专利名称：提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化植酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化酶，本发明还涉及对蛋白酶进 行环化以提高其性能的方法。
背景技术：
天然蛋白质，尤其是酶蛋白在稳定性方面的存在许多不足，比如耐热性差，易被蛋 白酶水解等，限制了它们在医药和工业生产中的应用。
例如，植酸酶(E.C.3. 1.3.8)是一种可以将植酸水解为肌醇和磷酸的酶类。饲料中 添加植酸酶后可将植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸盐，供动物吸收利用，从而提高磷的 利用率和骨骼矿化程度，可节约磷资源、降低饲料成本。但植酸酶对热不稳定，而植酸 酶生产过程的制粒环节，温度为75-9(TC，并要持续数分钟，在此过程中酶的活性会大幅 度的丧失，影响其在生产中的应用。因此提高植酸酶的稳定性成为急需解决的问题。
蛋白环化是一种新技术，环化的蛋白较之线型的蛋白有很多的好处，例如可增加蛋 白的稳定性，减少蛋白对水解酶剪切的抗性，增强蛋白的活性和减少蛋白构象的柔性等。
应用工程内含肽来环化蛋白质，即应用细菌表达系统生产环化蛋白，这种方法开辟 了改进蛋白质稳定性的途径。这种环化方法通过蛋白剪接反应实现的，从蛋白前体上释 放一个内部的蛋白序列，称为内含肽。在内部蛋白序列的剪接过程中，内含肽被包埋蛋 白前体中，催化自身的剪切，进而把两侧的蛋白序列连接起来。将目的的蛋白融合表达 在内含肽的两部分中，形成一个三明治结构。当内含肽被释放时，目的蛋白的C、 N端处 形成一个肽键，使目的蛋白环化起来，蛋白质的稳定性将会提高。
发明内容
本发明的总的目的是开发一种新的酶蛋白环化技术，提供具有热稳定性及蛋白酶抗性的环化酶。
本发明的另一目的是提供在细菌表达系统中高效表达生产环化酶的方法。 技术解决方案
本发明提供了一种环化的酶，其特征在于，其多肽序列的前5个氨基酸具有SEQID N0:1序列，最后5个氨基酸具有SEQ ID N0:2序列；且酶蛋白的N、 C两端相链接。
所述环化的酶蛋白的N、 C两端相链接，是通过内含肽介导的环化方法，用天然的 肽键将酶蛋白的N、 C两端链接起来。
在本发明的一个实例中，对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的中性植酸酶基因 PhyC进行环化，编码该环化植酸酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。经实 验证实，环化后的植酸酶的热稳定性和蛋白酶的抗性均有所提高。
本发明还提供了一种环化酶蛋白的方法，包括整套表达载体的构建、重组字的筛选 及环化分子的鉴定方法，将前5个氨基酸具有SEQ ID N0:1序列，最后5个氨基酸具有 SEQ ID N0:2序列的编码基因在大肠杆菌中的环化表达。
所述环化酶蛋白的方法是利用天然集胞蓝细菌(Synechocystis species PCC6803) Ssp DnaE内含肽的转剪接特性，分别于体内体外对蛋白质环化。
在本发明的一个实例中，所述酶蛋白是植酸酶蛋白，环化方法是将SEQ IDN0:3所 示核苷酸序列的基因在大肠杆菌中的环化表达，通过内含肽的转剪接作用环化中性植酸 酶PhyC，所述Ssp DnaE内含肽的基因具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。具体方 法如下
1. 环化载体构建按常规方法克隆(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。从集胞蓝细菌(Synechocystis species PCC6803)的dnaE基因中PCR， 分别得到Ssp DnaE内含肽的N端和C端2部分，后连入pMXB10载体，形成表达载体pEBl。
2. 基因克隆 从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组中PCR得到一个中 性植酸酶基因phyC，克隆到上述表达载体pEBl中。转化到大肠杆菌，获得重组子。
3. 蛋白的表达和纯化 加入IPTG诱导表达PhyC植酸酶，通过镍柱亲和纯化体内生成的环形植酸酶；通过几丁质亲和柱得到体外的环形植酸酶。验证蛋白的环化情况。
用本发明的方法改良的植酸酶具有更好的热稳定性。本方法为体内环型植酸酶的生 产奠定了基础。
图l为大肠杆菌重组载体pPEB的物理图谱；
图2为大肠杆菌重组载体pEBl的物理图谱;
图3表示40 75。C下，环化植酸酶cPhyC和野生植酸酶PhyC在各温度保温1小 时后，得出的环化植酸酶与野生植酸酶的热稳定性；
图4环化植酸酶的最适反应温度；
图5环化植酸酶对外肽酶的抗性。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一歩阐述本发明。应理解，该实施例仅用于举例说明本发明 的方法，而不限制所用酶蛋白的范围。
实验条件
