专利名称：诊断马流感病毒和鉴定其亚型的多重rt-pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒和其亚型的诊断和鉴定方法，尤其涉及一种诊断马流感病 毒和鉴定其亚型的多重RT-PCR方法，属于病毒分子生物学领域。
背景技术：
马流感病毒(equine influenza virus, EIV )属于A型流感病毒，引起马属动物 流行性感冒，还可感染狗等动物(Crawford P C, Edward J D, William L C, et al. Transmission of equine influenza virus to dogs[J]. Science. 2005.310:482-85; Kuiken T， Edwed C H, John M, et al. Host species barriers to influenza virus infections. Science[J]. 2006. 312:394-97.)。流感病毒基因组包括M基因、HA基因和NA基因在内的8个 负链单股RNA片段组成。其中M基因组序列高度保守，HA和NA基因组则可变 性很强，其某些位点的变异可导致不同病毒亚型的出现。虽然流感病毒可以分为15 个HA亚型，9个NA亚型，但是，目前为止，EIV只发现H3N8和H7N7两种亚型， 从上世纪九十年代开始，世界各地发现的EIV分离抹均为H3N8亚型(Newton JR.， Daly J M., Spencer L., et al. Description of the outbreak of equine influenza (H3N8) in the United Kingdom in 2003, during which recently vaccinated horses in Newmarket developed respiratory disease[J]. Vet Rec, 2007，158(6):185-92; M artella V., Elia G., Decaro N., et al. An outbreak of equine influenza virus in vaccinated horses in Italy is due to an H3N8 stain closely related to recent North American representatives of the Florida sub-lineage[J]. Vet. Microbiol, 2007,121:56-63; Damiani A M, Scicluna M T, Ciabatti I, Genetic characterization of equine influenza viruses isolated in Italy between 1999 and 2005[J]. Virus Res， 2008. 131(1):跳5.)，虽然不同分离林之间存在抗原漂 移现象，但是，病毒各段基因的同源性均在90%以上。马流感病毒在亚型分类上具有自己的特点，至今只发现存在H3N8和H7N7两 种亚型，而且，近二十年来世界各地分离到的流行抹均为H3N8亚型，部分研究人 员认为H7N7亚型已经绝迹。根据马流感病毒的这一特点，可以利用PCR这一专门 针对基因诊断的技术，建立快速、特异的检测方法。病毒分离、血清学试验至今仍是针对马流感诊断和对EIV进行定型普遍采用的方法,但这些方法操作比较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于马流感的及时有效防制(Quinlivan M， Cullinane A, Nelly M， et al. Comparison of sensitivities of virus isolation, antigen detectoion, and nucleic acid amplification for detection of equine influenza virus[J]. J. Cli. Micro. 2004. Vol.42,No.2:759-63.)。聚合酶链式反应(PCR) 可以在数小时内对某tt因进行扩大数百万倍。该技术特异性强、敏感性高、检测 快速，已被广泛应用于医学的各个领域。多重PCR是一种特殊PCR形式，其最突 出特点是一次PCR可同时检测多种基因，尤其适用于流感病毒的诊断(Poddar S K， Espina R, Schnurr D P, et al. Evaluation of a single step multiplex RT-PCR for influenza virus type and subtype detection in respiratory samples[J]. J. Clin. Lab. Anal. 2002， 16(3》163-66; Choi Y K, Goyal S M, Kang S W, et al. Detection and subtyping of swine influenza H1N1, H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays[J]. J. Virol. Methods. 2002. 102(l-2):53-59; Shan S， Ko L S， Richard A C, et al. Comparison of nucleic acid-based detection of avian influenza H5N1 with virus isolation[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2003. 302:377-83.)。发明内容本发明的主要目的是提供一种诊断马流感病毒和鉴定其亚型的方法，该方法敏 感性强、特高，可以快速、准确的对EIV进行诊断和亚型鉴定。 本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的一种诊断马流感病毒和鉴定其亚型的多重RT-PCR方法，包括以待检样品的 RNA为模板，以SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4两 组核苷酸序列为多重引物进行RT-PCR反应；如果从待检测的样品中只扩增出了 227bp的产物，则该样品为EIV的H7N7亚型；如果从待检测的样品中同时扩增出 了 227bp和595bp的产物，则该样品为EIV的H3N8亚型；如果从待检测的样品中 未扩增出227bp的产物，则该样品不含有EIV。