一种多肽及其应用的制作方法

专利名称：：一种多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于噬菌体展示多肽库技术，涉及一种采用噬菌体多肽库筛选的与SR-A胞浆域相互作用的小分子多肽，以及该多肽的应用。
背景技术：
：动脉粥样硬化性心脑血管疾病是严重危害人类健康的疾病之一。因此，世界各国对动脉粥样硬化的研究、预防及治疗均十分重视。近年来，脂质负荷的泡沫细胞被认为是"治疗的靶点"。抑制脂质在细胞中的积聚、减轻炎症反应已成为当今关注的两个焦点。SR-A(A类清道夫受体)主要在巨噬细胞表面表达，可以无反馈抑制地摄取氧化修饰的LDL(低密度脂蛋白)，导致脂质在细胞内的积聚，从而形成泡沫细胞，最终导致AS(动脉粥样硬化)斑块形成；因此，在抗AS的药物研发中，SR-A可以作为不同于现有药物的新作用靶点。其中，对SR-A的配基结合区的研究及寻求氧化LDL的拮抗剂是当前研究的热点。然而，SR-A的配基种类繁多，比如可以识别某些细菌细胞壁的成分，参与宿主免疫调节；可以清除凋亡细胞等。另外，还有许多配体的功能意义还不清楚。从受体胞外的配基结合位点阻断SR-A对修饰LDL的摄取，则有可能阻断SR-A与其他配基的结合，从而影响受体发挥重要生理功能。而近年来许多研究表明，SR-A的胞浆结构域介导受体的内移及表达，与脂质积聚的关系更为直接。因此，如果以SR-A胞浆域作为干预靶点，将可能干预SR-A介导的脂质在细胞中的积聚，从而干预泡沫细胞的形成。同时，不影响SR-A与其他的配基结合，发挥其生理功能。干预SR-A胞浆域调节受体介导脂质内吞功能的方法之一就是采用能胞浆域结合而阻断受体发挥作用的小分子多肽或化合物。噬菌体展示多肽库技术自问世以来在蛋白质相互作用位点分析、药物设计和疫苗开发、筛选蛋白质所需的配基等方面显示出广阔的应用前景。其筛选的共同点是钓取与蛋白质(如抗体、受体、酶)特异性结合的配基。淘选方法主要以噬菌体表面展示多肽与靶物质的结合为基础，由Smith等建立的亲和选择方法和理论一直延用至今。通过筛选噬菌体多肽库，得到的多肽具有广泛的作用。比如根据筛选所得多肽的一级结构，可以通过计算机进行序列分析，发现与筛选靶点相互作用的天然蛋白质；人工合成筛选所得的多肽，可以作为筛选靶点的抑制剂，抑制其与其他蛋白之间在体内外的相互作用，从而更好地研究靶蛋白的功能等。本研究通过筛选噬菌体多肽库，寻找与SR-A胞浆域相互作用的小分子多肽，研究多肽分子对SR-A介导的脂质内吞等功能的影响。
发明内容本发明的目的是提供一种能与SR-A胞浆域特异性结合的小分子多肽。本发明的另一目的是上述多肽的应用。本发明的目的是通过下列措施实现的一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.l、SEQIDNo.3所示。含有上述多肽的融合蛋白。编码上述多肽的核苷酸序列。含有上述核苷酸序列的表达载体。这些表达载体可以是质粒、噬菌体、细菌、宿主细胞等。上述多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明以CSR-A(SR-A胞浆域)与GST(谷胱甘肽转移酶)融合蛋白为靶点，筛选噬菌体随机多肽库，得到8个噬菌体克隆，与SR-A胞浆域特异性结合，而与GST无交叉反应。经DNA测序，得到三种多肽序列(H5、H9、Hll)。将三种多肽以GST融合蛋白的形式表达，其中GST-H9和GST-H11可以与全长SR-A相结合。将多肽以GST融合蛋白的形式表达，可以与全长SR-A相结合。人工合成多肽Hll(TDRLFMNSIWPG，SEQIDNo.l)，在其氨基端融合一穿膜肽(TAT)，这种融合的多肽TAT-H11可以高速高效地进入细胞，并且该多肽进入细胞的量随着孵育浓度的增加而增加，而随着孵育时间的延长进入细胞内TAT-Hll的量无显著改变。。H11与SR-A结合后，可以抑制诱导分化的THP-1细胞结合摄取AcLDL(乙酰化低密度脂蛋白)。这为干预脂质在细胞内积聚，从而干预泡沫细胞的形成奠定了基础。本发明的有益效果本发明以SR-A的胞浆域为靶点，通过噬菌体随机多肽库，得到了与SR-A特异性结合的多肽Hll、H9。人工合成多肽Hll，研究发现该多肽可以抑制诱导分化的THP-1细胞结合摄取AcLDL，这为干预脂质在细胞内积聚，从而干预泡沫细胞的形成奠定了基础。故这些多肽及其核苷酸序列、融合蛋白等可用于制备抗动脉粥样硬化药物。图1.1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定挑选克隆的PCR结果1:为阳性对照，以插入全长SR-A基因的质粒为模板，行PCR扩增后的产物；2:为挑选的克隆，抽提质粒后，行PCR扩增后的产物；M:为低分子量Marker(2000):图2.Western-Blot检测GST-CSRA融合蛋白的表达泳道1:诱导表达的PGEX-2T-CSRA/BL21菌体总蛋白；泳道2:诱导表达的PGEX-2T/BL21菌体总蛋白泳道3:未诱导表达的PGEX-2T-CSRA/BL21菌体总蛋白泳道4:预染蛋白质分子量标准；图3.12%SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳验证GST-CSRA融合蛋白的表达与纯化结果泳道h纯化的GST-CSRA融合蛋白；泳道2:诱导表达的PGEX-2T-CSRA/BL21菌体裂解后的上清；泳道3:未诱导表达的PGEX-2T-CSRA/BL21菌体裂解后上清；泳道4:蛋白质分子量标准；泳道5:诱导表达的PGEX-2T/BL21菌体裂解的上清；泳道6:BL21菌体裂解的上清；图4.ELISA(酶联免疫特异性测定)鉴定筛选所得到的噬菌体克隆与CSRA特异性^口aH4—H12:为噬菌体克隆；M13:为野生型M,3噬菌体。