专利名称：新鲜秸秆壁蛋白促进秸秆纤维素酶解、发酵的方法
技术领域：
本发明属于木质纤维素的酶解、发酵技术领域，特别涉及利用新鲜玉米秸秆 中的细胞壁蛋白对秸秆酶解、发酵的促进作用，构件的新型秸秆酶解、发酵的新 工艺。新鲜秸秆不仅作为酶解、发酵的底物，还作为纤维素酶及其协同蛋白的来 源，促进纤维素的转化。
背景技术：
秸秆类木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，有效利用秸秆也是缓解 人类所面临的粮食短缺、能源危机和环境污染等问题的有效方法之一。木质纤维 素原料转化燃料乙醇是发展可再生能源的重要途径之一，在世界范围内日益得到 重视。秸秆酶解成可发酵糖是转化的中心环节，但目前的酶解工艺仍然存在酶 解效率低、可发酵糖浓度低、纤维素酶成本高等问题。目前国内外在纤维素乙醇 方面也进行了深入的研究，并取得了阶段性的进展，但迄今仍然难以实现大规模、 经济、清洁的工业化生产。同歩糖化发酵乙醇具有设备简单、节约时间、提高效 率、减少杂菌污染等优点，因此是目前纤维素转化乙醇最有效的途径之一。然而 在酶解、发酵温度不一致，酶成本等方面仍然存在很多问题。
木质纤维素具有极其复杂的结构，天然纤维素聚集态结构复杂且结晶度高， 分子内和分子间存在氢键；纤维素同时与半纤维素、木质素等大分子物质相互缠 绕，形成致密的三维结构。这种复杂的结构降低了纤维素的可及性和反应活性， 增加了水解的难度。
除了纤维素以外，植物细胞壁中存在比较丰富的内源性的纤维素酶及其增效 因子，在植物生长的各个阶段，酶蛋白参与了细胞壁的松弛、合成、分解等过程。 与其它来源的纤维素酶相比，植物内源性细胞壁酶蛋白对细胞壁的作用具有高效、基因调控复杂等特点。在玉米秸秆尤其在新鲜秸秆中也存在比较丰富的细胞 壁蛋白，其中包括内源性纤维素酶及其增效因子。
植物内源性的纤维素酶及其增效因子具有来源丰富、高效等优点，将其作为 纤维素降解的添加剂应用于秸秆的转化，也为幅度降低纤维素酶的成本、提高酶 解效率提供了契机。本发明从对纤维素降解具有促进作用的秸秆细胞壁蛋白入 手，从经济、高效利用植物内源性纤维素酶及其增效因子的角度出发，探索秸秆 的酶解和发酵新工艺。在工艺路线中，新鲜玉米秸秆不仅作用酶解的底物，还作 为酶源促进纤维素的转化。植物秸秆资源丰富，将秸秆细胞壁蛋白应用于木质纤 维素的降解，不仅提高了纤维素的酶解效率，也为降低纤维素酶的成本开辟了崭 新的方向，而且实现了资源的高值化利用，达到了利用植物自身资源高效降解的 目的。
发明内容
本发明涉及新鲜秸秆壁蛋白促进秸秆纤维素酶解、发酵的方法，将新鲜秸秆 中丰富的细胞壁蛋白其作为纤维素酶添加剂应用于秸秆酶解、发酵，从而降低纤 维素酶的成本、提高酶解效率，达到利用秸秆自身资源促进纤维素降解的目的。
本发明的构思如下在新鲜玉米秸秆(FCS)中，仍然有丰富的细胞壁蛋白， 它们参与了细胞壁结构变化的调节，在纤维素酶解中能够促进纤维素的转化。将 新鲜玉米秸秆中的细胞壁蛋白通过简单方法进行提取，然后将混合物与汽爆玉米
秸秆(SECS)混合，调节底物浓度和pH，然后分别进行酶解和发酵。新鲜玉米 秸秆不仅作为酶解的底物，内源性的细胞壁蛋白还能够促进纤维素的酶解。将新 鲜秸秆和汽爆秸秆进行混合发酵，不仅提高了酶解效率，降低了纤维素酶的成本， 还省去了底物的预处理过程，减少了酶解、发酵的步骤。
新鲜秸秆壁蛋白促进秸秆纤维素酶解、发酵的方法，其特征在于包括以下歩
骤
1. 玉米秸秆细胞壁蛋白的提取:将粉碎至40-100目的新鲜玉米秸秆置于 细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4-1/10加入蛋白提取液，4°C静 置12-24 h进行细胞壁蛋白的提取。
42. 新鲜秸秆和汽爆秸秆的混合利用醋酸调节pH至5.0，按照新鲜和蒸 汽爆破玉米秸秆按照干重比1/3-3/1混合，加入醋酸缓冲液(50 mM, pH 5.0)调整底物浓度至20-100 mg/ml。
3. 酶解在调整新鲜和汽爆玉米秸秆比例、底物浓度和pH的基础上， 按照10-30FPU/ (g底物)加入纤维素酶进行酶解，温度45-5(TC， 时间48-72 h。
4. 同步糖化发酵乙醇在调整新鲜和汽爆玉米秸秆比例、底物浓度和pH 的基础上，按照10-40 FPU/(g底物)加入纤维素酶，加入活化酵母， 温度30-37。C，时间72-96 h。
为了分析通过工艺优化后的效果，分别以新鲜、蒸汽爆破玉米秸秆，以及两 者混合的直接发酵为对照，对乙醇产量进行了分析。分别以新鲜和蒸汽爆破玉米 秸秆为底物时，乙醇的产量分别为1.50和1.34 mg/ml。蒸汽爆破和新鲜玉米秸 秆按照干重比V1 (FCS&SECS)直接混合发酵时，产生了 1.56mg/ml的乙醇, 分别比蒸汽爆破和新鲜玉米秸秆单独发酵提高了 16.4%和4%。而新鲜玉米秸秆 先进行细胞壁蛋白的提取，然后与汽爆玉米秸秆按照1/1混合发酵时(FCS & SECS(N))，乙醇的产量为2.85 mg/ml，比两者的直接混合发酵提高了 82.7% (表 1)。
