专利名称：一种生物碱化合物及其制备方法与作为酶抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有新颖哑嗪环结构的生物碱类化合物，特别是涉及一类具 有酶抑制活性的生物碱化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
自从1929年从真菌中制备出青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰 富来源，绝大多数临床应用的抗生素都来源于真菌和细菌。真菌的代谢产物还 有其他的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，酶抑制剂等。由于海洋环境 的特殊性，海洋真菌能提供陆生真菌无法提供的代谢产物，但目前尚未见到由 海洋真菌获得有药用价值的酶抑制剂产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的生物碱化合物及其制备方法 与作为酶抑制剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。 一种生物碱化合物，其特征在于它的结构式为
OAc OAc
上述生物碱化合物的制备方法，其特征在于先在培养基中对海洋真菌进行 菌种培养，再在发酵培养基中对真菌进行发酵培养，然后将所得发酵液过滤，除去菌体，将滤液加热浓縮，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓縮后进行色谱分离，
将所得洗脱液浓縮，得无色结晶，即为penicillazine;在溶有Penicillazine的溶 液中，.加入溴或二氧化锰，反应后分别得到Penicillazines 1和2;或者在溶有 Penicillazine 2的溶液中，加入醋酸酐，反应后得到Penicillazines 3禾口 4。
上述的生物碱化合物在制备酶抑制剂药物中的应用。
本发明从海洋真菌中获得了一个新的生物碱，并且对该化合物进行了化学 修饰，具有酶抑制活性，能有效地抑制人拓扑异构酶I，可用于开发酶抑制剂药 物，并且原料可以进行大规模生产，不受资源限制，因此应用前景广阔。
具体实施方式
本发明的化合物的制备
(1) 真菌尸em'c/〃/ww sp. 386的菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0%(重量百 分比，下同)、酵母膏0.1%、蛋白胨0.2%、琼脂1.0%、氯化钠0.3%,其余为水， 使用时制成试管斜面，真菌菌株在30t下培养5天。
所述的菌种培养基含有葡萄糖0.1%-5.0% (重量百分比，下同)、酵母膏 0.01%-1%、蛋白胨0.01%-1%、琼脂0.1%-3.0%、氯化钠0.05%-5%，其余为水。
(2) 真菌Pem'c〃m^ sp. 386的发酵培养所用的发酵培养基含有葡萄糖1.0% (重 量百分比，下同)、酵母膏0.1%、蛋白胨0.2%、氯化钠0.3%，其余为水，真菌 菌株于28'C培养30天。
所述的发酵培养基含有葡萄糖0.1%-5.0% (重量百分比，下同)、酵母膏 0.01%-1%、蛋白胨0.01%-1%、氯化钠0.05%-5%，其余为水。
(3) 化合物penicillazine的分离提取
将所得发酵液过滤，除去菌体；加热浓縮后，用乙酸乙酯萃取5次，将所 得萃取液浓缩后，进行层析分离，洗脱液浓縮得无色结晶，即为penicillazine。
(4) Penicillazine 1的制备
称取上述干燥后的Penicillazine (0.1 mol)溶解在冰醋酸中，冰浴条件下，在充分搅拌下将溴(0.2 mol)逐滴滴加到反应溶液中，反应1小时后，向反应 物中加入蒸馏水(200 mL)来终止反应，用乙酸乙酯(500 mL)进行萃取，将 萃取液浓縮后，进行柱层析，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓縮，重结晶后得到化 合物Penicillazine 1 。
(5) Penicillazine 2的制备
称取干燥后的上述Penicillazine (0.1 mol)溶解在干燥的丙酮(50 mL)中， 然后向其中加入新制的固体二氧化锰U00g)作为氧化剂，室温条件搅拌反应 24小时后，用TLC检测，原料消耗完全后，将反应液过滤，滤出的固体氧化剂 用丙酮充分洗涤，将过滤液与洗涤液合并，减压浓縮后，进行柱层析，用乙酸 乙酯与石油醚两者体积比为0.5的洗脱液进行洗脱，将洗脱液浓缩后，重结晶得 至U化合物Penicillazine 2。
(6) Penicillazines 3和4的制备
将干燥的Penicillazine 2 (0.05 mol)溶解在干燥的丙酮(25mL)中，加入 干燥的吡啶(5mL)，室温下将醋酸酐(0.15 mol)逐渐滴加到反应溶液中，反 应物在室温条件下搅拌12小时后，用TLC检测原料消耗完全后，向反应物中加 入蒸馏水终止反应，用氯仿进行萃取，萃取液浓縮后，用制备薄层层析分离， 用乙酸乙酯与石油醚两者体积比为0.3的展开剂展开，分别得到化合物 Penicillazines 3禾卩4。 所得化合物的波谱数据
Penicillazine 1:'H NMR (300MHz, CDC13): S 9.43 (NH), 8.92 (1H, s, C誦4)， 7.16 (1H, s， C-6')， 4.87 (1H， dd, J=2.4， 11.4Hz)， 4.76 (1H， d, J=2.1Hz)， 4.72 (1H, s， -OH), 4.68 (1H, m), 4.50 (1H, m), 4.09 (1H， m), 3.98 (3H， s, -OCH3)， 3.95 (3H, s, -OCH3), 3.78-3.89 (2H， m， C隱6'， C-7')， 3.18 (1H, d， J=19.5Hz, C-4'), 2.52 (1H， d, J=19.5Hz， C國4'). FAB MS: [M+H]+ 669:671:673:675=1:3:3:1.