菌株与载体 大肠杆菌菌株E. coli BL21 (DE3)购自Novagen公司，载体由本研究 构建并保存。
酶与试剂盒限制性内切酶，连接酶，T叫酶为NEB公司产品。基因组提取试剂盒 为天根生化公司产品。凝血酶为Merk公司产品。
生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA 合成仪。 IPTG、 X-Gal、 SDS及植酸酶钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯 酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。NTA树脂为Qiagen公司产品。几丁质树脂 为NEB公司产品。
培养基大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl， pH7.0)。实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人 的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)实验室 手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1环化植酸酶
1) 环化表达载体的构建
用于环化的大肠杆菌表达载体pEBl。首先提取集胞蓝细菌(Synechocystis species) 的基因组。以所提取的基因组为模板，PCR扩增dnaE的C端序列。所使用的引物根据 dnaE的C段基因的5，和3，端序列合成，2个引物序列分别为5， ATGGTTAAAGTTATCGGTC 3， 和5' GTTAGCTGCGATAGCGCC 3'，扩增后进行凝胶电泳，回收大小108bp的片段。另外， 以所提取的基因组为模板，PCR扩增dnaE的N端序列。所使用的引物根据dnaE的N段 基因的5'和3'端序列合成，2个引物序列分别为5， TGCCTGTCTTTTGGTACC 3'和5' TTTAATTGTC CCAGCGTC 3'，扩增后进行凝胶电泳，回收大小369bp的片段。之后将dnaE 的C段基因经HindIII和AflII酶酶切，dnaE的N段基因经AflII和EcoRI酶切后连入 pMXB10载体，形成pEBl载体(见图2) ， dnaE的C段基因前为T7启动子。
2) 植酸酶基因分子的克隆
提取枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)基因组。以所提取的基因组为模板，进 行PCR扩增，电泳回收植酸酶phyc基因约1124bp片段。所使用的引物根据phyc基因的 5'和3'端序列合成，2个引物序列分别为
5' CTTAAGCACCATCATCATCATCATAAGCATAAGCTGTCCGATC 3，和
5， ATCGATGCTACCACGCGGAACCAGTTTTCC GCTTCTGTC 3，，
扩增后进行凝胶电泳，回收大小H24bp的片段，SEQ ID N0:3为植酸酶phyC的碱 基序列，SEQIDN0:5为其氨基酸序列。获得的DNA分子经AfIII酶切，与经酶切的实验 一中得到的pEBl载体于4。C连接过夜，转化大肠杆菌BL21 (DE3)， LB培养基涂板后筛选 阳性重组子，提取质粒进行鉴定，得到重组子。重组质粒pPEB图谱见图1。
3) 环化植酸酶表达纯化的程序
将实验二得到的重组子接种到20mL的LB培养基中，37'C振荡培养过夜，按10%接种
6量接种于1LB培养基中，与37。C培养至OD为0.6，加入IPTG至终浓度0. 5mM,继续培养 3小时，诱导表达植酸酶。离心收集菌体，菌体重悬于100mL含500mM NaCl的 Tris-HC1 (pH7. 0)缓冲液中，超声波破碎菌体，15000rpm离心30分钟去除细胞碎片。上 清液通过NTA镍株进行纯化。将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-O Buffer (20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5M NaCl, 10%甘油)洗。将样品离心后上清加到NTA 层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结 合情况。层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。分别用 5倍NTA体积的NTA-20(20mMTris-HClpH7. 9， 0. 5MNaCl， 10%甘油，20mM咪唑)，NTA-40 (20mMTris-HC1 pH7. 9, 0. 5MNaCl， 10%甘油，40mM咪唑)，NTA-60(20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5MNaCl， 10%甘油，60mM咪啤)，NTA-80 (20mM Tris-HC1 pH7. 9, 0. 5M NaCl, 10%甘 油，80mM咪唑)，NTA-IOO (20mM Tris-HC1 pH7. 9, 0. 5M NaCl， 10%甘油，100mM咪唑) 缓冲液洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。SDS/PAGE 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