图5.阳性噬菌体克隆双链DNA电泳分析M:为DNA分子量标准(15000);H4-H12:为噬菌体单链DNA;M13:为野生型噬菌体单链DNA;图6.ELISA分析GST-多肽与SR-A的结合图7.GST-多肽与SR-A在体外的相互结合上排从glutathione-S印harosebeads(谷胱甘肽琼脂糖珠子)上洗脱下来的蛋白，用抗His抗体进行Western-blot分析多肽与SR-A相互结合；(10%I叩ut:加入到结合了GST融合蛋白珠子中的细胞裂解液量的10%)下排从glutathione-S印harosebeads上洗脱下来的蛋白，SDS-PAGE分析，与珠子相互结合的GST及GST-H9、GST-Hll融合蛋白；图8.荧光显微镜观察TAT-Hll进入细胞内(放大400倍)A禾口B:TAT-Hll在THP-1细胞内的分布(A为荧光，B为明场光)；C和D:THP-l细胞。(C为荧光，D为明场光)；图9.流式细胞仪检测TAT-Hll进入细胞的量。A.不同浓度的多肽FITC-TAT-Hll与细胞共孵育30min后，用流式细胞仪检测进入细胞内多肽的量B.同一浓度(O.lMM)多肽加入细胞中，孵育不同的时间后，用流式细胞仪检测进入细胞内多肽的量图10.MTT分析不同浓度多肽对细胞的毒性作用。*:p<0.05，有统计学意义。(与未加多肽的细胞相比)图11.不同浓度多肽对SR-A介导DiI-AcLDL摄取的影响*:p〈0.05,有统计学意义，与未加TAT-Hll对照组相比。a.诱导分化的THP-1在未加多肽时，对Dil-AcLDL的摄取；b.DiI-AcLDL与大量未标记AcLDL共孵育时，诱导分化的THP-1对Dil-AcLDL的摄取；c，d,e.在诱导分化的THP-1细胞中加入TAT-Hll0.l(aM，l.OjaM，10pM后，细胞对DiI-AcLDL的摄取；图12.不同浓度多肽对SR-A介导DiI-AcLDL结合的影响*:p<0.05,有统计学意义，与未加TAT-Hll对照组相比a.诱导分化的THP-1在未加多肽时，对Dil-AcLDL的结合；b.DiI-AcLDL与大量未标记AcLDL共孵育时，诱导分化的THP-1对Dil-AcLDL的结合；c，d,e.在诱导分化的THP-1细胞中加入TAT-Hll0.lpM，1.0jiM，lOiaM后，细胞对DiI-AcLDL的结合；具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步阐述。实施例l、筛选与A类清道夫受体胞浆结构域结合的多肽1.A类清道夫受体胞桨域(CSRA)与谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白(GST-CSRA)的表达与纯化1.1.PGEX-2T-CSRA原核表达载体的构建1.1.1.PCR引物设计根据SR-A胞浆结构域两端基因序列(为现有技术已知序列)设计PCR引物，引物两侧分别插入Say7M与的酶切位点及保护碱基。引物序列-上游引物5，-CGCGGATCCATGGCACAGTGGGATGA-3，(SEQIDNo.4)下游引物5，-CCGGAATTCTTTATAAGACTTCATCCTCT-3，(SEQIDNo.5)其中GGATCC为的酶切位点，GAATTC为￡coiI的酶切位点。PCR反应以含有SR-A全长基因的pcDNA3.1质粒(SR-A全长基因长度为3683个碱基，插入位置为S抓//1酶切位点，///^////酶切位点之间)为模板，行PCR反应得到CSRA基因。PCR扩增的反应体系和循环参数如下PCR循环参数设为94。C预变性5min，94。C变性30sec—58。C复性30sec—72。C延伸1min,30个循环。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳约60min，应用UVP凝胶成像系统扫描分析。PCR反应体系反应体系成分体积Ul)模板3.0IOX缓冲液5.0r邵酶0.7氯化镁(25mM)4.0脱氧核苷三磷酸(2mM)2.5上游引物(5pM)2.0下游引物(5uM)2.0消毒去离子水30.8总反应体积501.1.3.PCR产物纯化在琼脂糖凝胶电泳中分离目的基因(CSRA基因)，用QiaquickGelExtractionKit(DNA回收试剂盒)回收纯化目的基因片段。步骤如下割取目的基因条带，放入1.5ml离心管中，称重。(所割取的凝胶体积尽可能少)。按每100mg胶重加入300ml的比例，加入BufferQG(缓冲液QG)。50。C恒温水浴中孵育10min，每2-3min涡旋一次。将完全溶解的胶液加入到SpinColumn管(离心管)中，13000rpm离心1min，弃去滤液。加入0.5mlBufferQG至柱子上，13000rpm离心1min,弃去滤液。加入0.75ml含有乙醇的BufferPE(缓冲液PE)至柱子卜.，保留2-5min.13000rpm离心1min，弃去滤液。13000rpm再离心1min。将柱子移入干净的1.5ml离心管中，加入30piBufferEB(缓冲液EB)，保留1min,13000卬m离心1min，收集滤液，即为纯化的目的基因产物。