Penicillazine 2: & NMR (300MHz， acetone-d6): 3 9.35 (NH)， 8.57 (1H， C-4)，7.42 (1H, d， J=8.7Hz，C-5), 7.13 (1H, d， J=8.7Hz, C隱6), 6.96 (1H, dd， J=2.4, 10.5Hz, C-6')， 6.10 (1H， dd, J=2.4, 10.5Hz， C-7'), 5.40 (1H， d， J=6Hz， 8'-OH), 5.09 (1H, s, IO'陽OH)， 4.71 (1H, m, C-8'), 4.39 (1H， dd， J=2.1， 8.4Hz, C-9'), 3.96 (3H, -OCH3), 3.91 (3H, -OCH3), 2.65 (1H, dd, J=2.1， 18.9Hz， C-4')， 2.52 (1H, d， J=18.9Hz， C-4'). 13C画R (75MHz, acetone-d6): <5 197.9 (C-5'), 160.3 (C-2), 157.7 (C-ll')， 153.9 (C-7)， 151.7 (C-7')， 149.2 (C-3'), 143.6 (C-9)， 135.3 (C-8), 120.1 (C-3), 124.2 (C-4)， 122.9 (C-5), 120.7 (C-3), 113,6 (C-IO)， 110.2 (C-6)， 83.4 (C-9'), 68.2 (C-10'), 65.9 (C國8')， 60.8 (C陽12)， 56.4 (C-ll)， 25.3 (C-4'). FAB MS: 430网+.
Penicillazine 3: & NMR (300MHz， acetone-d6): <5 9.35(NH)， 8.57(1H， s, C-4), 7.40(1H, d， J=8.7Hz, C-5)， 7.10(1H, d， J=8.7Hz， C-6)， 6.87(1H, dd， J=2.1， 10.5Hz， C-7')， 6.23(1H， dd， J=2.4, 10.5Hz, C-6'), 5.82(1H, ddd， J=2.1， 4.5, 8.7Hz， C-8'), 5.25(1H, s， IO'-OH)， 4.62(1H， dd, J=1.2， 8.7Hz, C-9'), 3.96(3H, s, -OCH3)， 3.90(3H, s, -OCH3), 2.71(1H， C-4')， 2.16(1H， C-4'). LC MS: 472.8[M+H]+, 495.1[M+Na]+.
Penicillazine 4: 力丽R (300MHz, CDC13): 3 9.41(NH), 8.60(1H, C-4)， 7.23(1H, d， J=8.7Hz， C-5), 6.91(1H， d， J=8.7Hz， C-6)， 6.68(1H， d， J=10.5Hz， C-7')， 6.24(1H， d, J=10.5Hz， C-6'), 5.66(1H， d， J=9.3Hz， C-8')， 5.42(1H， d, J=9.3Hz， C-9'), 4.00(3H， s, -OCH3)， 3.96(3H， s, -OCH3)， 2.99(1H, d， J=18.5Hz, C-4'), 2.22(3H， s, -CO-CH3), 2.14(3H， s， -CO-CH3). 13C NMR(75MHz， CDC13): 5 190.05(C-5')， 169.8(-CO-CH3)， 169.3(-CO-CH3), 159.7(C-2), 157.8(C-11')， 154.3， 147.8， 144.2， 144.1， 136.2， 127.7， 124.7， 122.5， 120.9， U3.9(C國10)， 109.5(C-6)， 75.4(C-10'), 73.3(C-9'), 67.4(C-8')， 61.6(-OCH3), 56.5(-OCH3), 24.14(C陽4')， 20.78(2CO-CH3). LC MS: 537.01 [M+Na]+, 1050.69 [2M+Na]+.
