专利名称：改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒学和分子生物学领域，涉及一株利用我国成功研制的麻疹减毒活疫苗 毒株基因组进行野毒株血凝素基因片段替换后并构建感染性克隆的制备方法、克隆编码区 序列替换方法以及它们在疫苗研究中的应用。
背景技术：
麻疹病毒(Measles Virus, MV)是副粘病毒科麻疹病毒属(morbillivirus)成员，是一种 不分节段的单股负链RNA病毒，也是在全世界引起高度传染性疾病的病毒之一，通过呼 吸道飞沫小滴，或者接触感染。易感人群对麻疹的发病率几乎达到100%，大部分感染者 能完全恢复，但少数能引起严重的呼吸道或中枢神经系统并发症。长_47 (CC-47)疫苗株为我国自主研制的疫苗株，起源于1957年分离的Leningmd-4 株麻疹病毒，经人肾细胞传26代、人羊膜细胞传47代以及鸡胚成纤维细胞传若干代后逐 渐适应减毒而成(Rota, J.S., Wang, Z.D.， Rota， RA. ,and Bellini， W丄1994. Comparision of sequences of the H， F and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research 31 : 317-330)。麻疹疫苗的有效性和安全性已经得到明确的肯定，然而世界卫生组织全球消灭 麻疹的努力仍然一直没有停止，对于其主要原因业内比较一致的认识 一是麻疹免疫计划 没有得到严格的贯彻执行，二是麻疹病毒新流行株的基因变异也在部分影响疫苗的免疫效 果。在1998年之前，从来没有一个标准的命名方法来描述野生型麻疹病毒基因的变异特 征。1998年的春天，WHO (世界卫生组织)举行的一个会议上阐述了这个问题，该建议 在2001年的会议上进一步得到完善。目前己采纳了一个统一的基因分型命名标准，以便 在不同的实验室进行比较。麻疹病毒N蛋白羧基末端450个核苷酸和HA蛋白核苷酸序 列变异程度最高，可用来鉴定基因型别。依据WHO麻疹病毒基因分型标准，相近毒株间 HA蛋白基因序列差异<2%， N蛋白基因羧基端450nt序列差异< 2.5 %，可以列为同一 基因型(WHO. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild type measles viruses ( update) part I .WER ，2001 ,76 : 249- 2511 )。 WHO当前已认可了麻疹病毒8个进化 分支，命名为A、 B、 C、 D、 E、 F、 G禾BH。在这些分支中目前已有20个确认的基因型 和2个建议的新的基因型(g3和d9)。这些基因型是A， Bl， B2， Cl， C2， Dl， D2，D3， D4， D5， D6， D7， D8， E， F， Gl, G2， Hl和H2。除F基因型外，其它每个基因 型均有一个参比株代表最早的病毒分离物，这些参比株序列可以在GeneBank或WHO Strain Bank中获得，近期分离的病毒株序列便可与WHO的这些参比株序列进行比对以确 定其基因型。当前所有国内外使用的麻疹疫苗株病毒均为A基因型，也包括中国使用的长-47疫苗 株。尽管中国长-47麻疹疫苗和美国麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗(MMR)人群免 疫后血清能中和中国现流行的麻疹H1基因型，说明现有麻疹疫苗对中国现流行的麻疹病 毒能起到保护作用，但也应注意到这些疫苗免疫血清中和中国株的滴度低于中和Edm和 Chi21株滴度的2 5倍(World Health Organization. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update) Part II. Wkly Epidemiol Rec, 2001, 76: 249-251)。因此，麻疹病毒减毒与其基因变异密切相关，有必要从分子病毒学上深入研究 这种变化，确定疫苗株减毒的分子病毒学特征，筛选免疫保护好的毒株制备麻疹疫苗。并 且，主要在中国流行的HI基因型麻疹病毒的型内基因变异还在继续，也可能还有未发现 的H1亚组病毒还在流行。许文波等通过对中国4个省流行的麻疹病毒基因型进行监测研究，发现了2个在中国 流行的新基因型，即H1、 H2基因型，其中中国绝对优势基因型为H1基因型，H2基因型 由越南输入。HI基因型被划分为3个亚型Hla、 Hlb、 Hlc。近年来中国麻疹病毒基因 型的流行特征Hla为绝对优势基因亚型；Hlb处于弱势，2005年只在河北省发现；Hlc几 近消失(张燕，许文波，朱贞等，中国2003年流行的麻疹野病毒分子流行病学分析，中 国计划免疫，2005， 11(3): 1-101)。 1998年WHO将China93-7确定为H基因型代表株， 2001年WHO又将H基因型中的12株命名为HI基因型(China93-7为代表株)，1株命 名为H2基因型(China94-1为代表株)。对病毒基因组的研究是在70年代分子生物学技术发展并得到广泛应用之后才兴起的。 到19世纪80年代为止，单股负链RNA病毒家族不少成员的基因序列得以测定，从而促 使了利用负链RNA病毒cDNA进行病毒拯救的反向遗传学研究的兴起，也导致了利用其 研究病毒致病机制、持续性感染、疫苗减毒机制以及研制新型疫苗和构建病毒表达载体等。 尤其是病毒的非编码区序列(基因组末端及结构基因间非编码区)具有顺式调节元件功能， 能指导下游基因的转录和复制，对于构建病毒感染性克隆及表达载体具有非同寻常的意 义。李德新等在完成CC-47麻疹疫苗株非编码区序列测定的基础上(胡孔新，李德新等， 麻疹病毒CC-47株非编码区核苷酸序列测定与比较，中华实验与临床病毒学杂志，2001,15 (4): 327-331)，又利用该病毒全基因组构建了长-47麻疹病毒感染性克隆(胡孔新，李 德新等，麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究，病毒学报，2004， 3: 210-212)。发明内容为了构建新一代符合现有麻疹疫苗流行株的疫苗病毒，本发明基于中国现有麻疹疫苗 株及流行株基因型现状分析以及我们已经建立的麻疹病毒感染性克隆技术平台，在已经构 建的我国的长-47减毒活疫苗株感染性克隆和掌握的病毒拯救技术基础上，利用该疫苗病 毒全基因组全长cDNA克隆进行中国现有主要流行株(Hl基因型，代表株为China93-7) 主要表面抗原基因(H基因)的替换改造，获得新的组合型麻疹病毒全长cDNA克隆，并 通过一系列病毒拯救技术获得感染性病毒颗粒。本发明的一个目的在于构建一种麻疹病毒全基因组克隆，其含有编码一种改造型长 -47株麻疹病毒的全长反基因组正链RNA的核苷酸序列(以下简称为"改造型麻疹病毒 cDNA序列")，即该克隆中包含有麻疹病毒长-47株全基因组主要cDNA，其特征是，其全 基因组cDNA中，H蛋白编码基因被麻疹野毒株或流行株病毒的H基因替换，以提供一种 含有以Hl基因型麻疹病毒流行株H蛋白基因替换的改造型长-47株麻疹病毒全基因克隆， 替换的基因片段优选为流行株麻疹病毒H1基因型(代表野毒株China93-7) H蛋白基因 编码区。