基因定量。GeneQuant基因定量仪先用去离子水调零，取lpl纯化产物，用去离子水1:100稀释，加入比色杯中，测定PCR产物纯化后含量及纯度。1丄4.限制性核酸内切酶酶切用Promega公司的限制性核酸内切酶Sa/w//1和对纯化的PCR产物及质粒pGEX-2T(为公知质粒)进行双酶切。酶切反应体系反应体系成分反应lUl)反应2(ul)PCR纯化产物15—pc腿3.1—121111IOX缓冲液33BSA0.30.3消毒去离子水9.712.7总反应体积3030上述酶切反应体系置于37r水浴中过夜，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。U.5.酶切产物纯化方法参照实验方法l丄3。1丄6.连接以T4DNAligase(连接酶)将纯化后PCR产物连接到pGEX-2T载体上。反应体系如下反应体系成分体积Oil)酶切PCR产物3pGEX-2T载体310x缓冲液2T4DNAligase1消毒去离子水11总反应体积20混匀后，轻微离心，置于连接仪中，4'C过夜。连接产物4'C保存。1丄7.转化将实验1.1.6的连接产物转化入感受态DH5a细胞(感受态细胞的制备参见《分子克隆》第三版)取感受态细菌3管，分别加入连接产物5ul、pGEX-2T载体lul、消毒去离子水5"1，轻轻摇匀，置于冰上30min。42。C水浴45sec,使细菌热休克。立即置于冰上2min。每管加SOC培养液(20g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.5g/LNaCl，20mmol/L葡萄糖，2mol/LMgCl2,PH值7.0)到总体积1ml，37。C水浴孵育15min。160-180rpm/min振荡培养45min，恢复细胞抗性。5000rpm/min离心1min，弃去800u1上清。轻轻摇荡重悬菌液，取150ul涂于含氨苄青霉素的LB培养上，37t:培养过夜。次曰挑取细菌克隆，培养于含氨苄青霉素的LB培养液中。抽提质粒。(碱裂解法，见《分子克隆》第三版)1.1.8.克隆鉴定、测序以抽提质粒(pGEX-2T-CSRA)为模板进行PCR鉴定(实验方法参见实验1.1.2)。根据鉴定结果，阳性克隆送上海英骏生物有限公司测序，测序结果正确。1.2.GST-CSRA融合蛋白的诱导表达与纯化1.2.1.制备感受态大肠杆菌BL21(DE3)(为本领域技术人员熟知的技术)。1.2.2.将测序鉴定插入了SR-A胞浆域基因的重组阳性质粒(pGEX-2T-CSRA)(即将SR-A胞浆域基因插入pGEX-2T质粒，重新组成一个新质粒pGEX-2T-CSRA)转化感受态BL21(DE3)，方法参见1.1.7。1.2.3.GST-CSRA融合蛋白诱导表达条件优化1)从1.2.2中转化过夜的平板中挑取单克隆BL2K带有PGEX-2T-CSRA质粒)细菌，至5mlLB培养液中(含有氨苄青霉素终浓度为100(ag/ml)，37。C，220rpm振摇过夜。2)1:100放大上述过夜培养的细菌，即吸取500y1细菌至50mlLB培养液中(A即，100叫/ml)，30。C，220rpm,摇菌至0D6。。=0.6(约2-3h)。3)停止后，在无菌条件下，将上述培养液分装至消毒好的离心管中，每管8ml，取三管，分别加IPTG至终浓度分别为0.1mM,1mM，10mM，继续30。C,220rpm，摇菌3h。4)停止后，4。C，6000rpm，离心2min,弃上清。5)每管中加入5ml预冷的PBS重悬，6000rpm,离心2min,弃上清。6)最后用500u1冰PBS重悬，放入-80'C冻存。7)超声破膜提取蛋白质把样品置于冰上，超声5sec,间歇lsec，总共超声3min。8)超声后，10000rpm,4'C,离心10min,转移上清至新的离心管中。9)留取一定量(约15ul)的样品，SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达的融合蛋白。同样的方法，在诱导温度(30。C)及IPTG浓度(0.1mM)不变的情况下，确定诱导的时间(1h，3h，5h，8h，12h,过夜)。1.2.4.GST-CSRA融合蛋白的SDS-PAGE电泳及Western-Blot鉴定SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳配制12%的分离胶和3%的浓縮胶。取15u1样品液和3"16X加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30yg。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。然后，用考马斯亮蓝染液染色过夜。如行Western-Blot，则继续2)。SDS-PAGE的配制成分分离胶(12%)浓縮胶(3%)去离子水1.6ml1.8ml30%AA母液2.0ml0.3ml1.5MTris-HC1(PH8.8)1.3ml1MTris-HC1(PH6.8)—-0.75ml10%SDS50u130u110免过硫酸胺(APS)50ul50ulTEMED5"15u1总体积5ml3ml转膜电泳完毕后，切去浓縮胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/LTris,300ml/L甲醇，17.3g/L甘氨酸)中平衡1020min。