专利名称：一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种橡胶树花药愈伤组 织玻璃化超低温保存方法。
背景技术：
橡胶树是多年生高大乔木，异花授粉，在遗传上高度杂合，使得 橡胶树的育种难度加大。生产上橡胶树种植材料一般有两种， 一是实 生树，二是芽接树。芽接树个体间产量变异小、产量高、性状一致， 但抗逆性较弱。实生树个体间产量变异大、产量低、性状不一致，但 抗逆性较强。目前生产上橡胶树种植基本上是用芽接树。橡胶树选育 种按照常规育种程序，采用多代自交的办法，时间长且难以得到纯合 的植株。
通过橡胶树花药组织培养，诱导胚状体发生、植株再生和进行扩 繁，获得自根无性系，为培育橡胶树产量高、抗逆性强而生长快的优 良品种，提供了新的技术手段和方法。
采用推广品种花药培养获得的再生植株，起源于花药壁体细胞， 具有与母体无性系同样的遗传信息，带有无性繁殖的芽接树的优良性
状；同时，它们又是经过脱分化和再分化过程，经过和合子胚十分相 似的途径发育，回复到幼态，因而又带有实生树的优良性状。经过多 年的橡胶树田间栽培实验表明，花药体细胞植株的表现型与母本植株 一致。因此，花药体细胞植株是一种幼态自根无性系，能够集芽接树 和实生树的优点于一体，而且不受砧木对接穗的不良影响，能表现出 产量高、生长快、抗逆性强、适应性广、经济寿命长等优点，是一种 很有发展前途的新一代种植材料，具有广阔的应用前景。
在植物组织培养过程中，培养时间较长时，会出现胚性材料胚性 降低、体细胞无性系变异机率增加等问题；而且在实验室中进行较大 规模组织培养时，材料较多，管理难度加大。目前，花药培养植株再
生频率还不高， 一般为1~3%,即100个花药出苗仅1~3株。
至今，橡胶树进行超低温冷冻保存的研究还很少。1997年 Engdmami等研究了胚性愈伤组织的超低温保存，保存后的胚性愈伤 组织解冻后可获得体细胞胚，但未能获得再生植株。2007年，法国农 业研究国际合作中心(CIRAD)的Larde傳对从橡胶树幼嫩种子内株 被来源的愈伤组织成功地进行了液氮超低温冷冻保存，并获得再生植 株，但他们釆用了程序降温的处理过程。他们使胚性愈伤组织及其环 境温度每分钟下降0.2'C,当温度降至-4(TC,再投入液氮中保存，操 作不便。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用液氮玻璃化超低温方法保存巴西 橡胶树花药愈伤组织方法，该方法可长期保存巴西橡胶树优良材料遗 传资源，实现橡胶树优良种质资源长期保存，为生物技术育种提供新途径。
为了实现本发明目的，本发明所述橡胶树花药愈伤组织玻璃化超 低温保存方法，包括如下步骤
1) 预培养将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2 3天， 培养温度为25~28°C;
2) 装载然后在室温下用60。/。的PVS2(玻璃化溶液)处理花药 愈伤组织10~30分钟；
3) 脱水及冻存脱水处理后，在0°。下用PVS2 (玻璃化溶液) 处理20 40分钟，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液， 于液氮中保存。
本发明所述的花药愈伤组织为胚性愈伤组织，是在橡胶树处于盛 花期的春、夏两个花季，选取高产和性状优良的橡胶树的花，选用花
粉发育状态为单核期、少数为双核期的花药，在胚性愈伤组织诱导培 养基上培养，诱导出胚性愈伤组织。
本发明所述预培养基为改良MS培养基中添加2,4-D(2，4-二氯苯 氧乙酸)1.0 ~ 3.0mg/L、KT( 6-糠氨基嘌呤，又名激动素)1.0 ~ 3.0mg/L、 NAA (萘乙酸)1.0~3.0mg/L、 Phytagel (植物凝胶)2.0~3.0g/L、 蔗糖50.0~90.0g/L、 二甲基亚砜(DMSO) 5 ~ 10%(体积百分含量)。
本发明中用改良MS培养基是以MS培养基为基本培养基，并将 MS培养基中的无水氯化钩、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁 的含量调整为无水氯化钩150 ~ 400mg/L、磷酸二氢钾300 - 450mg/L、 四水硫酸锰15 ~ 40mg/L、七水硫酸镁400 ~ 600mg/L。
所述PVS2溶液由28 32。/。的甘油(Gly)、 12 ~ 18。/。己二醇(EG)、 12~18%的二甲基亚砜(DMSO)和136.9 g/L ( 0.4mol/L )的蔗糖所 组成。其中含量为体积百分含量。
60。/。PVS2溶液为含34.2 ~ 68.4 g/L (0.1 ~ 0.2 mol/L)蔗糖的愈 伤组织继代液体培养基(不加Phytagel)与PVS2溶液按体积比40:60 配制而成，所述继代液体培养基为改良MS培养基中添加2,4-D 1.0 ~ 3.0mg/L、 KT 1.0~3.0mg/L、 NAA 1.0 ~ 3.0mg/L、蔗糖34.2 ~ 68.4 g/L (0.1-0.2 mol/L )、椰子水40-90ml/L。
本发明的脱水处理可釆用本领域常用的方法进行。
釆用本发明所述橡胶树花药愈伤组织的液氮玻璃化超低温保存 方法，可长期保存橡胶树花药愈伤组织，保存时间可达一天至几年。 一般将橡胶树花药愈伤组织存放在冻存管中(聚丙烯材料，PP， polypropylene )，常用量为0.2g/管。
