专利名称：极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、基因工程、生物技术等领域，具体涉及极 耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法。
背景技术：
世界上每年生成1500-2000亿吨植物性有机物，其中约一半为 纤维素物质，如何将纤维素物质降解转化为糖、乙醇、甲烷等容易利 用的小分子有机物是当前国际上的重大课题之一。目前，对纤维素的 降解利用主要采用酸碱化处理等化学手段，以及汽爆及蒸气加热等物 理手段。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，对环 境污染较小等特点而备受重视。由于耐热细菌可生长于高温环境，培 养过程中不易受常温微生物的污染等优点，分离和筛选多功能的高效 纤维素产生菌就显得尤为重要，特别是它产生的纤维素酶具有较好的 热稳定性，提高反应温度可加快降解速度，因此耐热纤维素酶在高温 领域具有广泛的应用前景。
高温酶的重要研究价值热稳定性酶在工业上已被广泛应用，它 与常温酶类相比有以下优点1、高温下的热稳定性，大多数酶在70
ll(TC温度范围内进行，这样可减少污染的危害。2、室温下较长的贮存期，尽可能长的存放期对商品酶制剂尤为重要，尤其是用于诊断试
剂中的酶类对贮存期要求更高。3、较高的抗化学变性作用， 一般而 言，蛋白质的热稳定性越好，其化学变性的可能性就越小。4、高温 下的高活性，虽然普通酶类在37。C以下其催化反应速度随着温度上 升而加大，但耐热性酶类随温度上升其活性增加的程度比普通酶类更 为显著，温度增加使反应体系粘度降低，进一步促进传质效率。有时 较高的温度还促使酶催化可逆反应朝着合成目标产物方向进行。5、 易于大规模生产及纯化，由于热稳定性的酶大都来到于嗜热和极端嗜 热微生物，这些微生物往往难以进行大规模培养，或需要高温发酵设 备，因此需要利用基因工程技术构建能高效表达高温酶的常温重组工 程菌，后者因在发酵过程中产生的宿主蛋白质绝大多数对热不稳定， 因此只要将工程菌的培养液进行一步热处理就可方便地纯化异源高 温酶蛋白。
定向进化技术在改造酶的热稳定性方面己表现出一定的优越性， 而将这一技术应用在葡聚糖酶热稳定性的改造上在国内外的报道还 很少。采用定向进化技术对葡聚糖酶的热稳定性进行改造的过程中， 首先需要解决的问题是如何建立高通量的筛选方法，从突变体库快速 筛选到热稳定性提高的突变体。
在过去几年，针对不同的实验目的建立了许多有应用价值的的筛 选方法，如Joo等(1999)建立的固相平板筛选方法，Mastumura等(1999) 建立的滤膜为基础的筛选方法，Nathalie Declerck等(2000)、 LoRiGIVER等(1998)和Cherry等(1999)建立的微孔板筛选方法。随着
蛋白质定向进化技术的发展，又出现了许多新的高通量筛选技术，如
Amstutz等(2001)建立的核糖体展示技术和mRNA展示技术；Kim等 (2001)建立的细胞表面展示技术；Forrer等(1999)建立的噬菌体表面展 示技术；Firestine等(2001)建立的将靶活力与转录信号相偶联的三杂 交体系；Heruberg等(2000)建立的发光信号为指示的反射增进系统； Sounllllion等(2001)建立的荧光共振能量转换仪任(FRET); Ghadessv 等(2001)建立的隔室化自复制技术等[11]。
对于热稳定性突变体的筛选，目前常用的为96孔板(Nathalie Declerek， 2000: LoRiGIVER， 1998)，平板筛选方法(Zhao Huimin et al， 1999; Toyamaetal, 1999; Hajime shibuya， 2000;肖志壮，2001) 和超薄层琼脂板扩散法。但用96孔板筛选耐高温酶时，必须将菌落 单个挑入96孔板进行培养，然后对培养液进行热处理和酶活力测定， 这样做费时费力，而且由于所用的带色底物很贵，导致检测费用较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛 选方法，该筛选方法根据葡聚糖酶在含有适量刚果红的平板上水解固 相中的羧甲基纤维素可以产生透明圈的原理设计，筛选方法简单，筛 选省时省力。
本发明的技术解决方案是该筛选方法依以下步骤进行
(1)将直径9 cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121。C灭
菌，15 min;
(2)极耐热葡聚糖酶重组菌为五.co//JM109BL21 (DE3) pET-20b
一Cell2B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振 摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高 压灭菌，冷却至55"加入氨苄青霉素100mg;其中，LB液体培养 基中氨苄青霉素终浓度为100pg/mL;
(3) 将4jal的浓度5jxg/mL的IPTG均匀地涂在直径9 cm培养皿 的LB固体培养基上，37"C正放2—3小时；其中，LB固体培养基配 制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g，调pH 至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55。C加入氨苄青 霉素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终 浓度为100pg/mL;
(4) 将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步己涂有IPTG的LB 固体平板上，37。C培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；
(5) 第四步培养好的平板4-C放置l-2小时；
(6) 菌落的原位膜转印取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上 影印菌落；37'C继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；
(7) 将第六步菌落转印的尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的 含有氨苄青霉素100pg/mL的LB固体平板上，37。C倒置培养4一5小 时；
(8) 用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张 滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙 膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸
上30min;其中，1升细胞壁裂解液含25 mmol Tris-HCl (pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升细胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡缓 冲液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，70。C放置3小 时；其中，筛选平板制备将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和 0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液1 L混匀，高压灭菌，冷却后倒 平板；
(10) 揭去第九步筛选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1%的 刚果红，显色15min，弃去刚果红，倒上lmol/LNaCl脱色15min， 确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候 选。
本发明的筛选方法简单，省时省事，筛选效率高，筛选效果好。
图l.本发明方法在固相平板得到清晰的透明圈。 图2.当平板上菌落密度不当时造成透明圈不清晰的情况 具体实施例方式
下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这 些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范 围。
实例1:依以下步骤进行极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方
法
(1) 将直径9 cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121'C灭 菌，15 min;
(2) 极耐热葡聚糖酶重组菌为丑co//JM109BL21 (DE3) pET-20b —Cell2B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振 摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高 压灭菌，冷却至55"加入氨苄青霉素100mg;其中，LB液体培养 基中氨苄青霉素终浓度为100pg/mL;
(3) 将4pl的浓度5pg/mL的IPTG均匀地涂在直径9cm培养皿 的LB固体培养基上，37°。正放2小时；其中，LB固体培养基配制 胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g,调pH至 7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55"C加入氨苄青霉 素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终浓 度为100^ig/rnL;
(4) 将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固体平板上，37'C培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；
(5) 第四步培养好的平板4t:放置l小时；
(6) 菌落的原位膜转印取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上 影印菌落；37"C继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；
(7) 将第六步菌落转印尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的含 有氨苄青霉素100pg/mL的LB固体平板上，37-C倒置培养4小时；
(8) 用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张
滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙 膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸
上30min;其中，1升细胞壁裂解液含25mmolTris-HCl(pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升细胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡缓 冲液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，7(TC放置3小 时；其中，筛选平板制备将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和 0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液lL混匀，高压灭菌，冷却后倒 平板；
(10) 揭去第九步选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1%的刚 果红，显色15min，弃去刚果红，倒上1 mol/L NaCl脱色15 min， 确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候 选。
实例2:实例1:依以下步骤进行极耐热葡聚糖酶重组菌固相平 板筛选方法
(1) 将直径9 cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121'C灭 菌,15 min;
(2) 极耐热葡聚糖酶重组菌为￡.co//JM10犯L21 (DE3) pET-20b 一Cell2B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振 摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高
压灭菌，冷却至55i:加入氨苄青霉素100mg;其中，LB液体培养 基中氨苄青霉素终浓度为lOO^ig/mL;
(3) 将4pl的浓度5pg/mL的IPTG均匀地涂在直径9cm培养皿 的LB固体培养基上，37t:正放2.5小时；其中，LB固体培养基配制 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g，调pH至 7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55'C加入氨苄青霉 素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终浓 度为100|xg/mL;
(4) 将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固体平板上，37'C培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；