用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上(SDS-凝胶位于负极，PVDF膜位于正极)，0.3A恒流电泳80min。封闭转膜结束后，取下PVDF膜，PBS浸泡5min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中lh。已转膜的凝胶用考马斯亮蓝染液染色1h,脱色液脱色30min，观察凝胶上残留蛋白情况，判断转膜效率。一抗孵育封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入羊抗人GST抗体(1%MPBS1:5000稀释)，4'C摇动下过夜。二抗结合PBS-T(PBS中加入Tween-20,浓度为0.05%)快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10minX3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(1%MPBS1:2000稀释)，室温下孵育1h。PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10minX3遍。ECL显色临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，于显影液、定影液中冲洗照片，观察结果。1.2.5.GST-CSRA融合蛋白的纯化按照上述优化的条件(IPTG:0.1mM,诱导温度30'C，诱导时间8h)，大量诱导表达融合蛋白及GST。然后，用"Prepackedglutathiones印harose4B(预包装的谷胱甘肽琼脂糖4B)"纯化蛋白，具体步骤如下1)用10-20mlPBS(PH7.3)洗柱，去除保存此预装柱的乙醇。2)用6mlPBS+l%TritonX-IOO平衡柱子。3)诱导表达的蛋白用0.45ym的滤膜过滤，以防堵塞纯化柱后，样品加至平衡好的纯化柱中。(注意此时要降低液体过柱的速度，使得样品与柱中的凝胶充分结合。)4)用20mlPBS洗柱。5)用10ml洗脱液(5mM谷胱甘肽溶于50mMTris-HC1PH8.0)，洗脱纯化的蛋白，0.5ml每管收集蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定纯化的效果，方法同上(1.2.4)。6)最后，用20mlPBS还原柱子，同时用20%的乙醇封柱，保存于4°C。2.以纯化的GST-CSRA蛋白为靶点，筛选噬菌体十二肽库2.1.淘选过程(所用试剂均需灭菌)1)处理glutathiones印harose4B(谷胱甘肽琼脂糖4B)，取50tUs印harose(琼脂糖)置于1.5ml灭菌EP管中，用1mlTBS洗涤2-3次。2)用lml10mg/mlBSA加入上述EP管中，4°C,封闭1h。3)4°C，800rpm，离心3min，用TBS洗涤4次。4)每管中分别加入用TBS稀释的10pg纯化的GST及GST-CSRA，使得EP管中液体体积为250ul，4'C，温和振荡过夜。5)取出加有GST的glutathiones印harose4B，4。C，800rpm，离心3min，用TBS洗涤4次，每次用1ml。6)在上述EP管中加入用250ulTBS稀释的噬菌体多肽库(10pl原库，滴度为2xl0"pfu)，室温下振荡2h。7)4。C，800卬m离心3min，将上清吸出，同时用250nlTBS洗涤一次，将上清和洗漆液混合后加入含有GST-CSRA的glutathiones印harose4B中(此为不与GST结合的噬菌体多肽)，室温下振荡2h。8)4。C，800rpm，离心3min，弃上清，用TBS-T(TBS+0.3%Tween-20)洗涤10次，每次用1ml。9)在上述EP管中加入100u15mM谷胱甘肽，室温下轻轻振摇30min，洗脱与GST-CSRA结合的噬菌体多肽。10)滴度测定取10"l洗脱液倍比稀释，取2，3，4次稀释度，测定滴度，计算洗脱噬菌体总数。方法(a)挑取ER2738单克隆细菌(ER2738细菌是公知的)至5mlLB培养液中，37。C振摇过夜。1:100放大培养细菌至对数生长期(OD6oo约0.4-0.6)。(b)将LB平板预先放入37t:孵箱中预热约15min。(c)将顶琼脂融化，分装至3ml灭菌试管中，放入53r恒温水浴锅中，防止琼脂凝固。(d)用LB培养液稀释噬菌体洗脱液。倍比稀释10—'-10—4。(e)取不同稀释度(10"-l(T4)的噬菌体10til，将其加至200"l对数生长期的ER2738菌中，同时加入5ul100mMIPTG，20ul40mg/mlX-Gal，混匀后，加入融化的顶琼脂中，迅速将此液体倒至LB平板上铺平，放入37'C孵箱中过夜。(f)次日记数蓝色噬菌体斑，以计算噬菌体滴度(噬菌体斑的个数除以io再乘以稀释度)。11)扩增剩余的洗脱噬菌体液加入到20ml早对数生长期ER2738细菌溶液中，37°C，250rpm振荡培养4.5h。结束后，4。C，10,000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中，加1/6体积的20XPEG/NaCl，4'C富集过夜。第二天，4。C，10,000rmp离心10min，弃上清。沉淀用1mlTBS重悬。