釆用本发明的超低温保存方法保存的橡胶树花药愈伤组织，化冻 复苏后可以经过胚状体发生途径得到再生植株。
所述复苏及植株再生方法，包括如下步骤
花药愈伤组织经过超低温保存后，愈伤组织再培养时，须先进行化冻处理，即复苏处理。将液氮中保存的橡胶树花药愈伤组织于40。C
水洛中浸泡2 3分钟，然后用洗涤液洗2次，每次10~12分钟； 洗涤后，转移到愈伤组织继代培养基上，在25 28。C进行暗培养2 3天；再继代培养一次，培养20~30天后存活的花药愈伤组织开始 生长；再继代一次，相同条件下培养40 60天。
所述洗涤液为改良MS培养基中附加2，4-D 1.0~3.0mg/L、 KT 1.0~3.0mg/L、 NAA 1.0 ~ 3,0mg/L、蔗糖342.3 ~ 410.8g/L (1.0~ 1.2mol/L)。
所述继代培养基为改良MS培养基中添加2，4-D 1.0 ~ 3.0mg/L、 KT l,0~3.0mg/L、 NAA 1.0~3.0mg/L、 Phytagel 2.0 — 3.0 g/L、蔗糖 50.0 ~ 90.0g/L、椰子水40 90ml/L。
继代后的愈伤组织便可进行胚状体的诱导，其过程为将继代后 的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基，在25-2纩C之间暗培养20-50天。20~50天后，紧实的愈伤组织表面出现了长势旺盛的乳白色 小胚状体， 一个愈伤组织可分化一至数十个胚状体，胚状体可进一步 发育。胚状体诱导培养基是以改良MS培养基中添加6-BA (6-苄氨 基ff呤)0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3,0mg/L、 NAAO.l ~ 1.0mg/L、 GA3 (赤霉素)0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2.0 ~ 3.0g/L、蔗糖50.0 ~ 90.0g/L、 活性碳1.0 ~ 2.0g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
植株再生是将成熟子叶型胚状体转移到分化培养基上进行培养， 每只培养皿(9厘米直径)放6个胚状体，每天光照12小时，温度 为25 28'C,培养20 60天后开始出苗。分化培养基为改良MS培 养基中添加KT0.5 ~4.0mg/L、NAAO.l ~ 1.0mg/L、GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2.0 ~ 3.0 g/L、蔑糖50.0 ~ 90.0g/L、活性碳1.0 ~ 2.0g/L、椰子 水40 ~ 90ml/L。
本发明中用液氮玻璃化超低温(-196°C)方法保存橡胶树花药愈 伤组织，具有设备简单、实验程序简化、操作方便、冻存效果和重复 性好等优点。在液氮-196。C低温下，橡胶树花药愈伤组织中所有细胞 的分裂和代谢活动停止，材料在此过程中不会产生遗传性状的改变。 液氮玻璃化超低温保存法是长期、稳定保存植物器官、组织和细 胞的有效方法。用这一方法可以长期保存橡胶树花药愈伤组织，为生 物技术育种提供材料，为橡胶树遗传转化创造条件。它能长期保持优 良种质资源的遗传的稳定性，为基础研究和生产应用研究提供有价值 的种质资源。釆用液氮玻璃化超低温保存方法对橡胶树花药愈伤组织 进行超低温冷冻保存，以期为长期保存橡胶树优良材料的遗传资源提 供技术支持，具有广阔的应用前景。
玻璃化冻存法的基本原理是生物材料经高浓度玻璃化保护剂处 理后，快速投入液氮保存，使保护剂和细胞内水分来不及形成冰，或 冰晶没有充分的时间生成，水由液相变为固相，进入一种人工的完全 玻璃化状态。在玻璃化状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和 体积的变化，因而不会由于机械损伤或溶液效应，造成组织和细胞伤 害，使得细胞在化冻后仍保持活性。而且在液氮低温下，细胞分裂和 代谢活动停止，不会产生遗传性状的改变。在理论上，生物的组织或 细胞用液氮超低温冷冻保存方法可保存无限长的时间。
液氣超低温保存是目前植物种质资源长期保存的理想方法。在此 温度(-196。C)下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，植 物材料处于稳定的生物学状态，不会产生遗传性状的改变和形态发生 潜能的丧失。近几年发展较快的玻璃化法显示出较传统的缓慢降温法 和二步法设备简单、操作方便和重演性好等优点。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 预先按要求配制好各种培养基和所需溶液。在春、夏两个花季， 橡胶树处于盛花期，选取高产和性状优良的橡胶树的花，选用花粉发 育状态为单核期、少数为双核期的花药。花蕾用10%的漂白粉溶液或
0.1%的升汞溶液消毒10分钟，经无菌水冲洗4-6次，在无菌条件下取
