专利名称：一种用巢式pcr鉴定肝素猪、牛、羊来源的方法
技术领域：
本发明是一种定性检测肝素来源成分的准确检测方法，具体地说是利用分子生 物学技术对肝素粗成品中成分来源的高效定性检测方法。
背景技术：
肝素是一种由动物结缔组织的肥大细胞产生的粘多糖，是一种天然抗凝血物质， 它在抗凝血，促进脂蛋白酶释放和补体溶细胞体系等方面具有活性，被广泛用于治疗血栓塞、 暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低 胆固醇等作用。
由于肝素至今尚无法化学合成，只能从动物屠宰后的下脚料中提取，主要从猪、牛、羊 的肺脏、肠粘膜等动物脏器等组织中提取得到。市场需求量极大，我国是世界上肝素钠主要 出口国家之一，占世界市场55%以上的份额，但由于"疯牛病"的泛滥，统计表明在负作用 方面猪源肝素明显小于其它来源的肝素，所以欧美各国在肝素进口方面明确要求以猪副产品 为原料提取的产品，同时加大了对中国出口肝素产品的质量、来源等方面的质量要求和抽检 力度。目前国内的相关标准较为混乱，出现了一些技术标准不一致，法规滞后，与国际惯例 不接轨，而且大部分厂家还没有形成一套可信、方便的自检体系以便做到心中有数，尽量减 少不必要的损失。本发明是基于上述情况的一种便于推广的运用巢式PCR技术对肝素来源的 定性检测方法。
自20世纪60年代，线粒体DNA (mtDNA)得到证实以来，目前很多种动物的mtDNA的 全序列已经全部测定。mtDNA为细胞核外遗传物质，以母系单性遗传、结构简单、在世代遗 传中不发生重组、进化速度快为特点。mtDNA在种间、种内群体间和群体内具有广泛的多肽 性，线粒体DNA因其种属特异性强，在分子进化中有许多独特的优越性，是研究动物种间进
化、进行种属鉴定、特异的遗传标记，现已广泛应用在分子分类学等领域。
Polymerase Chain Reaction (PCR)由1985年的cetus公司的Karry Mu出s首创。以DNA 为模板，在4种核苷酸存在条件下，借DNA聚合酶形成酶促反应，PCR最主要的组分是引物。 加热使双链DNA变成单链，denaturation变性。当温度骤然降低，引物特异与单链结合， 同时4种核苷酸在DNA聚合酶促下，5-3聚合，使DNA链不断延伸。
发明人根据mtDNA的基本特性，设计出特异的引物，利用分子分类学方法找到猪、牛、 羊三种动物mtDNA上的种属特异性片段，从而可以定性检测肝素样品的来源
发明内容
本发明提供了一组可以专门用于PCR鉴定检测肝素粗制样品的来源组成(猪、 牛、羊)的引物，并建立了基于上述引物的稳定定性鉴别的PCR反应体系。根据Genbank公 布的猪、牛、羊线粒体DNA序列，经同源性比对后，利用Primer 5. 0与Oligo 6软件辅助设 计引物。具体如下
1、用于鉴定的特异性引物 (1)猪成分扩增引物名称及序列
第一轮扩增片段长度385 bp
Por—mt F 5， 一aaacatgaaacattggagtagtcc-3， Po「mt R 5' - aggattagtattataaataaggctcc-3'
第二轮扩增片段长度80 bp
P2-5: 5' -TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3' P2—3: 5' —GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG 3'
(2) 牛成分扩增引物名称及序列
第一轮扩增片段长度295 bp
Bov-mt F 5， -ttttaagttagagattgagagcc-3 ， Bov-mt R 5， -aatagtaggcttgggaatagtac-3，
第二轮扩增片段长度128 bp
B2-5: 5' -ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3'
(3) 羊成分扩增引物名称及序列 第一轮扩增片段长度319 bp
Y肌g—mt F 5， 一atttgcctctttcattacccc-3， Yang-mt R 5， -tcctgctcataagggatagcc-3'
第二轮扩增片段长度112 bp
S2-5: 5' TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA3' S2-3: 5'TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
2、构建的反应体系如下