加1/6体积PEG/NaCl，冰上2.5h。继续离心，最终沉淀用200ulTBS重悬，并测得扩增后的滴度。12)重复淘选后面几轮筛库，步骤同第一轮淘选。但蛋白包被量递减。第二轮8Ug/管，第三轮5ug/管，第四轮2ug/管。同时，适当增加洗漆过程中TBS-T的Tween-20的浓度及洗涤次数，以减少噬菌体与靶蛋白的非特异性结合，其中加入的噬菌体为上一轮的扩增的噬菌体液，滴度逐渐减少。最后一轮筛得的噬菌体测定滴度时所得的单菌落保留，以进行下一步的鉴定。2.2.噬菌体克隆的挑选2.2.1.从最后一轮筛选保存的平板上，随机挑选50个分离良好的单菌落，扩增。1)将过夜培养的细菌ER2738，用LB培养液按1:100比例稀释后分装至lml培养管中。2)用消毒的枪头从平板上挑取噬菌体克隆，主要挑取分离良好的噬菌斑，将其放至含有ER2738菌的lml培养液中。37°C，250rpm，振摇4.5-5h。3)将振摇后的培养液转移至1.5mlEP管中，12,000rpm，离心30sec，转移上清至一个新的EP管中。此含有噬菌体的培养液上清可以在4'C储存数周。如要长期保存，则在上清中按l:l比例加入灭菌的甘油，储存于-20'C。2.2.2.ELISA法初步挑选阳性克隆1)包被取0.1MNaHC03(PH8.6)稀释的经初步纯化GST-CSRA及GST100pl(约5吗/孑L)包被酶标板，4'C静置过夜。2)封闭吸出包被液(纯化的GST-CSRA及GST)，加300^12%MPBS，37°。静置2h或4'C过夜。3)结合吸出封闭液(12%MPBS)，如筛库时所述地洗涤，每孔加入lOO(alPBS稀释的单克隆噬菌体液，37'C静置2h。4)抗体结合甩出噬菌体液，如前所述洗涤，次数适当增加。每孔加入以封闭液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的M13噬菌体抗体100pl，37'C静置2h。5)显色甩出抗体溶液，洗涤。各加100|ilTMB显色底物溶液，37'C于黑暗处显色30min。6)终止加入2mol/L的H2SCV溶液50pl，终止反应。7)读取各孔490nm处的吸光度值，记录数据。从中挑出GST-CSRA吸光度值与GST吸光度值之比大于2.5噬菌体克隆，视为阳性克隆进一步实验。2.2.3.提取阳性噬菌体克隆DNA及测序1)噬菌体单克隆扩增离心后，将500u1含有噬菌体的上清移至一个新的EP管中。2)在上清中加入200ulPEG/NaCl混匀后，室温放置10min。3)离心10min后，弃上清，弃尽。4)用100y1LodideBuffer(碘甲胆碱缓冲液)(10mMTris-HClPH8.0,1mMEDTA,4MNal，避光储存在室温下)和250"1无水乙醇彻底重悬沉淀，在室温下作用10min。5)离心10min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀，置于超净台中，吹干。6)用30y1TEBuffer(溶解DNA的常缓冲液)(10tnMTris-HClPH8.0，1mMEDTA)重悬。7)1.0y。琼脂糖凝胶电泳鉴定抽提的DNA。8)取IOnl抽提的噬菌体DNA，送上海英俊生物公司测序，测序结果正确。实施例2、筛选所得到多肽与GST-CSRA结合的噬菌体多肽的功能研究1.筛选所得噬菌体多肽(H5、H9、Hll)与GST的融合蛋白的表达与纯化多肽与GST融合蛋白的表达与纯化过程和GST-CSRA的表达与纯化过程相似，不同之处在于载体构建。(1)PCR引物设计H5:5'-GATCCACGTTTTGGGATGATGGTTGGCTTCTGTTGCCTCGG-3'(SEQIDNo.6)5'-AATTCGAGGCAACAGAAGCCAACCATCATCCCAAAACGTG-3'(SEQIDNo.7)H9:5'-GATCCTATGGGGATAGGTGGTTTATGCCTGTGATGCGGTCG-3'(SEQIDNo.8)5'-AATTCGACCGCATCACAGGCATAAACCACCTATCCCCATAG-3'(SEQIDNo.9)Hll:5'-GATCCACTGATAGGCTGTTTATGAATTCTATTTGGCCGGGG-3'(SEQIDNo.10)5'-AATTCCCCGGCCAAATAGAATTCATAAACAGCCTATCAGTG-3'(SEQIDNo.11)其中GGATCC为fe/M的酶切位点，GAATTC为fco/fT的酶切位点。(2)引物退火反应体系成分体积(pi)5X退火缓冲液10.0上游引物3.5下游引物3.5去离子水33.0总体积50.0上述混合物置于9(TC水浴锅中5min，然后再置于7(TC水浴10min，将其拿出，慢慢冷却至室温。(3)载体(PGEX-2T)双酶切。(见1.1.4)(4)割胶纯化酶切后的载体。(见1.1.3)(5)连接连接体系见1.1.6。(6)连接产物转化。(见L1.7)随机挑选5个克隆，送上海博亚生物有限公司测序。测序为阳性的克隆转化至BL21(DE3)菌中，诱导表达及纯化GST与多肽的融合蛋白。(方法见L2)2.GST-H5(H9、Hll)与全长SR-A在体外的结合2.1.ELISA法验证多肽与全长SR-A在体外的结合1)包被取lOOplPBS稀释的经初步纯化的GST-多肽及GST(约5ng/孔)包被酶标板，4'C静置过夜。2)封闭吸出包被液(纯化的GST-多肽及GST)，加30(^15%Milk-PBS，37°C静置2h或4'C过夜。