从NCBI可査询到麻疹病毒长-47株全基因序列(ACCESSION: EF033071)以及中国 流行株HI基因型代表株的H基因序列(ACCESSION: AF045201 )。经China93-7毒株H 蛋白基因编码区替换后的改造型麻疹病毒全基因cDNA序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。进一步的，本发明的麻疹病毒全基因组cDNA克隆还含有与上述改造型麻疹病毒 cDNA序列操作性相连的异源表达控制序列，在该异源表达控制序列的控制下，从所述 cDNA转录出麻疹病毒的全长反基因组正链RNA。这样的异源表达控制序列主要指位于所 述cDNA序列的5'末端的RNA聚合酶启动子，优选T7启动子(T7 promoter)。进一步的，为使转录出来的RNA具有精确的3'和5'末端，所述麻疹病毒全基因组 cDNA克隆还包含一个与改造型麻疹病毒cDNA序列3'末端最后一个核苷酸紧邻的丁型 肝炎病毒核酶序列；在丁型肝炎病毒核酶序列之后往往还包含T7RNA聚合酶终止子(简 称T7终止子，T7 terminator)。6本发明的另一个目的在于提供一种对重组的改造病毒进行拯救，制备感染性麻疹病毒 颗粒的方法，以应用于麻疹病毒疫苗的制备或病毒检测。本发明的制备感染性麻疹病毒颗粒的方法，包括以下步骤1) 用带有异源表达控制序列的上述改造型麻疹病毒全基因组cDNA克隆导入带辅助 系统的宿主细胞中，所述辅助系统能表达麻疹病毒反基因组正链RNA转录、复制和包壳 所需的蛋白质；2) 培养并回收所表达的病毒颗粒。 根据这种方法的一特定实施方案，其包括1) 构建改造型麻疹病毒cDNA克隆，含有编码麻疹病毒全长反基因组正链RNA的 核苷酸序列，以及与该核苷酸序列操作性相连的RNA聚合酶启动子；2) 构建一个或多个支持克隆，含有麻疹病毒的N、 P和L蛋白的编码序列及与这些 序列操作性相连的RNA聚合酶启动子，编码N、 P和L蛋白的序列可以在同一个 支持克隆中或在不同的支持克隆中；3) 用步骤l)和2)构建的克隆共转染宿主细胞，所述宿主细胞含有对应于改造型麻 疹病毒cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶；4) 培养转染的宿主细胞，并回收改造型麻疹病毒颗粒。在一个较佳的实施方式中，在用改造型麻疹病毒cDNA克隆和支持克隆转染宿主细胞 之前用表达RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染宿主细胞，更佳的是利用T7启动子和表达 T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(例如重组痘苗病毒VTF7-3)。本文所用的术语"克隆"指可以导入细胞并表达的双链DNA。克隆可以是病毒载体 形式，优选质粒形式。本发明提供了一种生产改造型麻疹病毒的系统，在于通过基因重组技术改造，以一种 安全、有效、广泛使用的预防麻疹的麻疹病毒减毒活疫苗株长-47株的全基因克隆质粒为 基础，对该质粒中的H基因片段进行替换，替换的基因片段优选为流行株麻疹病毒H1基 因型(代表野毒株China93-7) H蛋白基因编码区。本发明可直接运用已经公开的RNA 病毒反向遗传技术在cDNA水平上进行改造型长-47病毒拯救，并获得有感染性的改造病 毒，从而极大的方便了新型病毒株的复制、增殖以及包装的研究，并导致新型麻疹减毒活 疫苗的出现。该改造优选但并不限于使用中国流行株麻疹病毒Hl基因型的代表株 China93-7，生产出的新型感染性病毒具备流行株的血凝素抗原，具有更适合的麻疹减毒活疫苗的应用价值。与现有技术相比，本发明具有以下优点-① 在本发明提供的改造克隆的基础上，可以通过基因操作技术，替换其他基因型的流 行株(不限于H1基因型)的H基因片段，以通过病毒拯救，开发出适应不同抗原 变异需要的候选麻疹病毒疫苗株；② 本发明提供的基因替换操作方法，还适用于对该克隆中麻疹病毒其它编码区基因进 行基因替换操作，如N蛋白基因、F蛋白基因以及P/M蛋白基因等，以研究麻疹 病毒不同基因的表达能力，及其对于新病毒生成的影响，新生病毒具有应用于病毒 诊断试剂的开发价值，也具有新型疫苗应用的价值。③ 本发明提供的基因替换操作方法，通过不同基因型麻疹病毒基因的多片段替换，以 及生成的新病毒具有适合多基因型麻疹病毒流行的通用疫苗价值。 鉴于负链RNA病毒载体的优点，及其可以为进一步的研究如致病机理、减毒机理 提供研究平台的前景，广泛使用的麻疹病毒减毒疫苗株所具有其无可比拟的优势。 本发明还可以直接指导构建仅有以病毒非编码区序列替换为主导的病毒拯救技术， 对于阐明麻疹病毒调控序列作为顺式调节元件控制外源基因转录、表达以及复制和 包装系统的评价具有重要的应用价值。⑤将长一47减毒活疫苗株病毒的所有非编码区序列，P、 M编码区序列及其编码的蛋 白质的氨基酸序列与国外野毒株、疫苗株病毒基因组相应位置进行比较，从基因和 蛋白水平来阐明长一47减毒活疫苗株与国外野毒株及疫苗株之间的异同和相应的 功能改变，可以研究疫苗的减毒机制，细胞培养适应机理以及寻找强弱毒株间的分 子标记，从而为麻疹病毒的分子流行病学调査提供参考。
图1质粒pRZ-mvfull-reH的结构示意图。图2质粒pRZ-mvfiill-reH插入结构的序列示意图。
具体实施方式
长-47感染性克隆构建及病毒拯救技术参见文献(胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长 正链cDNA的构建及感染性研究.病毒学报，2004， 3: 210-212)，本发明内容部分涉及的 质粒、引物名称及序列可以参照该文献。简述如下首先通过酶切分析和克隆策略优化，8通过用RT-PCR方法分段扩增长-47疫苗株的全基因，并分别克隆到质粒载体中并进行DNA 序列分析和鉴定，然后通过一定梯次的克隆步骤得到含有该病毒所有非编码区序列以及编 码区的全基因序列。对于克隆的改造，关键在于对中间质粒pMVMl-2S的下一步克隆过程进行，另外提 供一个含有Hl基因型野毒株麻疹病毒H蛋白基因的片段的克隆质粒，然后通过酶切替换 并进行方向鉴定和序列分析获得。实施例1麻疹病毒长-47全长cDNA克隆的构建根据文献"胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究.病毒 学报，2004， 3: 210-212"记载的方法构建含有麻疹病毒长-47株全基因的中间质粒 pMVftill-2S，具体是经传统生物学方法研制的麻疹病毒长-47疫苗株为鸡胚成纤维原代细胞培养生产(由 长春生物制品研究所提供，为商品疫苗，批号为9812445)。从该疫苗病毒感染的细胞提取 全细胞RNA，以随机引物逆转录成cDNA，并以此为模板，用DNA多聚酶链式反应(DNA Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增长-47病毒基因组cDNA。然后克隆、拼接麻疹病毒 疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列，并精确的置于T7启动子控制下和丁型肝炎病毒核 酶序列及T7终止子序列之前并进行序列测定鉴定，获得中间克隆质粒pMVfull-2S。