第一轮PCR反应体系及反应条件-
总反应体系为25ul，其中含DNA模板(100 ng/ul) 1 ul， dNTPs(10 mM) 0.2 ul， 10 XPCR缓冲液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul， 无菌超纯水补足至25 ul。扩增反应条件为95°C 3min, 95°C 40 s， 56°C 40 s, 72°C 40 s，
共30个循环，最后72'C延伸10 min。
第二轮PCR反应体系及反应条件 取第一轮反应产物稀释100倍作为第二轮扩增的模板。
总反应体系为25 ul,其中含DNA模板1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul， 10XPCR缓冲 液2.5 ul,内部正反向引物(20 uM)各1 ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul，无菌超 纯水补足至25 ul。扩增反应条件为95°C 3 min， 95°C 20 s， 56°C 20 s， 72°C 20 s，共 30个循环，最后72"延伸10 min。
图l、为本发明猪牛羊引物的种特异性分析结果电泳图A为猪引物，B为牛引 物，c为羊引物；1， 2, 3泳道分别为猪、牛和羊DNA模板，4为空白对照。猪、牛、羊引物 扩增片段长分别为377bp、 271bp和295bp。阴性对照无扩增说明PCR体系无污染。猪牛羊引 物对猪牛羊成分的特异性扩增表明本发明设计的引物可用以检测DNA样品中是否含有猪牛 或羊来源的DNA成分。
图2、为本发明外部引物检测灵敏度分析结果电泳图A为猪引物，B为牛引物，C为羊 引物。泳道l一6分别代表在200ng无关DNA中添加相应猪牛羊总DNA 100ng, 10ng， lng, 0. lng, 0. Olng， Ong作为模板的PCR扩增产物。
图3、为本发明第二轮Nest-PCR扩增结果电泳图A、 B、 C分别为猪牛羊二次nest-PCR 结果，泳道l, 2， 3， 4, 5， 6为梯度稀释的DNA模板(加在200ng无关DNA中)，浓度分 别为lng， 0. lng， 10pg， lpg, 0. lpg, 0. Olpg;泳道7为PCR阴性对照，以无菌纯水为模板。
图4、为本发明巢式PCR检测肝素原料中猪牛羊成分的结果电泳图I:外部引物PCR扩 增结果，II: Nest-PCR扩增产物。A为猪引物，B为牛引物，C为羊引物。泳道l:猪牛羊阳 性模板；2:阴性对照；3 — 6: 4个肝素原料内提取的DNA。
具体实施方式
本发明的目的是为了公布一种基于分子分类学基础上的猪、牛、羊来源肝 素的定性的检测方法。发明人公布了一种可以用来PCR辨别肝素来源的特异性引物和反应体 系。下面就具体实施例来说明引物的特异性、检测的灵敏度和肝素粗品检验来说明本发明的 具体运用。
实施例l、引物特异性、灵敏度的鉴定
1、 DNA的提取分别将新鲜猪肉、牛肉、羊肉研磨粉碎，DNA提取试剂盒(上海市农业 科学院和上海出入境检验检疫局联合研制)提取总DNA。核酸蛋白分析仪测量所提取DNA 样品的OD260/OD280的值不小于1.5，并进行电泳检测后，根据测得的浓度将DNA样品 浓度稀释到100ng/u1, -20'C保存。进行引物扩增灵敏度分析时将DNA IO倍梯度稀释(102 —1(Tng/ul),再以稀释的DNA为模板进行PCR扩增。
2、 扩增产物鉴定所有PCR扩增产物用296琼脂糖凝胶电泳检测，加入终浓度为O. 5ug/ml 的溴化乙锭。电泳缓冲液为O. 5xTBE,以DL2000DNAMarker作为DNA分子量标准。电泳条 件为10V/cm电压，电泳lh后在凝胶成像系统中拍照分析。
3、 引物特异性的鉴定以猪牛羊DNA (100 ng)为模板，分别用上述设计的猪牛羊特异 引物进行PCR扩增，结果猪引物只有猪成分DNA反应管有扩增，牛羊DNA均无扩增；同 样，牛引物只能扩增牛成分，羊引物只能扩增羊成分，结果见图l。
4、 巢式PCR第一轮扩增引物灵敏度分析分别在200ng不相关DNA中加入100ng到100pg 梯度稀释的猪牛羊DNA作为模板，用上述相应的猪牛羊引物进行检测，结果均有特异性扩 增，结果见图2。
5、 巢式PCR第二轮扩增引物灵敏度分析将第一轮扩增产物稀释100倍，再分别取lul 作为模板，用相应的内部引物进行第二轮扩增，结果，DNA模板量为l(Tiig时仍能有较强的 扩增。空白对照无扩增，表明PCR体系未受污染。结果见图3.