制得的化合物结构式为式中 R为溴离子、R2为
或R为氢离子、R2为
本发明的化合物对人拓扑异构酶I (hTopoI)的活性试验
(1) 所用药品
hT(3po I储藏缓冲液由浓度为50mM的HCI水溶液(pH7.5)、 50 mM的 KC1水溶液、0.05 mM的EDTA水溶液和5 mM的二硫苏糖醇(DTT)水溶液所 组成。
hTopoI反应缓冲液由浓度为175mM的HC1水溶液(pH7.5)、 250 mM 的KC1水溶液、25 mM的MgCl2水溶液、5 mM的DTT水溶液、10 mM的亚 精胺水溶液、0.5 mM的EDTA水溶液和250 ng/mL的牛血清白蛋白(BSA)水 溶液所组成。
hTopoI反应终止液由浓度为3% (重量百分比，下同)十二烷基硫酸钠 (SDS)、 60 mM的EDTA水溶液、50%甘油水溶液和0.25%溴酚兰水溶液所组 成。
(2) 本发明的化合物对hTopo I的抑制性实验
实验时，向4 上述反应缓冲液加入0.5 pg负超螺旋(pBR322)及1U的 hTopoI，加入本发明的化合物浓度为4 mg/mL的水溶液。同时做空白对照、阴 性对照和阳性对照实验，空白对照实验中，加入4 pL上述反应缓冲液、0.5 pg负超螺旋；阴性对照实验中，加入4 nL上述反应缓冲液、0.5 ng负超螺旋、1U的 hTopo I;阳性对照实验中，加入4 ^L上述反应缓冲液、0.5 ng负超螺旋、1U 的hTopo I以及0.5 2 mM的喜树碱水溶液。37 'C下于水浴中恒温反应30 min， 加入4 hTopo I上述反应终止液。使用1%琼脂糖，在TBE中用约80 V/cm电 压于室温下电泳35 min。电泳完毕，用0.5%的溴化乙锭(EB)染色30 min，再用 去离子水漂洗，用Fluor-Smultimager凝胶成像系统分析测试结果。
将对hTopo I有抑制效果的本发明化合物，配制成其终浓度梯度为100 pg/mL、 50 pg/mL、 25 pg/mL、 12.5 pg/mL、 6.25 pg/mL，再重复上述步骤，测 量出最小的抑制浓度值。
(3)本发明的化合物对人拓扑异构酶hTopo I的抑制活性
本发明的化合物均具有抑制人拓扑异构酶hTopo I的活性，其中， Penicillazine l活性最强，最小抑制浓度为8.0 pM，如下表所示。
表l本发明的化合物对人拓扑异构酶I抑制活性
化合物最小抑制浓度 (岸)
Penicillazine 18.0
Penicillazine 218.6
Penicillazine 384.7
Penicillazine 4155.6
本发明的生物碱化合物对人拓扑异构酶I有抑制活性，可将其制成人拓扑异 构酶I的抑制剂药物，制成片剂、胶囊等均可。
权利要求
1.一种生物碱化合物，其特征在于结构式为
2. 权利要求1所述的生物碱化合物的制备方法，其特征在于先在培养基中对海洋真菌 进行菌种培养，再在发酵培养基中对真菌进行发酵培养，然后将所得发酵液过滤，除 去菌体，将滤液加热浓縮，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓缩后进行色谱分离，将所得洗 脱液浓縮，得无色结晶，即为penicillazine;在溶有Penicillazine的溶液中，加入溴或 二氧化锰，反应后分别得到Penicillazines 1和2;或者在溶有Penicillazine 2的溶液中， 加入醋酸酐，反应后得到Penicillazines 3和4。
3. 权利要求1所述的生物碱化合物在制备酶抑制剂药物中的应用。
全文摘要
一种生物碱化合物及其制备方法与作为酶抑制剂的应用，制备时先在培养基中对海洋真菌进行菌种培养，再在发酵培养基中对真菌进行发酵培养，然后将所得发酵液过滤除去菌体，将滤液加热浓缩，用乙酸乙酯萃取；进行色谱分离，将所得洗脱液浓缩后，得到penicillazine；在溶有Penicillazine的溶液中，加入溴或二氧化锰，反应后分别得到Penicillazines 1和2；或者在溶有Penicillazine 2的溶液中，加入醋酸酐，反应后得到Penicillazines 3和4。本发明来源于海洋真菌的生物碱衍生物能有效地抑制人拓扑异构酶I，可用于开发酶抑制剂药物，并且原料可以进行大规模生产。
文档编号C12R1/80GK101307049SQ200810138540
公开日2008年11月19日 申请日期2008年7月14日 优先权日2008年7月14日
发明者佘志刚, 林永成, 王长云, 邵长伦 申请人:中国海洋大学