4)植酸酶体外环化及纯化
将实验二得到的重组子接种到20mL的LB培养基中，37"C振荡培养过夜，按10%接种 量接种于1LB培养基中，与37'C培养至OD为0. 6，加入IPTG至终浓度0. 5mM，继续培养 3小时，诱导表达植酸酶。离心收集菌体，菌体重悬于100mL含500niM NaCl的 Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液中，超声波破碎菌体，15000rpm离心30分钟去除细胞碎片。将 上清液慢加入几丁质柱，之后用20倍柱床体积的缓冲液1 (20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5M NaCl )彻底洗柱。停止柱流23。C放置15小时。后用缓冲液1将目的蛋白洗脱收集。大 约收集8-IO管，每管5 ml。通过280 nm UV吸光值或Bradford蛋白检测法进行检测。
实施例2环化植酸酶性质测定
1)植酸酶酶学性质的测定方法
有目的植酸酶的收集管用与测定植酸酶酶活，酶活测定方法如下:将上清用缓冲液 (50mM Tris - HC1 , 2mM CaC12 ，10 %甘油，pH710)做适当稀释后，取015ml酶液，加入 2ml 2mM的植酸钠(100mM Tris — HC1 ，pH710 ， 012慮CaC12 ) ，37 。C保温30min ，加入 215m] 20 %TCA(w/ v)终止酶活反应，5000r/ min离心5min ，然后加入5ml硫酸亚铁一 钼酸铵显色液[(115 %钼酸铵515 %硫酸)(217 %硫酸亚铁)二 4 : 1 , v/ v ] , 5000r/min离心5min，700mM测定无机磷酸含量。对照为先在015ml的酶稀释液中加入215ml 20 %TCA使酶失活，再加入同体积的底物保温。酶活性单位(U)定义为在一定条件下， 每分钟释放Inmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位。
2) 环化植酸酶和野生型植酸酶的热稳定性测定比较
植酸酶的最适温度的测定在Tris-HCl (pH 7. 0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促 反应。热稳定性测定为植酸酶在不同温度下处理1小时，在37'C下进行酶活测定。酶反 应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为58'C。酶的热稳定性实验表明(图3)， 60'C处理1小时后，剩余酶活为65%， 70'C处理1小时，酶活基本丧失。而野生型植酸酶， 6(TC处理1小时后，剩余酶活为39%， 65'C处理1小时，剩余酶活为20%， 70。C处理1小 时，酶活基本丧失。
3) 环化植酸酶和野生型植酸酶的外肽酶抗性测定比较
环化植酸酶和野生型植酸酶的外肽酶抗性测定在Tris-HC1 (pH 7.0)缓冲液体系， 加入羧肽酶Y， 25'C处理12小时。测定结果(图5)表明，25'C处理12小时后，环化植 酸酶没有发生降解，而野生型植酸酶受外肽酶作用，发生了部分降解。实验说明环化的 植酸酶对外肽酶降解有明显的抗性。
序列表说明
SEQ ID N0:1是环化酶多肽序列的的前5个氨基酸 SEQ ID N0:2是环化酶多肽序列的最后5个氨基酸
SEQ ID NO: 3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的中性植酸酶基因phyc的基因序列。
SEQ ID N0:4是dnaE的基因序列
SEQ ID N0:5是从SEQ ID NO:3推导出的phyc编码的氨基酸序列。序列表
<110>中国农业科学院生物技术研究所
〈120〉提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化植酸酶
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211〉 5
〈212> PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 1
Cys Phe Asn lie Ser 1 5
<210> 2 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213〉人工序列<400> 2
Lys Phe Ala Glu Tyr 1 5
<210〉 3
<211> 1194
<212〉 DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
〈400〉 3
tgcttt犯catatccaccggtcttaagcttaagcaccatcatcatxatca60