3)结合吸出封闭液(5%Milk-PBS),用0.1%PBS-T洗涤6遍，每孔加入100|ilMPBS-T稀释的纯化好的全长SR-A(在SR-A羧基端带有6个His氨基酸)，37。C静置2h。4)抗体结合甩出液体，如前所述洗涤，约8次。每孔加入以封闭液按1:2000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的抗His抗体100|_d，37'C静置2h。5)显色甩出抗体溶液，洗涤。各加IOOpiTMB显色底物溶液，37'C于黑暗处显色30min。6)终止加入2mol/L的H2S(V溶液50fil，终止反应。7)读取各孔490nm处的吸光度值，记录数据。2.2.GST-pulldown分析多肽与全长SR-A在体外的结合在50pi平衡好的50%glutathiones印harose4B琼脂糖珠中分别加入10(ig纯化的GST，GST-H9(Hll)，4。C振摇过夜。用裂解缓冲液(20mmol/LTris-CI(PH8.0),200mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA(PH8.0)，0.5%NonidetP-40)洗去未结合的蛋白。然后，加入裂解的转染了全长SR-A基因的CHO细胞蛋白，4'C振摇2h。1000rpm，4'C离心后弃上清，用裂解液洗琼脂糖珠，每次约lml,共洗涤8遍，去除非特异结合的蛋白，用50nl2X蛋白上样缓冲液洗脱GST及融合蛋白与细胞蛋白混合物。1/3洗脱的蛋白混合物用10%SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染液染色过夜。2/3洗脱的蛋白混合物用10%SDS-PAGE分离，进行Western-Blot检测，用抗His抗体检测混合物中相应的蛋白，ECL显色(具体过程见1.2.4)。人工合成多肽TAT-Hll及多肽TAT(穿膜肽TAT)。3.1.TAT-Hll可以穿过THP-1细胞膜进入胞内THP-1细胞用含有10%小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基，在37。C、5%C02的细胞培养箱中培养。实验前，在培养基中加入200nM佛波酯，刺激THP-l细胞贴壁。72h后，换用无血清的1640培养基，同时加入不同浓度人工合成的FITC标记多肽TAT-H11(0.l(Jl，1jiM，10|nM)，37'C孵育30min。将细胞从培养板中刮下，用PBS洗涤3次，最终用300plPBS重悬，用于流式细胞仪检测多肽进入细胞的量。同样，在细胞中加入O.1(JI荧光标记的TAT-Hll，37。C孵育不同时间(15min，30min,1h，2h)，用流式细胞仪检测多肽进入细胞的量。在THP-1细胞中加入l一TAT-Hll，37°C孵育30min后，用荧光显微镜观察多肽在细胞内的分布情况。3.2.TAT-H11对细胞的毒性实验(MTT分析)THP-1细胞按上述方法培养。实验前，将104细胞种在96孔细胞板中，刺激THP-1细胞贴壁。72h后，换用无血清的RPMI-1640培养基，同时加入不同浓度(O.Ol)aM-100|_iM)的TAT-Hll，37'C孵育30min后，将培养液吸弃，每孔200u1培养液中加四甲基噻唑蓝液(MTT，用pH7.4的RPMI-1640培养液配成5mg/ml，滤菌后4。C避光保存)25u1，37匸孵育4h，镜下可见紫蓝色针状结晶。弃上清液，每孔加200ul二甲基亚砜(DMSO)，用CliniBio-128酶标仪于波长492nm处读取OD值。3.3.TAT-H11对SR-A介导的Dil-AcLDL结合与摄取的影响THP-1细胞按上述方法培养。实验前，按每孔2"05细胞数接种于24孔板。①正常组用无FCS的1640培养基继续培养；②加TAT-H11组用无FCS的1640培养基稀释TAT-Hll，浓度为O.lpM，l.O一，10一，加入细胞培养孔中；③加TAT对照肽组同TAT-H11相同稀释浓度，加入细胞中，37。C孵育30min。然后，用PMA(200nM)刺激细胞贴壁，培养72h。用PBS洗涤细胞3次，用无FCS的1640培养基培养，每孔加DiI-AcLDLG0(ig/ml)，4'C或37'C培养2h。培养结束后，按照上述方法收获THP-1细胞，用流式细胞仪检测细胞结合摄取Di1-AcLDL的量。该实验重复3次，实验组与未加多肽组相比，P〈0.05有统计学意义。三、统计学处理所有数据以均数士标准差(；±s)表示，两样本之间比较用f检验，以p〈0.05具有统计学意义。结果一、GST-CSRA融合蛋白的可溶性表达1.GST-CSRA融合蛋白表达载体的构建及鉴定以构建好含有A类清道夫受体全长基因的pcDNA3.1质粒为模板，通过PCR的方法扩增得到A类清道夫受体的胞浆域基因，将该基因插入至原核表达载体PGEX-2T，然后转化f"h'BL21(DE3),用含有氨苄青霉素的LB平板筛选克隆。挑选单克隆，行PCR鉴定(图l),有目的基因者用ABI377DNA自动测序仪测序，证实插入的SR-A胞浆域基因序列正确，读框无误。2.GST-CSRA融合蛋白的诱导表达与纯化阳性重组质粒(PGEX-2T-CSRA)转化感受态￡coh'BL21(DE3)，得到GST-CSRA融合蛋白的表达菌株。经0.1mMIPTG，30'C诱导8h后收集细菌沉淀，超声裂解，SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白为可溶性表达。