本发明通过对数十株H3N8亚型马流感病毒HA基因的序列同源性比较，发现 各株H3H8亚型马流感病毒HA基因的同源性在90 %至99 %之间，而且在HA2基 因中存在700bp左右的相对保守序列，通过研究比对，在本发明中所选取的HA基 因特异引物HF/HR ( SEQ ID NO:l/ SEQ ID NO:2 )与现有H3H8亚型马流感病毒的同源性在95%以上，与H7N7亚型马流感病毒的没有同源性，因此，该引物可以用 于对EIV亚型的初步诊断。流感病毒的M基因比较保守，被普遍用于流感病毒的 初步诊断，本发明通过对数十抹马流感病毒M基因的分析，设计了 MF/MR引物 (SEQ ID NO:3/ SEQ ID NO:4 ),其中MF引物与其它EIV的M基因同源性99%以 上，与禽流感等流感病毒M基因同源性为85 % - 95 % ， MR引物与其它EIV的M 基因同源性99%以上，与禽流感等流感病毒M基因同源性为85%以下。综合上述， 本发明所设计的两对引物可以用于马流感病毒的PCR诊断以及亚型的初步鉴定。通过对不同温度PCR条件的摸索，发现本试验使用的引物特异性非常好，在 48。C到56。C之间均能扩增出目的片段，而且产量没有很大差别。本发明对PCR反应条件进行了优化和筛选，设计常规PCR反应条件，分别使 用48.8。C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9。C试验最佳退火温度，分别使用25次、30次、35 次试验最佳循环次数。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定。对不同PCR退火温 度和循环数进行试验，试验的4个退火温度、3种循环数均能扩展得到目的片段， 其中，53.6。C为最佳退火温度，30次循环与35次循环的扩展效果相差不大。虽然 使用35个循环会提高PCR量，但是为了节省时间，本发明选择30个循环作为PCR 条件。简单的PCR条件使本试验对检测条件的要求更加简单，有利于在现地进行检测 工作。本试验的敏感性试验结果显示，本方法对EIVRNA的最低监测量为0.15ng， 而通常样品采集后鼻拭子提取液可以获得至少10ug/ml浓度的RNA,因此，本方法 的敏感性足够对现地采集的样品进行检测，使用此方法可以在第一时间对病原进行 判断，避免了对病毒分离繁殖的麻烦。特异性试验结果显示，本发明多重RT-PCR方法对H3N8亚型EIVRNA可以同 时扩增出227bp和595bp两条DNA片段，对H7N7亚型EIV只扩增出227bp的片 段，而对马动脉炎病毒、马传贫病毒均无扩增产物。从而证明本发明方法具有良好 的特异性。对能够分离到EIV的鼻拭子进行RT-PCR检测，所有样品均检测为阳性，这与 病原分离结果一致，符合率为100%。说明本发明所建立的多重RT-PCR方法适合 于EIV的临g测和亚型鉴定。由于该方法不需多次进行PCR就可以在几个小时 内一次性完成鉴定工作，因此非常有利于EIV的快速诊断和亚型鉴定，为马流感的 有效控制争取宝贵时间。总之，本发明根据RT-PCR技术原理，根据EIV只有两种HA亚型的特点，建 立了多重RT-PCR检测技术，其敏感性强、特异性高，可以用于EIV的快速诊断和 亚型鉴定。
图1 RT-PCR优化试验结果；1:DL2000 Marker; 2-5:退火温度分别为48.8°C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9°C， 25个循环;6-9:退火温度分别为4S.8。C、 51.2。C、 53.6°C、 55.9°C, 30个循环；10-13:退火温度分别为48.8°C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9°C， 35 个循环。图2 RT-PCR特异性试验结果；1: DL2000 Marker; 2:以H3N8亚型EIV RNA 为模板；3:以H7N7亚型EIVRNA为模板;.4:以EAVRNA为模板；5:以EIAV RNA为模板。图3 RT-PCR敏感性试验结果；1: DL2000 Marker; 2 - 13:浓度150ug/ml的 EIV尿嚢液RNA分别稀释2^2^倍RT-PCR产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。1材料与方法1.1试验用毒抹及病料采集H3N8亚型EIV分离抹A/equine/XinjiangFuyun/3/2007由本实验室从发病马鼻咽 拭子提取物经鸡胚分离得到。H7N7亚型EIV分离抹A/叫uine/Beijing/1/1974、马动 脉炎病毒(EAV)马传染性贫血病毒(EIAV)由本实验室保存。分离病原用病料为马鼻咽部提取物，将棉拭子经前侧鼻道伸入马鼻咽部，沾取 呼吸道粘液，制备鼻咽拭子若干个，保存于含双抗的磷酸盐緩冲液中，每管中约含 4 5ml緩冲液，4。C冰盒保存空运至实验室。-80"保存。1.2引物设计与合成分析了 GENBANK中数十林EIV的HA基因和M基因序列，选取了 H3N8亚型EIVHA基因HA2部分的一段0.6kb序列，以及M基因中的一段0.3kb序列作为 扩增目标，设计合成了两对引物。HF: 5' AATTCATCACCC GAG TTC AA3' ( SEQ IDN0:1), HR: 5'TTT CATTAATCT GGT CGATGG C 3' (SEQIDN0:2), MF: 5'ACTGTGACAACCGAAGTG3' (SEQIDNO:3),魔5'TGC CTG GCC TTA CTA GC 3' ( SEQ ID NO:4 )。目的扩增片段长度为595bp和227bp。 1.3病毒RNA的提取将鼻咽拭子保存液或EIV分离尿嚢液于4°C高速离心，取上清液250ul样品加 入500ulTrizo1试剂(Invitrogen 7>司产品)，混匀后静置5分钟，加入400ul氯仿， 振荡混匀lmin， 12000rpm于4。C离心15min,取上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀， 4。