ctgtccgatccttatcattttaccgtgaatgcggcggcggaaacggaaccggttgatacg120
gcaggtgacgcggctgatgatcctgcgatttggctggatcccaagactcctcagaacagc180
cgaccaat犯犯aatcaggtttagtcgtttacagccttgatggta卿tg240
cttcattcct￡LtMt3CCgggaagctgaactccgttatgsttttccgttg300
cgcggcagca,tccaatcgctctgsagga^■ataccatt360
gatal:tt:acgccattgacggga犯aacggcgcattacagatccagaccat420
ccgattgcatcggc朋t.t犯tgaggteitacggttttaccttataccacag480
acgcgatggtgacaggg犯ag郷gtgaatcgaattaaag540
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已cggaagggatggcagc聊cgatgaatacggcaggctttatatcgcaga卿卿tgag660
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10cagacggaattgacgttctgggtttcggacttgggcctgaatatccgttc960
ggtatttttgtcgcacaggaatagatcacggcca^aaggccaatcaaaat1020
cttaaaatcgtgccgtgggagatc3犯tcggcttccgcccgctggcaaat1080
a皿caggttgacccgagaaaactgaccgacaactggttcggcgtggtagc1140
3tCg8t肌CCtcgggatcgaacgctcgagaaatttgctga1194
〈210〉 4
〈211〉 477
<212〉 DNA
〈213〉集胞蓝细菌(Syriechocystisspecies PCC6803)
<400〉 4
atggtta^gttatcggtcgtagatctctgggcgtgcagcgcatctttgatstcggtctg60
ccgcaggaccataactttctgcteigcc38Cggcgctatcgcagctaactgcctgtctttt120
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gcccaatggc;atg獄gggg卿gcagg犯gtattgg^tatgaattgga300
gtaatccgagctacctctgaccaccgctttttaaccaccgattatcaactgttggcgatc360
ttgctaggca已C"tgg3Cttggcaaactgaa420
g肌gctcttgtcttccctttccattacttgaCgCtggg￡lC477
<210〉 5<211> 398<212> PRT
<213〉 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 5
Cys Phe 1
His Lys
Ala Glu
Ala lie
50 Thr Asn 65
Leu His
Asp Phe
Arg Ser
Asn Gly 130 Ala lie 145
Gly Lys
Asn lie Ser Thr Gly Leu Lys Leu Lys His His His
His
Thr 35 Trp
Ser
Pro
Glu 115 Thr
Tyr Glu Leu
Arg Ala
Phe 195
Lys
20
Glu
5
Leu
Pro Val
Ser Asp Pro Asp
Leu Asp Pro Lys Lys Ser
Tyr
Leu 100 Gly
Asn
85
Asn
Gly 70 Thr
Gly
Lys
55
Leu
Gly
Lys
Thr 40 Thr
Tyr
25
Ala
10 His
Phe Thr Val
Gly Asp Ala
Pro Gin Asn
Val Val Tyr Lys
Lys Asn Thr
Leu Gin Ser
Asn Glu Val
Tyr Tyr
Lys 180 L'ys
Ala 165 Ala
Tyr 150 MET
lie 135
Gly
Lys
lie 120 Thr
Leu
Val 105 Asp
Asn 90 Asp
Ser
75
Asn
Phe Thr Leu
Val Thr Gly Asp Lys Asn
MET Asn Ser
Gin 200
Gly 185 Thr
Lys 170 Tyr
Ser
60
Leu
Ala
45
Lys
Asp
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30
Asp
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15
Ala
