为代表的生化药物在国内发酵罐实际操作中由于发酵过程 研究以及数据釆集与处理困难，发酵工艺优化的基本思路仍停留在寻求培养 基的最优配方和最佳的温度、pH、等的静态调控，其操作步骤繁瑣，菌体表 达低，菌量少。
重组人干扰素oc2b在全自动模块式发酵系统中釆用代谢控制发酵的技术 正是解决其高密度发酵的关键技术。
发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种重组人干扰素oc2b的高密度发酵方法。
(二) 技术方案
本发明提供了一种重组人干扰素oc2b的高密度发酵方法，它是通过在线 检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9—1之间。同时，在 发酵过程中通过控制相对恒定的溶解氧以维持有机酸的低水平。
本发明所釆用的发酵罐是W14900瑞士比欧公司生产的450L全自动发酵 罐，所釆用的试剂均为普通化学试剂公司购买。乙酸浓度釆用离子色谱(美 国D i o n e x公司I C S 1 5 0 0离子色谱仪，I o n p a c A S 1 1 HC 4 x 2 5 Omm阴离子分析柱和IonpacAGll HC4x50 mm保护柱，电导检测器检测)检测。葡萄糖浓度釆用瑞士比欧公司专用 ProcessTRACEl. 2在线葡萄糖分析仪检测。目的蛋白测定釆用SDS-PAGE法， 釆用瑞典安发玛西亚公司MINI VE电泳仪。
本发明所述的重组人干扰素oc2b的高密度发酵方法包括如下步骤
(1) 按配方称取规定重量的组分；
(2) 在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3 )用氢氧化钠溶液调PH值至5. 0-8. 0;
(4)发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(12rC， 30分钟)，补料培 养基在相应专用坡璃补料瓶内灭菌U15'C， 30分钟)。 (5 )在接入合适的重组大肠杆菌进行培养；
(6) 本发酵工艺采用利用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为 200 - 700rpm、起始通气量设为100 - 500L/min、起始罐压设为0. 1 - 0. 5bar， 釆用计算机控制，将发酵过程全程溶解氧浓度控制在30%_75%之间。将搅拌 速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现 波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从 而保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(7) 利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄 糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和C02的释放率(CER),计算呼吸 商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸 商(RQ)值维持在0.9-1之间。从而控制维持乙酸的低水平(2-6g/L)，保证
了菌体的生长和目的产物的表达。
(8 )对获得菌体进行通用方法处理得到重组人干扰素oc 2b成品。
(三)有益效果
釆用本发明所述的高密度发酵方法，可以在发酵过程中避免或减少乙酸 的生成，从而减轻了乙酸的抑制作用，实现重组大肠杆菌高密度生长，提高 重组人干扰素oc 2b蛋白的产率。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例l重组人干扰素oc2b的高密度发酵
发酵培养基l:蛋白胨6g/L，酵母膏2g/L，葡萄糖O. 02%,甘油0. 6 %， Na2HP04 llg/L， NaH2P04 lg/L ， KH2 P04 4g/L， NaC12g/L， FeS04. 7H20 0. 01g/L， MgS04. 7H20 0. 02g/L， CaCl2 0. OOlg/L,, VBt 0. 01g/L， MnS04 0. 01 g/L、甘氨酸O. 2 g/L、甲硫氨酸O. 01 g /L。
补料培养基包括葡萄糖浓度15%,用量1%;甘油浓度45%，用量7%
(1) 按上述配方称取100L的组分；
(2) 在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3 )用氢氧化钠溶液调PH值至5. 0-8. 0;
(4) 发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(12rc， 30分钟)，补料培
养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115匸，30分钟)；
(5) 在接入重组大肠杆菌进行培养；
(6) 采用利用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为200rpm、起 始通气量设为100L/min、起始罐压设为0. lbar,釆用计算机控制，将发酵过 程全程溶解氧浓度控制在35%之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气 量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从而保证了菌体的生长和目的产物
的表达。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡 萄糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算
出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和C02的释放率(CER)，计算呼 吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼 吸商(RQ)值维持在0.9-1之间。获得含重组人干扰素oc2b的菌体1962g，发 酵液乙酸含量〈3克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素a2b)表达量 34. 46%。
(8)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素 oc 2b成品。
实施例2:重组人干扰素oc2b的髙密度发酵
发酵培养基2:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，葡萄糖0. 5%，甘油1%， Na 2HP04 15g/L, NaH2P04 4g/L , KH2 P04 6g/L， NaCl 3g/L， FeS04. 7H20 0. 5g/L, MgS04. 7H20 0. 5g/L, CaCl2 0. 02g/L， ， VB丄0. 03g/L, MnS04 0. 05 g/L、 甘氨酸O. 5 g/L、甲硫氨酸O. 06 g/L。