具体克隆策略及过程参见文献，所涉及的基础插入载体为pBlueScriptSKII (+)(购自 德国默克公司)。首先对pBlueScriptSKII (+)进行质粒改造，主要是以引入核酶序列以及 T7终止子序列为目的以质粒为pT7Ribo (中国疾病预防控制中心病毒病毒病预防控制所 保存，含有核酶序列和T7终止子序列)为PCR扩增模板，以引物5' -AGC TGC GCG CAC GCG TCA GCT ATG ACC ATG ATT ACG -3'和5， -AGC TGC GCG CTC GAC TCT AGA GGA TCC CCA -3' 扩增核酶序列和T7终止子序列，并通过引物设计在5'和3'端各引入一个BssHII限制性酶切位点，扩增产物BssHII酶切后直接克隆到同样酶切的质粒pBlueScriptSKII中，形成 质粒pRZ。核酶序列和T7终止子序列的来源并不局限于pT7Ribo质粒，任何含有该片段 的质粒、DNA片段都可以作为PCR扩增的模板，或者直接通过基因合成等本领域中熟知 的分子克隆方法获取该片段，插入载体的该片段完整序列参见图2。然后按照文献(胡孔新，李德新等，病毒学报，2004， 3: 210-212)所公开的引物对 麻疹病毒长-47进行分段PCR，并按照步骤逐步插入pRZ中，最终获得含有两个BssHII 酶切插入位点的中间克隆质粒pMVfull-2S 。实施例2麻疹病毒China93-7野毒株H基因片段的获得野毒株麻疹病毒China93-7以B95a细胞(购自美国ATCC)培养并收获病毒感染细胞， 以TRizol (购自美国Invitrogen公司)从感染细胞提取全细胞RNA，随机引物合成cDNA， 并以引物5，-GGT TGA TAG GGA TCC CCG CT-3，和引物5'陽CGG CCG AAC GGG GAA CCA CTT GGA CC-3，组合进行PCR扩增，PCR产物含有病毒China93-7病毒H基因的克 隆片段。扩增产物直接克隆到pGEM-T载体(购自美国Promega公司沖，再分别以BamHI (插入麻疹病毒片段中的位点)和Notl (载体上的酶切位点)酶切，并回收插入的小片段， 该片段主要为H基因片段。实施例3改造型麻疹病毒全长cDNA克隆质粒的构建以引物Dl (5，-ACG CGT ATC TGG CGC CCT ACA GCT CAA CTT ACC TGC-3，)和 C2 (5，-CGG CCG AAC GGG GAA CCA CTT GGA CC-3 ， ) PCR扩增长-47病毒cDNA，产 物直接克隆到pGEM-T载体(Promege公司)中，获得质粒pGEM-cc47-Spel，分别以BamHI (插入片段中的位点)和NotI (载体上的酶切位点)酶切质粒，回收载体大片段，并将实 施例2中最后获得的酶切片段回收产物克隆至质粒pGEM-cc47-Spel的BamHI和Notl酶切 载体中，获得新的含有China93-7 H基因片段以及麻疹长-47部分基因的重组质粒 pGEM-cc47-937H-Spel，以Spel直接酶切pGEM-cc47-937H-Spel，回收插入片段(大片段， 约5.8kb)，再克隆到同样以Spel酶切pMVfoll-2S后回收的载体大片段中，最终获得的质 粒pRZ-mvMl-reH，含有完整的改造替换H蛋白基因的CC-47株cDNA序列，并在T7启 动子控制下(参见图1和图2)。对pRZ-mvfUll-reH所有酶切接头部位进行序列测定分析， 确保正确，并将重组的克隆菌种(含pRZ-mvfull-reH的DH5a)保存于-70。C。实施例4改造型麻疹病毒颗粒的获得实施例3获得的pRZ-mvfull-reH质粒可以在麻疹病毒CC-47株结构蛋白N、 P、 L编 码区瞬时表达质粒以及表达T7 RNA聚合酶的辅助重组痘苗病毒VTF7-3的作用下，通过 病毒反向遗传学拯救技术获得同一细胞中四质粒RNA的转录、表达，并最终获得了具有 感染性的麻疹病毒。以构建pRZ-mvftill-reH质粒进行病毒拯救的过程，转染入B95a细胞 用常规的脂质体介导的转染法，具体可采用lipofectAMINETM2000试剂盒(购自Invitrogen 公司)进行转染1) 麻疹病毒N、 P、 L蛋白瞬时表达质粒的构建参见文献"胡孔新，李德新等.麻疹病毒全长正链cDNA的构建及感染性研究.病毒学报，2004， 3: 210-212."构建 并制备pcDNA-N、 pcDNA-P 、 p3Z-L质粒DNA。以上三个质粒中病毒蛋白N、 P 和L的基因均在T7启动子控制下。2) 在转染前一天，用无抗生素DMEM培养基将B95a细胞传代到6孔板，细胞密度 达到90-95%单层(约16-24小时)，进行转染。3) 转染前lh，取重组痘苗病毒VTF7-3 (中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所保 存，该病毒为已公开的整合有T7 RNA聚合酶基因并在病毒感染时可以于感染细胞 胞桨内表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒)，感染细胞(moi=10)吸附lh，期间 轻柔摇动几次，使液体漫过细胞面。4) 在毒种管内进行配液操作将0.8-1 pg混合质粒DNA(pcDNA-N、 pcDNA-P、 p3Z-L 和pRZ-mvfull-reH质粒)加入50)^1 OPTIMEMI (购自Invirtogenl公司)中，然后 将2-3pl lipofectAMINE试剂加入OPTIMEMI中，5min后两者混合均匀，室 温放置20min。5) 用无血清和抗生素的DMEM培养基清洗培养板中的B95a细胞2次，每孔0.5ml 无血清和无抗生素的DMEM培养基。6) 将第4)步中混合好的含目的质粒及lipofectAMINE的混合液轻轻加入到细胞清洗 过的，无血清和无抗生素的DMEM培养基中。7) 轻轻混匀后37°C ， C02培养箱中培养6小时后，加入含10%小牛血清的DMEM完全培养基。8) 细胞37'C培养16小时后封好细胞培养板，42'C热休克1小时。9) 换含100|ig/ml阿糖胞苷的完全培养液抑制痘苗病毒增殖，继续37'C培养48—72h。10) 冻融细胞收获毒种后准备继续感染细胞，该细胞裂解物种含有重组的改造病毒。尽管为说明目的公开了本发明的具体实施例和附图，其目的在于帮助理解本发明的内 容并据以实施，但是本领域的技术人员可以理解在不脱离本发明及所附的权利要求的精 神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例和附图 所公开的内容。