专利名称：一种化学半合成制备博宁霉素的方法
技术领域：
本发明涉及一种博宁霉素的制备方法，属于抗生素的化学半合成 领域。
背景技术：
博莱霉素族抗生素的分子结构
0々CzNH2 NH2
博莱霉素A2 R= -NH(CH2)S(CH3)
NH II
博莱霉素B2 -NH-(CH 2)4-NH-C-NH 2
平阳霉素 -NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH2
博安霉素 -NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)rNH2
博宁霉素 -NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)rNHCOCH3
其中，博宁霉素(Boningmycin)(专利号为98101253.1，发明名
称为一种抗肿瘤抗生素和其微生物发酵生产法)。博宁霉素不但具有 抗肿瘤作用，而且对银屑病、脂溢性皮炎和乳头瘤病毒所致的疾病如尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用，毒性低，外用无刺激性，具有良 好的应用前景。但其通过发酵培养所产生的活性产物中博宁霉素仅占 约5%以下，甚至只有痕迹量。
因此，为了适应工业化生产，并能有效降低成本，本发明的技术 人员通过继续研究，发现了一种高产率的博宁霉素生产方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备博宁霉素的方法，该方法采用化学 半合成的方法将博安霉素乙酰化处理，使产生的博宁霉素收率达到
65 ~ 80%。
为了实现本发明目的，本发明所述的博宁霉素(Z-893 )的制备 方法是采用博安霉素与酸酐进行乙酰化反应生成。
其中，博安霉素乙酰化处理为将博安霉素溶于甲醇中，然后向 所获得的溶液中每亳升加入13 ~ 17 ja 1的吡啶及10 ~ 13 ja 1的醋酸酐， 室温下反应0.5~2h,反应液中加入丙酮，反应液与丙酮的体积比是 1 :3~6，过滤沉淀。
所述的博安霉素为含铜的博安霉素。该含铜的博安霉素可以是去 铜的博安霉素先转变为含铜的博安霉素再进行乙酰化，也可以直接用 博安霉素含铜品。
博安霉素加铜处理可采用先将博安霉素溶于水中，加入Cu2+ 使充分螯合铜，经大孔吸附树脂柱脱去过量铜，浓縮洗脱液冷冻干燥， 得到含铜干燥品。
博安霉素乙酰化反应后得到博宁霉素(Z-893 )，还需进一步处理 先将过滤物溶于水中，经凝胶柱层析，并用0.1 0.8NNH4C1水溶液 进行梯度洗脱，按洗脱峰值为0.3~0.4mol/L收取，然后再经大孔吸 附树脂柱吸附，并用含5%NaCl和5%EDTA 二钠盐的水溶液洗脱， 去除产物鳌合的铜；再用5。/。NaCl水溶液洗脱，去除EDTA，水洗除 盐后，用5~30%的丙酮(含0.01NHC1)溶液洗脱；收集活性流分， 经浓缩、冷冻干燥而得博宁霉素冻干品。收率达65~80%。经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。
本发明所用的博安霉素可釆用发酵方法制成，也可采用现有的其 他方法获得。
其中优选的是，博安霉素由如下方法制备先将轮枝链霉菌平阳 变种菌矛中(Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)进f 发酵 培养得培养液，然后对培养液进行提取而成。
菌种优选为轮枝链霉菌平阳变种Q835 (Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )。
发酵培养基组成按重量比计为葡萄糖0.2~0.8%，淀粉0.5~ 5.0%,豆饼粉0.5-6肌玉米粉0.5 5肌玉米浆0.1~2.0%，氯 化钠0.1 ~ 0.5%，磷酸二氢钾0.01 ~ 0.03%，硫酸锌0.01 ~ 0.08%,硫 酸铜0.001 ~ 0,020%,玉米油0.1~0.5%，其余为水，pH6.0~6.5。
本发明博宁霉素的制备方法，釆用化学半合成的方法将博安霉素 乙酰化，使博安霉素转变为博宁霉素，收率达到65~80%，具有良好 的工业化生产前景。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l
对含铜的博安霉素进行化学半合成处理称取博安霉素含铜品 200mg,溶于10ml甲醇中，加入156 PtM定，再加入116^1乙酸酐， 室温下反应lh，以1NHCl酸化至pH4.0,反应液加入4倍量丙酮， 产生蓝色沉淀，过滤后的蓝色固体溶于少量水，上50ml CM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1 -0.8NNH4C1水溶液进行梯度洗脱， 按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含 5。/。NaCl和5。/。EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜，再 用5。/。NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。水洗除盐后，用有20%的丙酮 (含0.01NHC1)溶液洗脱。收集活性流分，旋转薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥，收率达73.6%。
经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。
实施例2
对博安霉素进行化学半合成处理称取博安霉素脱铜品191 mg， 溶于10 ml水中，加20mg硫酸铜，上大孔吸附树脂柱去掉多余的Cu2+, 浓缩洗脱液冷冻干燥，得到含铜干燥品，然后溶于10ml甲醇中，加 入160(il吡啶，再加入120^1乙酸軒，室温下反应lh，反应液加入4 倍量丙酮，产生蓝色沉淀，过滤后的蓝色固体溶于少量水，上50ml CM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1 0.8NNH4C1水溶液进行梯度洗脱， 按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含 5。/。NaCl和5。/。EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。再 用5。/。NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。水洗除盐后，用30%的丙酮(含 0.01N HC1)溶液洗脱。收集活性流分，旋转薄膜蒸发浓縮，冷冻干 燥，收率达76.2%。
经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。