表1不同发酵体系中的乙醇产量
FCSSECSFCS & SECSFCS & SECS (N)
Ethanol production1.501.341.562.85
(mg/ml)
本发明具有以下优点:
1) 秸秆细胞壁蛋白与纤维素酶具有协同作用，可以大幅度提高纤维 素的转化率，节约纤维素酶的用量，达到利用自身资源促进转化 的目的。
2) 在酶解、发酵等转化过程中，新鲜秸秆不仅作为底物，而且作为 纤维素酶的添加剂，秸秆不经过预处理过程，节约了预处理成本。
3) 新鲜秸秆来源丰富，这既保证了充足的原料供应，又实现了秸秆资源的高效利用。
4)新鲜秸秆内源性纤维素酶的最佳温度与酵母菌一致， 一定程度上 解决了酶解和发酵温度不一致的问题。
图1为不同玉米秸秆发酵体系中乙醇产量
分别以新鲜和蒸汽爆破玉米秸秆为底物时，酶解72h，葡萄糖的产量为4.87 和5.15 mg/ml;两者按照干重比1/1直接混合酶解时(FCS & SECS)，葡萄糖生 成了5.21mg/ml;而新鲜玉米秸秆先进行细胞壁蛋白的提取，然后与汽爆玉米秸 秆按照1/1混合时(FCS&SECS(N))，葡萄糖生成了 8.3 mg/ml;分别以新鲜 玉米秸秆和蒸汽爆破玉米秸秆为底物酶解时，纤维二糖分别产生了 0. 76和3.61 mg/ml;当两者按照1/1混合直接酶解时，产生了2.1mg/ml;通过酶解工艺转化 后，产生了 0.45mg/ml纤维二糖(图l)。说明在提取新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白， 然后混合酶解时，卩-葡萄糖苷酶的作用得到了有效的发挥。
具体实施例方式
实例l利用新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白提高玉米秸秆的酶解、发酵效率
将粉碎至60目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/5 加入蛋白提取液，4°C静置12 h进行细胞壁蛋白的提取。利用醋酸调节混合物 pH至4.8。按照新鲜和蒸汽爆破玉米秸秆按照干重比1/1混合，加入醋酸缓冲液 (50mM,pH4.8)调整底物浓度至50 mg/ml;在调整新鲜和汽爆玉米秸秆比例、 底物浓度和pH的基础上，按照20 FPU/ (g底物)加入纤维素酶进行酶解，温 度45。C，时间48h。在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH的基础上，按 照30 FPU/ (g底物)加入纤维素酶，温度37。C，时间72h。
实例2利用新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白提高汽爆小麦秸秆的酶解、发酵效率
将粉碎至40目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/6 加入蛋白提取液，4'C静置15 h进行细胞壁蛋白的提取。利用醋酸调节混合物 pH至4. 8。然后将新鲜玉米秸秆和汽爆小麦秸秆按照千重比1/2混合，加入醋酸缓冲液(60mM, pH4.8)调整底物浓度至80 mg/ml;在调整新鲜玉米秸秆和汽 爆小麦秸秆比例、底物浓度和pH的基础上，按照15 FPU/ (g底物)加入纤维 素酶进行酶解，温度5(TC，时间48 h。在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度 和pH的基础上，按照30 FPU/ (g底物)加入纤维素酶，温度37r，时间72h。
实例3利用新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白提高汽爆稻草的酶解、发酵效率
将粉碎至80目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/7 加入蛋白提取液，4°C静置20 h进行细胞壁蛋白的提取。利用醋酸调节混合物 pH至4. 5。然后将新鲜玉米秸秆和汽爆稻草按照干重比1/3混合，加入醋酸缓冲 液(50mM,pH4.5)调整底物浓度至60 mg/ml;在调整新鲜玉米秸秆和比例、 底物浓度和pH的基础上，按照12 FPU/ (g底物)加入纤维素酶进行酶解，温 度45。C，时间48h。在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH的基础上，按 照25 FPU/ (g底物)加入纤维素酶，温度35"C，时间72 h。