由电泳结果可见重组菌有一明显的33KDa左右新生蛋白质带，薄层扫描分析显示，蛋白质的表达量约占菌体蛋白质的30%,与带有GST蛋白标签的CSRA融合蛋白的分子量理论值大小相符。Western-blot结果表明诱导表达的PGEX-2T-CSRA/BL21菌体总蛋白在33KDa处出现一阳性条带。该蛋白存在于裂解菌体的上清中，主要以可溶的形式表达。空载体组无此蛋白条带(图2)。蛋白经GST亲和层析纯化后，经薄层扫描分析显示，目的蛋白纯度可达95%以上(图3)。二、筛选与GST-CSRA融合蛋白结合的噬菌体多肽1.筛选GST-CSRA融合蛋白结合多肽的结果利用GST-CSRA融合蛋白作为耙点，通过四轮"吸附-洗脱-扩增"亲和筛选后，噬菌体表面呈现的随机多肽与靶蛋白结合。对四轮淘筛的噬菌体富集率进行比较，显示第一轮至第四轮筛选所得的噬菌体回收率逐步提高，说明与靶蛋白结合的噬菌体得到了富集。洗脱噬菌体的滴度以及相对产出率见表l。表l.每轮筛选所用噬菌体的量及回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*:相对产出率=洗脱噬菌体/加入噬菌体2.ELISA法鉴定与CSRA相互作用的噬菌体多肽第四轮筛选结束后，分别从测定滴度的LB、IPTG、X-gal平皿上随机选取50个蓝色噬斑，分别经扩增后，收集重组噬菌体的上清，进行ELISA检测。以GST为阴性对照孔，TMB显色后，测定相应克隆的每个实验孔的OD45。nm。结果50个噬菌体克隆中，有8个克隆实验孔读数大于0.15，且与GST结合孔的读数之比值大于2.5。重复四次实验，得到类似的结果。该结果表明，这8个阳性克隆可与CSRA特异性的结合，而不与GST结合(图4)。3.阳性噬菌体克隆测序模板的抽提将8个阳性噬菌体克隆扩增、提取单链DNA。经电泳分析均可见到清晰明亮的DNA条带(图5)。4.DNA序列测定及同源性分析对8个阳性噬菌体克隆进行DNA测序确定插入序列并推导相应的氨基酸序列。结果显示8个克隆中，H4、H6、H7、HIO、Hll、H12克隆序列相同，为TDRLFMNSIWPG(SEQIDNo.l)，克隆H5序列为TFWDDGWLLLPR(SEQIDNo.2)，克隆H9序列为YGDRWFMPVMRS(SEQIDNo.3)。将此三条序列提交PIR国际蛋白质数据库(http://pir.georgetown.edu/)进行比对，未发现与这些多肽序列相匹配的同源蛋白。比对发现在TFWDDGWLLLPR多肽中存在着CKII蛋白激酶的磷酸化位点(TFWD)，TDRLFMNSIWPG中存在着PKC蛋白激酶的磷酸化位点(TDR)。三、筛选得到的噬菌体多肽与全长SR-A相互结合得到阳性噬菌体克隆序列后，为了进一步验证筛选的多肽与SR-A相互作用，我们构建了多肽(H5、H9、HU)与GST的融合表达载体，并表达纯化了GST-多肽融合蛋白。以GST蛋白为阴性对照孔，ELISA法分析发现，GST-H9和GST-H11可以与原核表达纯化的全长SR-A相互结合，而GST和GST-H5并未能与之结合(图6)。为了进一步验证多肽与SR-A相互结合，将构建好插入全长SR-A基因的pcDNA3.1质粒瞬时转染入CHO细胞，24h后裂解细胞，收获细胞蛋白。通过GSTPull-down分析发现，GST-H9及GST-H11均可以与SR-A特异结合(图7)。四、多肽HU的功能为了研究与CSRA相互结合多肽(H11)对SR-A功能的影响，人工合成了多肽TAT-Hll，即在Hll的氨基端加了穿膜肽TAT。TAT序列为RKKRRQRRR，富含有精氨酸和赖氨酸，研究证明，它可以携带外源性蛋白质、核酸等大分子物质跨胞膜转运，对细胞没有毒性且不影响所携带大分子物质的功能。因此，实验中在Hll的氨基端融合了TAT，以携带多肽进入细胞，从而使得其与SR-A相互结合，发挥作用。1.荧光显微镜观察多肽进入细胞THP-1细胞经PMA诱导分化72h后，加入FITC标记的TAT-H11(10pM),37。C孵育30min。用荧光显微镜观察，可见细胞内有TAT-Hll的进入(图8)。在细胞内加入不同浓度FITC标记的TAT-Hll，或加入同一浓度多肽孵育不同时间，用流式细胞仪检测到多肽TAT-Hll进入细胞的量随着其加入浓度的增加而增加，而随着孵育时间的延长进入细胞内TAT-H11的量未见显著变化(图9)。2.TAT-H11的细胞毒性实验MTT结果显示，多肽TAT-Hll在50fiM范围内，对细胞没有毒性。当多肽浓度增加到100pM时，可见加多肽组细胞与对照组(未加多肽组)相比，MTTOD492。m值减少了37%,两组细胞之间MTT读数有显著性差异(P<0.05，见图10)，表明多肽TAT-Hll在此浓度时抑制了琥珀酸脱氢酶的活性，对细胞产生一定的毒性作用。3.TAT-H11对SR-A介导的DiI-AcLDL结合和摄取的影响(Ac-LDL与氧化LDL都是化学修饰LDL的一种，Dil-AcLDL是荧光标记的AcLDL，便于流式细胞仪对细胞结合内吞脂质的检测。细胞内吞大量的AcLDL或氧化LDL可以造成泡沫细胞的形成。)为了研究多肽TAT-Hll对SR-A介导的脂质摄取功能的影响，我们用PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，使得清道夫受体在细胞表面大量表达。