实施例2、肝素样品来源的鉴定
分别将送检4份肝素原料样品(分别编号为3井、4#、 5井和6井)、新鲜猪肉、牛肉、羊肉研 磨粉碎，DNA提取试剂盒(上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制)提取总 DNA。根据测得的浓度将DNA样品浓度稀释到100 ng/ul， -20'C保存。按照上述发明设计的 引物和PCR反应体系，进行PCR扩增鉴定送检肝素样品的来源。
将PCR扩增产物用296琼脂糖凝胶电泳检测鉴定可知在第一轮扩增后可以判断5#和6#肝素 样品为猪来源，而进行第二轮PCR扩增后可以断定4份肝素样品均为猪来源样品，但3#样品中 混有牛成分。结果见图4。
权利要求
1、巢式PCR鉴定肝素猪、牛、羊来源的快速检测方法，其特征在于用DNA 提取试剂盒提取总DNA，进行巢式PCR扩增种特异性DNA序列基因，最 后电泳鉴定肝素来源。
2、 根据权利要求书l所述方法，其特征为根据Genbank公布的猪、牛、羊线 粒体DNA序列，经同源性比对后，利用Primer5.0与Oligo 6软件辅助设 计引物。具体如下(1)猪成分扩增引物名称及序列第一轮扩增片段长度385 bpPl-5 5' -AAACATGAAACATTGGAGTAGTCC-3' Pl-3 5' - AGGATTAGTATTATAAATAAGGCTCC-3' 第二轮扩增片段长度80 bpP2-5: 5， TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3， P2-3: 5' -GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG-3，(2 )牛成分扩增引物名称及序列第一轮扩增片段长度295 bpBov-mt F 5， TTTTAAGTTAGAGATTGAGAGCC-3， Bov-mt R 5， -AATAGTAGGCTTGGGAATAGTAC-3'第二轮扩增片段长度128 bp B2-5: 5' ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3' (3)羊成分扩增引物名称及序列第一轮扩增片段长度319 bp Yang-mt F 5' -ATTTGCCTCTTTCATTACCCC-3' Yang-mt R 5' -TCCTGCTCATAAGGGATAGCC-3' 第二轮扩增片段长度112 bp S2-5: 5' -TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA-3' S2-3: 5' - TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
3、 一种稳定的巢式PCR反应体系，其特征是根据权利要求2所述的引物，利用 本反应体系可以特异地鉴定肝素猪、牛、羊的成分来源。具体如下第一轮PCR反应体系及反应条件总反应体系为25ul，其中含DNA模板(100ng/ul) 1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul, 10XPCR缓冲液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚 合酶(5U/ul) 0.2ul，无菌超纯水补足至25 ul。扩增反应条件为95'C 3 min， 95'C 40 s， 56'C 40 s， 72°C 40 s，共30个循环，最后72。C延伸10 min。 第二轮PCR反应体系及反应条件取第一轮反应产物稀释100倍作为第二轮扩增的模板。 总反应体系为25ul，其中含DNA模板lul， dNTPs(10mM) 0. 2 ul， 10XPCR 缓冲液2.5 ul,内部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul,无菌超纯水补足至25 ul。扩增反应条件为95°C 3 min， 95。C 20 s， 56。C 20 s， 72。C 20 s，共30个循环，最后72'C延伸10 min。
4、 一种检测肝素的猪、牛、羊成分来源的PCR方法，其特征在于它含有本发 明的特异性引物和PCR反应体系。
5、 一种检测产品中猪、牛、羊成分来源的方法，其特征在于该检测方法是基于 权利要求书2和/或权利要求书3的。
全文摘要
本发明公开了一种可以鉴定肝素粗成品成分来源的检测方法。引物及其反应体系。特征是根据Genbank公布的猪、牛、羊线粒体DNA序列，经同源性比对后，利用Primer 5.0与Oligo 6软件辅助设计得到引物，并建立了具体的稳定的巢式聚合酶链式反应(PCR)体系。经过具体实例验证，经巢式PCR反应，本发明可以用来鉴定肝素粗品成分的猪、牛、羊来源，其基因含量灵敏度达到0.01pg，可以广泛的运用到肝素粗成品检验中。本发明还可用于其它产品中猪、牛、羊的成分鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101363058SQ200810123709
公开日2009年2月11日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者侯亚义, 王庆苓, 赵光锋, 赵树立, 黄亚红 申请人:南京大学