出花药，放在胚性愈伤组织诱导培养基(MS培养基添加2,4-D 1.0mg/L、 KT0.6mg/L、 NAA0.5mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 椰子水70ml/L。)上培养，诱导出胚性愈伤组织。将愈伤组织转至预 先按要求配制好的预培养基上，培养温度在26士rC,暗培养3天。愈 伤组织预培养基为改良MS培养基添加2，4-D 2.0mg/L、 KT 2.0mg/L、 NAA2.0mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 DMS0 8。/。(体积百分 含量)。
把经过预培养后的花药愈伤组织0.2g放入冻存管中，室温下加入 60%的玻璃化溶液(PVS2)处理30分钟。60。/。PVS2溶液的组成含 51.3g/L (0.15mol/L)蔗糖的愈伤组织继代液体培养基与PVS2溶液按 体积比40:60配制。继代液体培养基为改良MS培养基中添加2,4-D 2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA 1.0mg/L、蔗糖5L3 g/L (O.15mol/L)、 椰子水80ml/L。
再把经过上述处理的花药愈伤组织进行脱水处理，在(TC下加入 PVS2,处理40分钟。然后移去原液，在此冻存管中加入新的PVS2保 护剂，迅速将其投入液氮罐中，冷冻1 7天。PVS2溶液由30。/。的甘油
(Gly)、 15。/o己二醇(EG)、 15%的二甲基亚砜(DMSO)和136.9 g/L
(0如1/L)的蔗糖所组成。
对超低温保存后的花药愈伤组织进行再培养前必须经过化冻处 理，把冻存管在4(TC水洛中浸泡3分钟，进行化冻。然后把花药愈伤 组织用洗涤液洗2次，每次12分钟。再培养时，将经化冻洗涤后的愈 伤组织立即转移到继代培养基上，每只培养皿(9厘米直径)放6块愈 伤组织，暗培养2天；然后再继代培养一次，培养温度27士rC，培养 30天后存活的花药愈伤组织开始生长；再继代一次，相同条件下培养 40天。洗涤液为改良MS培养基添加2,4-D2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA 2.0 mg/L、蔗糖376.5 g/L (1.1mol/L)。继代培养基是以MS培养基为
基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化钩、磷酸二氢钾、四水硫
酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化每300mg/L、磷酸二氢钾350 mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁500mg/L，同时添加2，4-D 2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA2.0mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 椰子水70ml/L。
继代后的愈伤组织进行胚状体的诱导，将愈伤组织接种于诱导培 养基，在27土rC暗培养20 50天。20~50天后，紧实的愈伤组织表面出 现了长势旺盛的乳白色小胚状体， 一个愈伤组织可分化出一至数十个 胚状体，胚状体可进一步发育成成熟子叶型胚状体。胚状体诱导培养 基是以MS培养基为基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化钙、磷 酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙 300mg/L、磷酸二氢钾350mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁 500mg/L,同时添力口6-BA1.5mg/L、 KT1.5mg/L、 NAA0.5mg/L、 GA3 0.1mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。
将成熟子叶型胚状体转移到分化培养基上进行培养，每天光照12
小时，温度为27土rC，培养20 60天后开始出苗，为再生植株。分化
培养基是以MS培养基为基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化
锦、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙
300mg/L、磷酸二氢钾350mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁
500mg/L,同时添加KT 2.0mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel
2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。
其中，MS培养基成分 大量元素 NH4N03 1650 mg/L
Na2EDTA FeS04*7H20
CaCl2 '2H20
MgS04.7H20
KH2P。4
1900 mg/L 440 mg/L 370 mg/L 170 mg/L 37.3 mg/L 27.8 mg/L
微量元素 H3B03 6.2mg/L