C放置15min, 12000rpm于4°C离心15min,弃上清，用70%乙醇洗沉淀，12000rpm 于4°C离心5min,用20ul DEPC水重悬沉淀。1.4 RT-PCR扩增反转录引物使用HF和MF引物各2pmo1，病毒RNA lul，使用INVITROGEN 公司M-MLV反转录试剂盒(Cat.Nos.28025-013 )，共20ul体系，过程参考说明书进 行。PCR使用50ul反应体系，包括20ul反转录产物，luIHF(10pM)， lulHR(10pM), lul MF(10pM)， lul MR(10pM)， 0.25ul rTaq DNA聚合酶(Takara产品)，5ul緩冲 液(Takara)， 4ul dNTP (Takara),用水补齐体积。设计常规PCR反应条件，分别 使用48.8。C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9。C试验最佳退火温度，分别使用25次、30次、 35次试验最佳循环次数。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定。选出最佳PCR 条件。1.5特异性试验用本方法检测H7N7亚型EIV、马动脉炎病毒(EAV)和马传染性贫血病病毒 (EIAV),分析本方法对其它亚型EIV以及其它马属动物常见病毒的检测情况。 1.6敏感性试验使用血凝效价为25EIV病毒尿嚢液，按照1.3中方法提取病毒RNA,测定浓度， 2倍系列稀释后使用1.4中鉴定得到的最佳RT-PCR条件进行扩增，探讨该方法可检 测RNA的最低量。1.7临床应用试-验对已经从中分离到H3N8亚型EIV的马鼻拭子提取物原始保存液使用本方法鉴 定，比丰支检测结果的符合率。2试验结果2.1 RT-PCR的建立对不同PCR退火温度和循环数进行试验，试验的4个退火 温度、3种循环数均能扩展得到目的片段，53.6。C为最佳退火温度，30次循环与35 次循环的扩展效果相差不大(图1 )。2. 2特异性试验使用95。C5min预变性，94。C30s, 53.6。C40s， 72。C40s, 30个循环，72。C延伸 10min的PCR条件，以H3N8亚型EIV为模板可以扩展得到595bp和227bp两条目 的片段，以H7N7亚型EIV为模板可以扩展得到 一条227bp片段，以EAV和EIAV 为模板不能扩增得到任何片段(图2)。2. 3敏感性试验取血凝效价为25马流感病毒尿囊液250111,使用TRIZOL试 剂提取RNA，终浓度为150ug/ml， 2倍系列稀释后，每个RT反应使用lul模板， 可以检测到2"稀释度样品。即本试验可以检测核酸最低量约为0.15ng (图3 )。2. 4临床应用试验对已经从中分离到H3N8亚型EIV的IO份马鼻拭子提取 物原始保存液使用本方法鉴定，均可同时得到两条目的片段。序列表<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>诊断马流感病毒和鉴定其亚型的多重RT-PCR方法<130〉 KIP翻6<160〉 4<170〉 Patentln version 3. 5<210> 1 <211〉 20 <212>腿<213> artifical sequence <400> 1aattcatcac ccgagttcaa 20<210> 2 <211> 22 <212> DNA<213> artifical sequence <400> 2tttcattaat.ctggtcgatg gc 22<210> 3 <211> 18 <212> DNA<213> artifical sequence <400> 3 ,actgtgacaa ccgaagtg L8<210> 4 <211> 17 <212> ■<213〉 artifical sequence <400〉 4tgcctggcct tactagc 1权利要求
1、一种诊断马流感病毒和鉴定其亚型的多重RT-PCR方法，包括以待检样品的RNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4两组核苷酸序列为多重引物进行RT-PCR反应；如果从待检测的样品中只扩增出了227bp的产物，则该样品为马流感病毒的H7N7亚型；如果从待检测的样品中同时扩增出了227bp和595bp的产物，则该样品为马流感病毒的H3N8亚型；如果从待检测的样品中未扩增出227bp的产物，则该样品不含有马流感病毒。
2 、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反应的退火温度选自 48.8°C、 51.2°C、 53.6。C或55.9°C。
3、 按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反应的退火温度是 53.6。C。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反应的循环次数为30 次循环或35次循环。
5、 按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反应的循环次数为30 次循环。
全文摘要
本发明公开了一种诊断马流感病毒(EIV)和鉴定其亚型的多重RT-PCR方法，包括以待检样品RNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4两组核苷酸序列为多重引物进行RT-PCR反应；如果从样品中只扩增出了227bp的产物，则该样品为EIV的H7N7亚型；如果同时扩增出了227bp和595bp的产物，则该样品为EIV的H3N8亚型；如果未扩增出227bp的产物，则该样品不含有EIV。本发明根据RT-PCR技术原理，根据EIV只有两种HA亚型的特点，建立了多重RT-PCR检测方法，其敏感性强、特异性高，可以用于EIV的快速诊断和亚型鉴定。
文档编号C12Q1/70GK101328508SQ200810132409
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者周建华, 戴伶俐, 李雪峰, 相文华, 赵利平, 巍 郭 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所