His
Ala
Asp Pro
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Val Asp lie
lie Ala Ala
lie Tyr Ala Asp Pro Asp
Tyr 155 Glu
His 140 His
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Ala 110
Asp
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95
Ser
MET
80
Tyr
Asn
Gly Lys
lie Ala Ser
Ser Gin Lys Gly Glu Phe
lie Ser Gly
Glu Gly MET Ala 205
Lys 190 Ala
Glu 175 Lys
Thr 160
Gin
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Asp AspGlu Tyr Gly Arg Leu Tyr lie Ala Glu Glu Asp Glu Ala lie Tr pLys
215
Gly Gly Ser Asn
Tyr210
Ser Ala Glu Pro
Phe225
Ala Asp Gly Arg
Tyr Ala Ala Asp260Ala
His245Gly
Asp230
Leu Thr Pro Asp
Glu220
Thr Val lie Asp
Gly235
Glu Gly Leu Thr
Ser Ser Tyr275Arg
Asp
Lys
Tyr
lie Thr Asp
lie
GlyAsp
lie250
MET Ala Ser Ser
Tyr Leu265
Lys Gly Gin Asn
lie255Gly
His240Tyr
Asn
Phe290
Gly lie Asp Val
Arg280
Pro Glu Thr Asp
Gin270
Tyr Val Ala
Asp305
Gly lie Phe Val
Gly295
Gly Phe Gly Leu
Lys285
Thr Ser Asp Thr
Leu310
Gin Asp Gly Glu
Ala325
Leu Lys lie Val
Ala Asn Gin Asn340
Arg Pro Leu Ala
lie Gly Phe355
Arg Ser Gly I」ys
Pro345Lys
Asn330Trp
Gly315lie
Gly300
Pro Glu Tyr Pro
Thr
Gly
385
Asp370
lie Glu Gly Arg
Gly390
Leu375
Thr
Asn360
Val Arg Arg Gly
Leu Glu Lys Phe395
Asp His GlyGin Val Asp
Glu Arg lie
Gin335Asp
Phe320Lys
Gin
Ser380Ala
Pro365lie
Glu
Ala350
Arg Lys Leu
Asp Asn LeuTyr
权利要求
1.一种环化的酶，其特征在于，其多肽序列的前5个氨基酸具有SEQ ID NO1序列，最后5个氨基酸具有SEQ ID NO2序列；且酶蛋白的N、C两端相链接。
2. 权利要求l所述环化的酶，所述酶蛋白的N、 C两端相链接，是通过内含肽介导的环化方法，用天然的肽键将酶蛋白的N、 C两端链接起来。
3. 权利要求l所述环化的酶，是植酸酶，编码该酶的基因具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
4. 一种重组大肠杆菌细胞，含有SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的基因。
5. —种环化酶蛋白的方法，包括表达载体的构建、重组字的筛选及环化分子的鉴定方法，其特征在于将编码权利要求1所述多肽的基因在大肠杆菌中的环化表达。
6. 权利要求5所述的环化酶蛋白的方法，是利用天然集胞蓝细菌(Synechocystisspecies PCC6803) Ssp DnaE内含肽的转剪接特性，分别于体内体外对蛋白质环化。
7. 权利要求5或6所述的环化酶蛋白的方法，在大肠杆菌中的环化表达的基因是IDN0:3所示序列的基因。
8. 权利要求6所述的环化酶蛋白的方法，所述Ssp DnaE内含肽的基因具有如SEQ IDN0:4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化酶，本发明还涉及对蛋白酶进行环化以提高其性能的方法。本发明利用天然内含肽转剪接环化蛋白质，环化后的蛋白质具有更好的热稳定性和蛋白酶抗性。本发明还提供了含有本发明的植酸酶基因的重组大肠杆菌细胞。
文档编号C12N9/16GK101638642SQ20081011759
公开日2010年2月3日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者平淑珍, 维 张, 敏 林, 燕永亮, 赵仲麟, 伟 陆, 明 陈 申请人:中国农业科学院生物技术研究所