MnS04-4H20 22.3 mg/L
ZnS04'7H20 8.6 mg/L
KI 0.83 mg/L
Na2Mo04-2H20 0.25 mg/L
CuS04'5H20 0.025 mg/L
CoCl26H20 0.025 mg/L
有机成分肌醇 100 mg/L
甘氨酸 2.0 mg/L
烟酸 0.5 mg/L
盐酸吡喷醇 0.5 mg/L
盐酸硫胺素 0.1 mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 lOg/L
pH 5.8。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种橡胶树花药愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤1)预培养将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2～3天，培养温度为25～28℃；2)装载然后在室温下用60％的玻璃化溶液处理花药愈伤组织10～30分钟；3)脱水及冻存脱水处理后，在0℃下用玻璃化溶液处理20～40分钟，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液，于液氮中保存。
2. 根据权利要求l所述的玻璃化超低温保存方法，其特征在于， 所述预培养基为改良MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸1.0 ~ 3.0mg/L、 6-糠氨基嘌呤1.0~3.0mg/L、萘乙酸l.O ~ 3.0mg/L、植物凝 胶2.0-3.0g/L、蔗糖50.0 90.0g/L、 二甲基亚砜5~10%。
3. 根据权利要求1或2所述的玻璃化超低温保存方法，其特征在 于，所述60%的玻璃化溶液为含34.2 68.4g/L蔗糖的愈伤组织继代 液体培养基与玻璃化溶液按体积比40:60配制而成，所述继代液体培 养基为改良MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0 ~ 3.0mg/L、 6-糠氨 基嘌呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸1.0 3.0mg/L、蔗糖34.2 ~ 68.4 g/L、椰 子水40 ~ 90ml/L。
4. 一种釆用权利要求l-3任意一项所述方法保存的橡胶树花药愈 伤组织的复苏及再培养方法，其特征在于，包括如下步骤将液氮中保存的橡胶树花药愈伤组织于4(TC水洛中浸泡2 3分 钟，然后用洗涤液洗2次，每次10~12分钟；洗涤后，转移到愈伤组 织继代培养基上，在25 28'C进行暗培养2-3天；再继代培养一次， 培养20 30天后存活的花药愈伤组织开始生长；再继代一次，相同条 件下培养40 60天。
5. 根据权利要求4所述的复苏及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为改良MS培养基中附加2,4-二氯苯氧乙酸l.O ~ 3.0mg/L、 6-糠 氨基p票呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸1.0 3.0mg/L、蔗糖342.3 ~ 410.8g/L。
6. 根据权利要求4或5所述的复苏及再培养方法，其特征在于， 所述继代培养基为改良MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0 3.0mg/L、 6-糠氨基嘌呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸l.O ~ 3.0mg/L、植物凝 胶2-3g/L、蔗糖50.0 90.0g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
全文摘要
本发明提供了一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括如下步骤将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2～3天，培养温度为25～28℃；然后在室温下用60％的PVS<sub>2</sub>处理花药愈伤组织10～30分钟；脱水处理后，在0℃下用PVS<sub>2</sub>处理20～40分钟，移去PVS<sub>2</sub>原液，再加入新的PVS<sub>2</sub>，在液氮中保存。花药愈伤组织复苏后，进行继代培养，进一步诱导胚状体及诱导成熟胚状体分化后可获得再生植株。本发明所涉及的液氮玻璃化超低温保存方法具有设备简便、实验程序简化、效果和重复性好等优点，可长期保存橡胶树花药愈伤组织，解冻后经培养得到再生植株，为橡胶树遗传转化创造条件。
文档编号C12N5/04GK101353639SQ20081011986
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者周权男, 孙爱花, 哲 李, 林位夫, 黄华孙, 黄天带 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所