本发明所釆用的补料培养基包括葡萄糖浓度35%,用量5%;甘油浓度 25%，用量2%
(1) 按上述配方称取100L的组分；
(2) 在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3) 用氢氧化钠溶液调PH值至5. 0-8. 0;
(4) 发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(12rC, 30分钟)，补料 培养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115°C, 30分钟)。
(5) 在接入重组大肠杆菌进行培养，升到42匸培养； (6)采用全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为250rpm、起始通气
量设为250L/min、起始罐压设为0. 2bar,釆用计算机控制，将发酵过程全程 溶解氧浓度控制在25%之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐 压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从而保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡
萄糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算
出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和C02的释放率(CER)，计算呼 吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼 吸商(RQ)值维持在0. 91之间。获得含重组人干扰素o^b的菌体"63g,发酵 液乙酸含量<2.5克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人千扰素oc2b)表达量 38. 17%。
(8)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素 a 2b成品。
实施例3:重组人干扰素a2b的髙密度发酵
发酵培养基3:蛋白胨18g/L，酵母膏8g/L,葡萄糖2%，甘油4%, Na 2HP04 27g/L, NaH2P04 7. 5g/L ， KH2 P04 6. 5g / L, NaC16. 5g / L, FeS04. 7H20 0. 08g/L， MgS04. 7H20 1. 2g/L， CaCl2 0. 01g/L， ， VB0. 1 g/L， MnS04 0. 1 g g/L、甘氨酸L2 g/L、甲硫氨酸O. 1 g g/L。
本发明所釆用的补料培养基包括葡萄糖浓度50%，用量8%;甘油浓度 15%，用量4%。
(1) 按上述配方称取100L的组分；
(2) 在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3) 用氢氧化钠溶液调PH值至5. 0-8. 0;
(4) 发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(12rC, 30分钟)，补料培 养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115°C， 30分钟)；
(5) 在接入合适的重组大肠杆菌进行培养，升到43'C; (6)釆用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为300rpm、起始通
气量设为400L/min、起始罐压设为0. 3bar，采用计算机控制，将发酵过程全 程溶解氧浓度控制在45%之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶 解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。
(7) 利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄
糖分析仪，随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整
个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和C02的释放率(CER)，计算呼吸商 (RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸商 (RQ)值维持在0. 9 - 1之间。获得含重组人干扰素a 2b的菌体1643g,发酵液 乙酸含量<3.5克/L,经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素oc2b)表达量 33. 27%。
(8) 对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素 a 2b成品。
实施例4对照实验
发酵培养基4:蛋白胨10g/L,酵母膏4g/L，葡萄糖4 / ， NaC15g/L， 本发明所述的重组人干扰素oc2b的高密度发酵培养基配制方法包括如下 步骤
(1) 按上述配方称取100L的组分；
(2) 在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3) 用氢氧化钠溶液调PH值至7. 0;
(4) 在相应容积的发酵罐内灭菌(12rC， 30分钟)。
(5) 在接入重组大肠杆菌进行培养，获得含重组人干扰素oc2b的菌体 1035g，发酵液乙酸含量〉5克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素a2b) 表达量25. 14%。
(6) 对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素 a 2b成品。
权利要求
1、一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法，其特征在于通过在线检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9～1之间。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵过程中通过控制相对恒定的溶解氧以维持有机酸的低水平。
全文摘要
本发明提供了一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法，通过在线检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9～1之间，并控制相对恒定的溶解氧，从而达到维持有机酸在低水平的目的，实现重组人干扰素α2b的高密度发酵。
文档编号C12P21/02GK101591690SQ20081011368
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者春 吉, 周德胜, 张春丽 申请人:北京凯因科技股份有限公司