实施例3
对含铜的博安霉素进行化学半合成处理称取博安霉素含铜品 200 mg，溶于10 ml甲醇中，加入160 pl吡嚏，再加入130 pl乙酸酐， 室温下反应2h，反应液加入5倍量丙酮，产生蓝色沉淀，过滤后的 蓝色固体溶于少量水，上50ml CM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1 ~ 0.8NNH4C1水溶液进行梯度洗脱，按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上 50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含5% NaCl和5% EDTA 二钠盐的水溶 液洗脱，去除产物鳌合的铜。再用5n/。NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。 水洗除盐后，用有30%的丙酮(含0.01NHC1)溶液洗脱。收集活性 流分，旋转薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥，收率达75.1%。经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定， 分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。
实施例4
博安霉素的制备所用的产生博安霉素的菌种为轮枝链霉菌平阳 变种Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )， 其 斜面培养基组成为葡萄糖1.0%,蛋白胨0.5%，淀粉1.0%,氯化钠 0.5%和琼脂2.0%，其余为水。调pH7.2,于120。C灭菌30分钟，将 菌种接种于此斜面培养基上，在28t:培养8天，将生长良好的菌种 斜面接种于经过12(TC灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的 组成为葡萄糖0.5%,淀粉2.5%，豆饼粉3.2%，玉米粉2.0%,玉 米浆0.5%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.015%,硫酸锌0.05%，硫酸 铜0.01%，玉米油0.3%，其余为水，自然pH,接种后在28匸旋转培 养48小时后，做为种子，用于发酵。发酵培养基与种子培养基相同， 调pH6.0后，同样于12(TC灭菌30分钟，将培养好的种子转种于此 发酵培养基中，29'C培养8天后收获培养液。
将培养液用草酸调pH至3.0,再用氢氧化钠调pH至6.5过滤， 滤液通过离子交换树脂D151(lT型)，无盐水洗后，以0.3N盐酸洗脱， 收集活性部分调pH至6.5,再经大孔吸附树脂4006脱盐，以10%丙 酮(含0.01NHC1)溶液洗脱，收集活性部分，减压浓縮至小体积， 浓缩液用氨水调pH至6.5，进行CM-Sephadex C-25 ( NH/型)柱层 析，无盐水洗柱后，以0.1 1N氯化铵梯度洗脱，按峰位收集博安霉 素，冷冻干燥，可得到蓝色的博安霉素含铜品。
实施例5
基本同实施例4，不同的是发酵培养基的组成为葡萄糖0.2%, 淀粉5.0%，豆饼粉0.5%,玉米粉5.0%,玉米浆2.0%，氯化钠0.1%， 磷酸二氢钾0.03%，硫酸锌0.01%，硫酸铜0.02%,玉米油0.1%,其 余为水，pH6.3。
7实施例6
基本同实施例4，不同的是发酵培养基的组成为葡萄糖0.8%， 淀粉0.5%,豆饼粉6.0°/。，玉米粉0.5%,玉米浆0.1%,氯化钠0.5%， 嫌酸二氢钾0.01%，硫酸锌0.08%，硫酸铜0.001%,玉米油0,5%, 其余为水，调pH6.5。
虽然，上文中已经用 一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1、一种化学半合成制备博宁霉素的方法，其包括步骤将博安霉素与酸酐进行乙酰化反应。
2、 根据权利要求1所述的博宁霉素的制备方法，其包括步骤 将博安霉素溶于甲醇中，然后向所获得的溶液中每毫升加入13~17 pl的吡啶及10 13yl的醋酸酐，室温下反应0.5 2h，反应液中加 入丙酮，反应液与丙酮的体积比是1 :3-6，过滤沉淀。
3、 根据权利要求1或2所述的博宁霉素的制备方法，其特征在 于，所述的博安霉素为含铜的博安霉素。
4、 根据权利要求1-3任意一项所述的博宁霉素的制备方法，其 特征在于，所述博安霉素乙酰化反应后还经进一步处理过滤后经凝 胶柱层析，并用0.1-0.8NNH4C1水溶液进行梯度洗脱，按洗脱峰值 为0.3 0.4mol/L收取，然后再经大孔吸附树脂柱吸附，并用含 5。/。NaCl和5n/。EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜；再用 5。/。NaCl水溶液洗脱，去除EDTA,水洗除盐后，用含有5~30%丙酮 O.OINHCI的水溶液洗脱，收集活性流分，浓缩、冷冻干燥得盐酸博 宁霉素。
5、 根据权利要求1-4任意一项所述的博宁霉素的制备方法，其 特征在于，所述的博安霉素由如下方法制备先将轮枝链霉菌平阳变 种菌种(Streptomyces vertidllus Var. Pingyangensis n. var)进4亍发酵培 养得培养液，然后对培养液进行提取而成。
6、 根据权利要求5所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于， 所述的菌种为轮枝链霉菌平阳变种Q835 ( Streptomyces vertidllus var Pingyangesis n. sp Q835 )。
7、 根据权利要求5或6所述的博宁霉素的制备方法，其特征在 于，所述的发酵培养基中含有如下重量比的组分葡萄糖0.2~0.8%， 淀粉0.5~5.0%,豆饼粉0.5~6.0%,玉米粉0.5~5线玉米浆0.1-2.0%,氯化钠0.1 ~ 0.5%，磷酸二氢钾0.01 ~ 0.03%，硫酸锌0.01 ~ 0.08%,硫酸铜0.001 ~ 0.020%,玉米油0.1 ~ 0.5%,其余为水，pH6.0 ~ 6.5。
全文摘要
本发明提供一种制备博宁霉素(Z-893)的方法，采用化学半合成的方法将博安霉素乙酰化，使博安霉素转变为博宁霉素，收率达到65～80％，具有良好的工业化生产前景。
文档编号C12R1/625GK101607986SQ20081011536
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者瑞 张, 许鸿章, 陈汝贤, 敏 鲁 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所