实例4利用新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白提高高梁秸秆的酶解、发酵效率
将粉碎至100目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4 加入蛋白提取液，4'C静置20 h进行细胞壁蛋白的提取。利用醋酸调节混合物 pH至5.0。按照新鲜和蒸汽爆破玉米秸秆按照干重比1/3混合，加入醋酸缓冲液 (50mM,pH4.5)调整底物浓度至80 mg/ml;在调整新鲜玉米秸秆和高粱秸秆 比例、底物浓度和pH的基础上，按照20 FPU/ (g底物)加入纤维素酶进行酶 解，温度5(TC，时间48h。在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH的基础 上，按照30 FPU/ (g底物)加入纤维素酶，温度37'C，时间72 h。
实例5利用新鲜玉米秸秆细胞壁蛋白提高黄竹草的酶解、发酵效率
将粉碎至100目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4 加入蛋白提取液，4°C静置20 h进行细胞壁蛋白的提取。利用醋酸调节混合物 pH至5. 0。然后将新鲜玉米秸秆和蒸汽爆破黄竹草按照干重比1/3混合，加入醋 酸缓冲液(50mM,pH4.5)调整底物浓度至80 mg/ml;在调整新鲜玉米秸秆和 黄竹草比例、底物浓度和pH的基础上，按照20 FPU/ (g底物)加入纤维素酶 进行酶解，温度5CTC，时间48h。在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH 的基础上，按照30 FPU/ (g底物)加入纤维素酶，温度37'C，时间72 h。
权利要求
1.新鲜秸秆壁蛋白促进秸秆纤维素酶解、发酵的方法，其特征在于包括以下步骤1)秸秆细胞壁蛋白的提取将粉碎至40-100目的新鲜玉米秸秆置于细胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4-1/10加入蛋白提取液，4℃静置12-24h进行细胞壁蛋白的提取；2)新鲜秸秆和汽爆秸秆的混合利用醋酸调节pH至4.0-5.0，按照新鲜和蒸汽爆破玉米秸秆按照干重比1/3-3/1混合，加入醋酸缓冲液(20-100mM，pH 4.0-5.0)调整底物浓度至20-100mg/ml；3)酶解在调整新鲜秸秆和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH的基础上，按照10-30FPU/(g底物)加入纤维素酶进行酶解，温度45-50℃，时间48-72h；4)同步糖化发酵乙醇在调整新鲜和汽爆秸秆比例、底物浓度和pH的基础上，按照10-40FPU/(g底物)加入纤维素酶，温度30-37℃，时间72-96h。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于秸秆细胞壁蛋白的来源包括 玉米秸、稻草、豆秸、高梁秸和麦秸。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于的提取缓冲液为15-30 mM 磷酸缓冲液，0.5-1.5 M NaCl， 0.5-2 mM苯甲基磺酰氟，pH 4.5-7.0。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于秸秆包括玉米秸秆、稻草、 麦秸、高梁秸、豆秸、龙须草以及茅草。
全文摘要
本发明提供了一种利用新鲜秸秆细胞壁蛋白促进秸秆类木质纤维素酶解、转化的方法。针对新鲜秸秆细胞壁蛋白的特点，开发了新型秸秆酶解、发酵工艺，将其中丰富、廉价的内源性纤维素酶及其协同因子应用于秸秆转化。在基于新鲜秸秆细胞壁蛋白应用的秸秆转化新工艺中，首先通过新鲜秸秆细胞壁蛋白的高效、经济提取，然后与蒸汽爆破预处理的秸秆进行混合酶解、发酵。工艺的实施不仅提高了纤维素转化效率、降低了纤维素酶成本、也节省了新鲜秸秆的预处理环节成本。新鲜玉米秸秆不仅作为酶解和发酵的底物，也作为纤维素酶及协同因子的来源，达到了利用秸秆自身资源促进纤维素转化的目的。
文档编号C12P7/10GK101633939SQ200810134420
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月23日 优先权日2008年7月23日
发明者王玉美, 邱卫华, 陈洪章, 韩业君 申请人:中国科学院过程工程研究所