序列表(SEQUENCE LISTING)<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120>改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制备<130> JSP080224<160> 1< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 15894<212> DNA<213> 麻疹病毒(morbillivirus)<400> 1gttgggtaagg3tsgttc33tC33tgstc3tcttctsgtgcscttsggst60gsttsgggst3tccgsg3tggccscacttt120taaggsgcttsgcsttgttc3gg3c333cc3CCC3tt3C3tcsggstccg180gtggsgccstC3gsgg33tcttstsgtscc33tccctggag3ttcctc33240ttaccactcgatccagacttctggsccggttggtcaggttccggstgtg3300gcgggcccaagc3ct33tsggta七3ttatccttatttgtggsgtctccsg360gtcaattgattcsgsggstc3ccgstg3ccctgacgttsgcstssggctgttsgsggttg420tccagsgtgscc3gtcsc33tctggccttaccttcgcstcaagaggtaccaacatggagg權atgaggcggaCC33t3Cttttc3cstgstgtagtgatcaatccsggttcg540gstggtttgs3tctcagst3ttgssgtgcssgsccctgsgggattcaaca600tgsttctgggt3CC3tCCt3gcccs33tttgggtcttgctcgc3ssggcggttscggccc660C3gscacggcsgctgattcgggtgg3t333gtsc3ccc33720tagttggtgssttt3gattgggttggatgtggtgsggsscsggsttgccg780aggacctctcctt3cgccgsttcatggtcgctctsstcctggst3tc3sgsgsscacccg840csggsttgctgtg3C3ttgsgtsgsggcsg900gattagccsgttttatcctgsctattasgtttgggstsgsaact3tgtstcctgctcttg960gactgcstgsatttgctggtgsgttstcc3C3cttgagtccttgstgsscctttscc3gc1020aaatgggggs3sctgc3ccctacatggt3atcctgg3g33ctcaattcag1080gtgcaggstcstaccctctgctctggsgct3tgccstggg3gt3gg3gtg11403Ctccstgggsggtttg3sctttggccgatcttsctttgatccsgc3t3ttttsgattsg1200ggt33ggsggtcagctggaa3ggtc3gttccacattggcatctg33ctcg1260gtstc3Ctgccg3ggstgc3sggcttgtttcsgsgsttgc3Ctg3ggsc31320agcggttggacccssgtstc3tttCt3C3Cggtgstcaaa1380gtg3g33tg3gctaccgagattggggggcsgsgggtcs33csgsgtcgsg1440ggsgsgctscagagaaaccgggcccsgcsgagcaagtgatgcgsgagctg1500CCC3tCttCC33ccggcsc3cccctsgcc3ttgscsctgcatcggagtcc3gcc33g3tc1560cgcsgg3C3gtcg33ggtc3gctgscgccctgcttsggctgcasgccstggcsggsstct1620sggctcsgsc3cgg3cscccct3tsgtgt33stcttctag1680actaggtgcgsgaggccgagscaitccgcct3CCCtCC3tCsttgtt3t3317403sccsggtccacacagccgcC3gcccstc3atccstcc3Ctcccscgattg1800gsgccgstggggcscgccstgtC33333Cggactggaatgcstccgggct1860ctcssggccgsgcccstcggctcsctggccatcgaggaagctstggcsgcatggtcagaa1920ggsgcgsgcc3cctgcsggg3ggcsgttcg1980ggtctcsgc333ccatgcctctcsgcasttggatcaactgssggcggtgc3cctcgcstc2040cgcggtcsggg3cctgg3g3gsgcgstgscgscgctg333ctttgggaatCCCCCC33g3210033tctcc3ggcatcaagcactgggttsc3gtgtcattstgttt3tgstc3csgcggtg332160gcggttsaggtgctg3ctctstc3tggttcaatcsggccttgstggtgst222033C3CCCtCtcsggsgg3g3C33tg33tctg3333c3gcgatgtggatattggcgsscct2280g3taccgsgggatstgct3tcsctgsccggggatctgctcCC3tCtCt3tggggttcagg2340gcttctgstgttgassctgcgsgstccscgsgctcctgsg3ctccsatcc24003ctttccg33gcttgggas33CtCtC33tgttcctccgcccccggacccc2楊ggtsgggcc3gcscttccggg3csccc3ttcsgscgcgsg3ttsgcctc32520tttggaacggagstcgcgtctttsttgacaggtggtgc33cccs3tgtgctcgs33gtc32580ccctcggaacC3tc3gggcc3ggtgc3cctgcgggg33tgtccccgsgtgtgtgagcaat2640gccgcactgstscaggsgtggscacccgastctggtsccaC33tCtCCCCg3gatcccsg2700ct3tt3tgstgstgsgctgttctctgstgtccaagatatt2760aaaacagcct七33tCtCC33gct3gs3tc32820ctgctgttsttgaagggagasgttgsgtC3gC3333t3tC28803gc3t3tccsccctggssgg3C3CCtCtC3tcgccsttcctggacttggg29403cgscccc3ctgcsgatgtcg333tC33tCccgscttgss3cccatcait33000C3ggccgsgc3ctggccgs3gttctC33g3aacccgttgccsgccg3C333060ctccaaggaa3cggsccsgttccsgaggacsgctgctg33gg33tttcsg3120ct333gccgsgstgsgctcsgccgtcgggtttgttcctgsC3ccggccct3180gc3tC3cgc3gtgtaatccgCtCC3tt3t3333tccsgccggctsgsggaiggstcggssg3240cgttscctg3tgactctccttgstgststcatgstcttgcc33gttcc3c3300cagatgctgsct3C3gctcs3cttscctgccsaccccatg3360cc3gtcgsccC33ct3gtsc33CCt333tCC33agtgatt3420gcctcccs3gttccsc33tg3csgsg3tct3cgscttcgaC33gtcggcstgggacatC33480asgggtcgstcgctccgstsC33CCC3CC3cctsc3gtg3tggcsggctggtgccccsgg3540tcagagtcst3gstcctggtctsggcgscsggssggstgai3tgcttt3tgtsc3tgtttc3600tgctgggggttgttgsggscsgcgstcccct3gggcctccaatcgggcgagcstttgggt366013ccctgcccttsggtgttggcC3ssgcccg33333CtCCtC3720ctgagcttgaiC3tagttgttagscgtaicagcsgggctcs3tgs333sctggtgttctaca37803C33C3CCCC3Ct33CtCtCCtC3C3CCttgg3g333ggtgggagtgtct3840tC33CgC333ccaagtgtgcsatgcggcta3tctgstsccgctcgataacccgcsgsggt3900tccgtgttgtttststgsgc3tcscccgtctttcggst33cgggtattacsccgttcct33960g33g33tgctgg33ttcsg3tcggtc33tgcsgtggccttC3scctgctggt33ccctts4020gg3ttg3CS3ggcgstsggccctggg33g3tC3tCg3C33tacsgagcaacttcctgagg權0C33C3ttt3tggtccscstcgggs3cttcsgg3g333g33gsgtgssgtctactctgccg41403tt3ttgC33gcctggtttttgcacttggtggg3tsgggg4200gc3cc3gtcttc3C3ttsgssgc3C3ggc3gsctctccatgc3C3sctcg4260ggttcsag33gsccttstgttscccgctg3tggatatc33tgssgscctt33tcgatt3c4320tctggsggsgcagatgcaagtccsggcsgttttgcagccatcsgttcctc4380cattt3cgacgscgtgstcscc3sgg3Ctsttcs3agttc4440tgtsgaiccgtsgtgcccsgc3stgcccg3333cg3cccccCtC3C33tg3csgccsgsag4500gcccggsc3333333CCCCCtccgaaagactccscggscc33gcg3g3ggccsgccsgc34560gccgscggc3sgcgcg33csccsggcggcc3csgccccgsC3csaggcca4620cc3CC3gccscccc33tctgcstcctcctcgtgggscccccg3ggscc33cccccsaggc4680tgcccccgstCC333CC3CC33ccgcstccCC3CC3CCCC3cccccsgc34740sctggsaggcccctccccctctccctcsacC3C33CCg33ccgcacaagc糊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,ctgasctctcaagccatcgaC33tctg3g3gcgagcctggtcsggc33tt5940g3ca3tc3gggcaggagatgst3ttggctgttcsgggtgtCC33g3Ct3C6000agctgataccgtctatgaacC33Ct3tCttgtgatttaatcggccagsag6060ctcgggctcs33ttgctcsggssstcctgtcattatttggccccsgctt36120cgggscccc3tstctgcggsgststc'tstccsggctttg3gctstgcgcttggsggagsc61803tc33t3sggtgttagaaaagctcggatacsgtggsggtgstttsctgggcstcttsgsg6240t333ggcccgg3t33CtC3CgtcgscscsgsgtcctscttC3ttgtcctc6300sgtstsgcctatccgacgctgtccgagattaagggggtgattgtccaccggctsgagggg6360gtctcgtscs3cstsggctctcssgsgtggtst3ccsctgtgccc33gtstgttgcsscc6420C3sgggtsccttstctcg33ttttgstgsgtC3tcgtgtsctttcstgcc6480gtgtgcagccaaaatgccttgtscccg3tgsgtcctctgctccaagaatgcctccggggg6540tccscc33gtcctgtgctcgtsc3ctcgt3tccgggtcttttgggssccggttcstttt36600acctaatagccsattgtgcatC33tCCtttgc3sgtgtt3"60tgacaagatcCt33C3t3C3ttgctgccgstcsctgcccg6720gtsgtcgsggtg33cggcgtgscc3tcc33gtcgggsgc3ggaggtatcc3gscgctgtg6780tacttgcsc3gwttgscctcggtcctcccatatcattgg3gaggttgg3cgtsgggsc36840astctggggastgc33ttgctssgttggsggatgccaagg33ttgttgg3gtcstcggsc6900cagatattgaggsgt3tg33sggtttatcgsgc3ct3gc3tsgtct3C3tcctgsttgc36960gtgtgtcttggaigggttgstsggg3tccccgctttsat3tgttgctgcsgggggcgttgt7020gag33c33gttggtstgtcs3gscc3ggcctaaagcctgatctt3cggg37080cctatgtssggtcgctctgstCCtCt3C33CtCttg333C3C333tgtCC7140c3C33gtctcctcttcgtcstc33gcascc3CCgC3CCC3gc3tcssgcc7200tstctccggcttccctctggCCg33C33t3tcggtsgtts3gggtgc3sg72603tC3tCC3C33tgtcscc3cgatss3tgccttCt3C333g3t33CCCCC37320tccc33gggstcstt33csgsgs3C3tctt3tg3ttgst3gaccttstgt7380tttgctggctgttctgtttgtcstgtttctgsgcttgstcgggttgctsgcc3ttgcsgg7440C3ttag3cttC3tcgggcsgccatctacaccgcsgsgstctcagc3ccs37500tct3gstgt3tcg3gc3tcsggtc33ggscgtgttgsc3cC3CtCttC33756033tc3tcggtg3tgssgtgggcctgsggscscctcsgsgsttc3Ctgscc7620catctctgac七CCtt33tCCggst3gggagtscgactt33gsgstctcsc7680ttggtgtatc33cccgccsg3ttgg3ttstgtgcsgsitgt7740ggctgctg33gsgctcstgs3tgcsttggtctsctggsgsCC3g33C33C7800C33tC3gttCctsgctgtctctgctcsgggCCC3Ct3C33tcsgaggtca7860attctcssacatgtcgctgtccctgttsgscttgtattt3ggtcgsggtt3C33tgtgtc7920atctatagtcactatgacatcccagggastgtatgggggsacttacctag7980tsstctgsgccsgsgttgtcstgtsccgsgtgtttgssgt8040aggtgttstcsg333tccgggtttgggggctccggtgttcsctstcttga8100gc3sccsgtc3gt33tgstctc3gc33ctgtstggtggctttgggggsgctc33sctcgc8160agccctttgtcscggggssg3ttCt3tC3C33ttCCCt3tC3ggg3tcsgggss3ggtgt8220csgcttccsgctcgtcsagctsggtgtctgg333tCCCC3accgacatgcsatcctgggt8280CCCCtt3tC33cggstgstccsggctttscctctcstctc3C3gsggtgt834015tstcgctgsc3stgggctgtCCCg3C33C33cssgttgcg8400tgCttCC33Caggcgtgtaagggtaaaatccaagcactctgcgsgaatcc8460cgsgtgggcscc3ttg33ggataacaggattccttcstscggggtcttgtctgttgatct8520gsgtctgscsgttgsgcttstgcttcgggattcgggccattg3tC3C3C38580cggttcsggg3tggscct3tgtgtattggctgsctstccc8640gcc33tgs3g33cctsgccttaggtgtaatca3csc3ttggagtggataccgagattcaa8700ggttagtccct3CCtCttC33tgtCCC33tt33gg33gc3ggcgssgsctgccaitgcccc8760cctgcggsggtggatggtgatgtc33sctcsgttccs3tctggtgattct8820acctggtc33gatctccsst3tgttttggc33CCt3Cg3tacttccagggttgssc3tgc8880tgtggtttattacgttt3csgcccaagccgctcatttgcttscttttstccttttaggtt8940gcctst333gggggtccccai七Cg5L3tt3C3sgtggs3tgcttcsc3tggg9000ctggtgccgtcscttctgtgtgcttgcggsctcsgsstctggtggacatatC3CtC3CtC9060tgggstggtgggcatgggsgtcagctgcacagtcscccggg33gstggaa9120atsgggctgctsgtgssccs3tctcstgstgtcscccsgsC3tcsggc3t3CCC3Ct3gt9180tsgggtcc33gtggttccccgtt3tggact9240cgctstctgtC33ccsg3tctt3tsccctgaagttcacctagatagcccgatagttacca9300sgcc3tcctggsgt3tgctcgsgtccctcscgcttsc3gcctggsggscc9360ctacsctgtgtc3ga3cstc3sgcsccgcc3ttttCC33C9420tsaacaatgtggssgttgggaatgtcatcsagtccasgcttaggsgttstccggcccsct9權CtC3t3ttCC3t3tCC333ttgt33tcsgg3ttt3ttt339540cgaggssgatccgtgssctcgg3attcgctgt3ctccs33gtC3gtgst39600aggttttccsstgctt33gggscact33ctcscggcttggcctsggctccgasttgsggg9660ggagaaagttattsacttgggagtttsc3tgcscsgctccc3gtggtttg97203gccctttctgttttggtttctgsgstgsggtcsgtgatt9780cccat3cttgccstsggsgg3g3C3C3C3Cctgtsttcttcsctggtsgttcagttgagt9840tgctaatctctcgtgsccttgttgct3taagtctc3acstgt3tattscc9900tgscdtttgssctggttttg3tgtattgtg3tgtc3t3gsggggaggtta9960ccgctatgsct3ttgatgctsggt3t3csgagcttctsgg33g3gtc3g3tsc3tgtggs1002033ctg3tsg3tggtttcttccctgcsctcgggastccascgt3gccstgc10080tggsgcctctttc3cttgcttscctgc3gctg3gggst3tctcsgsggtg10140CtttCCtt33ccsctgctttstgstgttctgggttttctg10200ttstcstgsgttaattgaagctctagattaC3ttttC3t310260tacatctgac3gggg3g3ttttctcstttttcsg3sgtttcggcc3cccc10320gccteL3sgtceittgtgtstg10380sgactctgatg333ggtcstgccstattttgtggaatcsttatcgtgaca10440csgttggccaiccgctgaccctccccctgcstgctgcsgscac3atccgga10500atgctcssgcttcsggtgasgggtt33C3c3tgsgc3gtgcgttgaitssctgg333tctt10560ttgctggagtgaaatttggctgctttstgcctcttsgcctggatsgtg3tctgsc3atgt10620C33ggcscttgctgctctcc333ggg33tgggsttcsgtttacccg333g10680agttcctgcg ttastgsttc tcc3tg3ccc gtsgsctttt3tttgsct33 gtcacsgggg ggascgtgsg 3C3ctg3tc3 atctc33g33 ta3atg3g3t ctgtcctgta3t333gtCCCgtcaigasgctt3CCC3gC3C3ctttgt33t cssttgtttc tgtccc33tcstgsccgtt3 ctcttggctt acascgacct tgastatgagttgtatgtgt tccatagccc sgggsctggc tcctggstcs 3aggcctgst tgtcc3stt3 gaaatgtcct 3tatgtgggcgstcsgtc33tgasgcttgc csgtgtsctctt3cgsccct gsgctttgsc tgsgttcssc