将DiI-AcLDL(10Hg/ml)加入诱导分化的细胞中，37'C孵育2小时，用流式细胞仪检测细胞摄取Ac-LDL的量。通过竞争抑制实验，即在细胞中加入大量(约加入标记AcLDL量的40倍)未标记的Ac-LDL与DiI-AcLDL共孵育，结果其荧光读值与只加DiI-AcLDL组相比显著减少，证明DiI-AcLDL是细胞通过受体特异摄取的(图10，Ac-LDL)。当在细胞中加入不同浓度的TAT-Hll多肽后，结果发现细胞摄取DiI-AcLDL呈浓度依赖性的减少，最低减少了约37%(与未加TAT-H11组相比)。而细胞中加入相同浓度的TAT对照肽时，其摄取DiI-AcLDL未受影响(见图11)。为了进一步检测TAT-Hl1影响了DiI-AcLDL与细胞的结合过程，还是配基受体复合物的内吞过程，我们将细胞与Dil-AcLDL在4'C孵育2小时，因为4'C时，细胞内吞受体的过程被阻断。细胞中加入不同浓度的TAT-H11时，可见细胞结合DiI-AcLDL同样呈浓度依赖性减少，当多肽浓度达到IOjiM时，细胞结合的Dil-AcLDL与未加多肽组相比减少了约55。/。左右，有显著性差异。而加TAT对照肽组细胞则未见DiI-AcLDL结合的减少(见图12)。因此，多肽TAT-H1I进入细胞后，可以抑制SR-A介导的DiI-AcLDL的结合和摄取。由于多肽Hll、H9能够干预脂质在细胞内积聚，从而干预泡沫细胞的形成奠定了基础，故这些多肽及其核苷酸序列、融合蛋白等可用于制备抗动脉粥样硬化药物。序列表〈110〉南京医科大学〈120〉一种多肽及其应用<160>11〈210〉1<211>12<212>PRT<213>人工序列<400〉1ThrAspArgLeuPheMetAsnSerlieTrpProGly1510〈210>2<211>12〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2Thr.PheTrpAspAspGlyTrpLeuLeuLeuPro'Arg1510〈210〉3〈211〉12〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉3TyrGlyAspArgTrpPheMetProValMetArgSer1510<210>4<211>26<212>DNA〈213〉人工序列<220><223〉上游引物<400>4cgcggatccatggcacagtgggatga26〈210〉5〈211>29<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223〉下游引物〈400〉5ccggaattctttataagacttcatcctct29<210>6<211〉41〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223>上游引物〈400〉6gatccacgttttgggatgatggttggcttctgttgcctcgg41〈2i0>7〈211〉40〈212〉腿〈213〉人工序列<220><223>下游引物〈400>7aattcgaggcaacagaagccaaccatcatcccaaaacgtg40〈210〉8〈211〉41〈212〉陽<213〉人工序列〈220>〈223>上游引物〈400〉8gatcctatggggataggtggtUatgcctgtgatgcggtcg41〈210〉9〈211〉41〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<223〉下游引物〈400>9aattcgaccgcatcacaggcataaaccacctatccccatag41〈210〉10〈211>41〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉上游引物■〉10gatccactgataggctgtttatgaattctatttggccgggg41〈210〉11〈211〉41<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉下游引物<400〉11aattccccggccsaatsgaattcataaacsgcctatcagtg4权利要求1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.3所示。2、含有权利要求l所述多肽的融合蛋白。3、编码权利要求l所述多肽的核苷酸序列。4、含有权利要求3所述核苷酸序列的表达载体。5、根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于这些表达载体是质粒、噬菌体、细菌、宿主细胞。6、权利要求1所述多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。全文摘要本发明属于噬菌体展示多肽库技术，涉及一种多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.3所示。该多肽能够干预脂质在细胞内积聚，从而干预泡沫细胞的形成，故该多肽及其核苷酸序列、融合蛋白等可用于制备抗动脉粥样硬化药物。文档编号C12N15/11GK101372508SQ20081015516公开日2009年2月25日申请日期2008年10月23日优先权日2008年10月23日发明者徐益鸣,王晓花,媛郑,琪陈申请人:南京医科大学