tgctss33tg cggg3ttggc ggc3ctccsc ggggccsgtctccggsgsst gtsctgcctt ttacggattg tgtssgtgsc caatgatcaa gtgg3cc3tc tgcttcgtt3 3tggccctsc tctt3ggcs33tC3C3tttt3ctc33g3gc 3gc3tgc3gt ccttgcst3tC3C33tC33tcaggctgttt 3stg3ttctc gggggsctct333CCC33tgggcsttcctc t3gtgtcsc3 tcgaigccsgcgsggctsgct gcg3ggcc3c ctscgg3tgg atccttgsga cttcgt33gs stgggcttscccc33gggss ccststg3tg ctgtcttsc33ctctsgctggggtttstsg 3tgg3sgctt 3sttgg3g3t ccctcctttt cctc3ttgcc3tCttC3tt3 3gC3CC3ttCgtgc33ggggsggct3C3tg tttgtctatt 3tcgcs3gst sat3ttgct3 tccctg33cg tcaaccatga 3tggcsctgtgcctcsct33 tcattcctag sctsgactcc3tggsc3ggcc33ttc3g3g gsgtC3tgtt cgsggscggc cttsttcggc ttttttgtcc gtccc3tats gccccssgtc ggtg3tgstgccgggtcscg cg3t33tgt3 gcctgs33gs tgsgggcstg 3ggacastgg tctcsggsgt actcccgaag ggttccctcs 3cg3g3c3gt 3tgsgscc3t tccsgtggct cccccgscct 3gtsccctstCCt3tCt3t3 3C33tC3g3C3t3ttggccsgtgtsttctgtcctasasgt cccgggatgt tgcccgctcc tcggtgatcc tgcctg33g3 3ctgggctsg七3ttcc3tgs3gtctsttgc gggggtt33C csggg3tggt csgtgcsgct ctatttscgg gtcstgaigsc cctcgggttg ttggttctsc gstccttgcg stagctcttggaggcttgta tgttgtsagt as3ggag3tc ccssgtgstt gstggccssg cccc333g3t ccc3gtcc3c sgtaattcgg C3gtgcsttt cagcttgttt gcstaagsgg tgscgccc3t gggsggt3ta cctggctgct cstsgccgts tgctsgsgt3七C3CCtC33gat3tt3tgst gtcsgsgsct taaaagcatcagtcataccc tsttgggggggsccctccst cgsccctt3C 33ctgc33gg3cctsgggcs sggcstgctg stctcg3gtg gctattgaca ggcgagagct ccttg3ggtc stgtgtcstc ccssctggst csctg3tg3g stctgctgtt g33cg33gccgstgttttcc ggagcttaccgctgs333tc gstgsgcscgcsgg3CC33g 3tC3cgsctg gcsc3gsggc cttgsgscct 3tcccgtt3t gssgggtstt t3tg3g3gcgactagsgattgggctscttg atsgttgatg gsgsgaggtt sttctgstctCtCCtC3C33tcsattgctgtcsgcs33tc tttgtcctgsgg33g33ag3 ct33g33gcc cctgstgtsc tgcgsgtgtg gst3ttg3C3tggttgttgg10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 ll楊 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11, 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 12900 12960 13020ctsggcsssgggccs3tgtgsgcctggsggagctasgggtgstcsctccc3tCtC33Ctt13080cgsctsatttsgcgcatsggttgsggg3tcgt3gcsctc3tcsggt3C3t13140cccttgtccgagtggcgaggtCtCC33Cg3C33tCtCtC3tttgtc3t3t13200ggttgstsct33Cttt3t3t3CC33C33gg3stgcttct3gggttgggtg13260ttttsg333c3ttgtttcgsctcg3g333g3tsccggstcgt3ttscatc13320ttcacgtcgs33csg3ttgttgcgtg3tcccg3tgstsg3tc3tccc3gg3t3cccsgct13380cccgcaagctsgagctgagggcagagctatgt3CC33CCC3ttgstait3tgst33tgc3c13楊ctttasttgscsgsgstscai3C3sggct3t3C3cccsg3gccstsggsggcsccttgtgg13500aatttgttac3tggtccsc3CCCC33Ct3t3tC3C3ttttsgct33gtcc3C3gc3ctst13560ctatgattgacctggt33C3sggscc3t3tgaatgaaatttc3gctctcs13620tsggggstgscg3tstcs3t3gtttC3tS3ctgsgtttctgctcatagagccasgsttst13680tC3Ct3tct3cttgggccagtgtgcggccstcaattgggc3tttgstgtsC3tt3tC3七313740gaccatcaggg333tatc3g3tgggtgsgctgttgtcstcgttcctttct13,ssggagtgtttssggtgcttgtc33tgctct33gcc3ccc333g3tct3c33g333ttCt13860ggcsttgtggtattatagagcct3tccstggtccttcscttgstgctcs333CttgC3C313920casctgtgtgcaacatggtttsc3cstgct3tstgscct3cctcgscctgttgttgaatg139803gsgttcsc3tttctcttgtgtgaaagcgacgaggatgtagt3ccggscs14040gsttcg3C33C3tccsggc3gtgttctggcsgstttgtsctgtc33ccag14100ggscctgccc3CC3attcgsggtctssg3ccggt3g3g33atgtgcsgttct33ccgacc14160atatcaaggcsgsggctsggttstctccsgcaggstcttc33tCC33tt314220ttgtagaccattsctcatgctctctgsctt3tctccggcg3ggstcgstc14280gattgagagttgatccaggsttcattttcg3cgccctcgctgaggt333tgtcsgtcsgc14340ggctttcag3cccccscscg144003tgstgttgc3333ttgctcgcsc33tcttcccstttcag14460ggggcsstctcgcc33tt3tctttccgcsg33tcgggttg3sctc3tctg14520cttgctac333gctgttgsgatgccttgagccsggggsgg14580scggcttgttcttgggtgagggstcgggttctatgttg3tcsctt3t33g14640gtgcttctst33tsgtggggtttccgcc33ttctsgstctggtc333ggg1470033ttsgc3ccctstccctccg3sgttggccttgtcgsac3gtsggt33ts14760ttgtcs33gtgctcttts3cgggsggcccg3sgtc3cgtgggt3ggcsgtgtsgattgct14820tC33tttC3tsgttagt33t3tccctacctctsgtgtggggttt3tccst14880agsccttgcc3ttggcsgcc3tctt3tcgs14940tggctctgctcctgggcaaatsctggtgattasgcttstgcctttcagcg15000gggattttgttcsgggatttataagttatgt3gggtctc3gtgsaccttg15060tataccctagttC3t3tCt3ctga3tctt3tttggttatg151203ggctsaccggctsstg33tg3t33ttg33tcatctgtga15180ggacttcscctggscttstsggtcscatcctatccatt33gc3sct33gc15240C33ttgtgggsgscgcsgttsgtsgsggtg3t3tC33tCCt3CtCtg33315300ggtgctgstc3attgcgggtcggscctssgctgtgc3sag15360ccstg3tgttgcctcsgggc33g3tgg3ttgcttaattct3t3CtC3tCC15420tctscsgggsgttggcasga3tgttccscg15480cttsccccgtattggtaagt3gc3ggcs3c3tct3gg3tc15540tttgggggcscsttcttctttsctccggg3ttt3tCC3g3156003tctcs3gtccggctstctgstsctsgsctt3C3CC3g33tstcttcgtt15660cc33gtc3g3gaaacagatt3tt3tgscggggggtttgss3cgcgagtgggtttttssgg15720gs3tggt3t3sgtt3gtcggatacagtgccctgatt33gg15780actaattggttgssctccggctgccctsggtggttsggc3tt3tttgcs3158403333CtttgStttctsttcccsgctttgtctggt1589权利要求
1.一种麻疹病毒全基因cDNA克隆，含有编码一种改造型长-47株麻疹病毒的全长反基因组正链RNA的核苷酸序列，所述改造型长-47株麻疹病毒是指长-47株麻疹病毒的H蛋白编码基因被H1基因型麻疹病毒流行株的H基因替换。
2. 如权利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述Hl基因型麻疹病 毒流行株是China93-7。
3. 如权利要求2所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述核苷酸序列如序 列表中SEQIDNo: l所示。
4. 如权利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于该克隆还含有与所述 核苷酸序列操作性相连的异源表达控制序列，所述异源表达控制序列包含位于所述核 苷酸序列5'末端的RNA聚合酶启动子。
5. 如权利要求4所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述RNA聚合酶启动 子是T7启动子。
6. 如权利要求5所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于该克隆还包含一个与 所述核苷酸序列3'末端最后一个核苷酸紧邻的丁型肝炎病毒核酶序列。
7. 如权利要求6所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于该克隆在丁型肝炎病 毒核酶序列下游具有T7终止子。
8. —种制备感染性麻疹病毒的方法，包括以下步骤1) 用权利要求4~7中任一权利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆导入带辅助系统 的宿主细胞中，所述辅助系统能表达麻疹病毒反基因组正链RNA转录、复制和包壳 所需的蛋白质；2) 培养并回收所表达的麻疹病毒颗粒。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤l)具体包括a) 构建权利要求4~7中任一权利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆；b) 构建一个或多个支持克隆，含有麻疹病毒的N、 P和L蛋白的编码序列及与这些序 列操作性相连的RNA聚合酶启动子，其中N、 P和L蛋白的编码序列在同一个支持 克隆中或在不同的支持克隆中；c) 用步骤a)和b)构建的克隆共转染宿主细胞，所述宿主细胞含有对应于麻疹病毒全 基因cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于在所述步骤c)之前用表达对应于所述RNA 聚合酶启动子的RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染宿主细胞。
全文摘要
本发明提供了一种改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆，是对长-47株麻疹病毒全长cDNA克隆进行中国现有主要流行株(H1基因型，代表株为China93-7)主要表面抗原基因(H基因)的替换改造获得。本发明运用RNA病毒反向遗传技术在cDNA水平上进行改造型长-47病毒拯救，获得有感染性的改造病毒，从而极大的方便了新型病毒株的复制、增殖以及包装的研究，而且，生产出的新型感染性病毒具备流行株的血凝素抗原，具有更适合的麻疹减毒活疫苗的应用价值。
文档编号C12N15/40GK101323857SQ20081011763
公开日2008年12月17日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者修梅红, 张全福, 川 李, 李德新, 梁米芳, 王晓芳, 胡孔新 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所