(5) 第四步培养好的平板4'C放置L5小时；
(6) 菌落的原位膜转印取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上 影印菌落；37'C继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；
(7) 将第六步菌落转印尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的含 有氨苄青霉素lOOpg/mL的LB固体平板上，37-C倒置培养4.5小时；
(8) 用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张 滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙 膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸 上30min;其中，1升细胞壁裂解液含25 mmol Tris-HCl (pH8.0)、 1 g 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升细胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡缓 冲液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，7(TC放置3小 时；其中，筛选平板制备将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和 0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液lL混匀，高压灭菌，冷却后倒 平板；
(10) 揭去第九步选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1%的刚 果红，显色15min，弃去刚果红，倒上1 mol/L NaCl脱色15 min， 确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候 选。
实例3:实例1:依以下步骤进行极耐热葡聚糖酶重组菌固相平 板筛选方法
(1) 将直径9 cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规12rC灭 菌,15 min;
(2) 极耐热葡聚糖酶重组菌为五.co//JM109BL21 (DE3) pET-20b 一Cell2B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振 摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高 压灭菌，冷却至55'C加入氨苄青霉素100mg;其中，LB液体培养 基中氨苄青霉素终浓度为100pg/mL;
(3) 将4ji的浓度5pg/mL的IPTG均匀地涂在直径9cm培养皿 的LB固体培养基上，37'C正放3小时；其中，LB固体培养基配制: 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g，调pH至 7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55。C加入氨苄青霉
素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终浓 度为lOOpg/mL;
(4) 将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固体平板上，37'C培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；
(5) 第四步培养好的平板4'C放置2小时；
(6) 菌落的原位膜转印取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上 影印菌落；37-C继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；
(7) 将第六步菌落转印尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的含 有氨苄青霉素100pg/mL的LB固体平板上，37'C倒置培养5小时；
(8) 用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张 滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙 膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸 上30min;其中，1升细胞壁裂解液含25mmolTris-HCl(pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升细胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡缓 冲液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，7(TC放置3小 时；其中，筛选平板制备将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和 0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液1 L混匀，高压灭菌，冷却后倒 平板；
(10) 揭去第九步选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1%的刚 果红，显色15min，弃去刚果红，倒上1 mol/L NaCl脱色15 min，确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候 选。
本发明方法中的IPTG用量对透明圈的影响如表1
表l IPTG加入量对菌落生长和透明圈形成的影响
处理1 处理2 标准
结果统计 lul 2ul3ul4ul5ul lul 2ul3ul 4ul5ul 0wl
菌落数(个) 66 59 44 39 376055 45 36 30 70
不明 不明
透明圈亮度明显明显明显 明显 明显 显显 明显 明显 明显 无
透明圈大小 小 中等中等 大 大 很小 很小 小 小小 无 注很小，0 mm <直径《3 ram;小，3mm <直径《4mm;中等，4 mm <直径《6mra;大，直径> 6 mm，处理1是指先涂IPTG后涂菌液，处理2是指直接加IPTG到菌液中
结果显示菌体的生长在IPTG用量大时受到抑制，将IPTG直接 加入到菌液中不利于菌体的生长，另外，IPTG用量与透明圈的大小 正相关，先涂IPTG后涂菌液所产透明圈比直接加IPTG到菌液中所产 的透明圈大且更明显，这可能是因为先涂的IPTG可以均匀地分布在 培养基中，不会因局部浓度太高而抑制细胞生长，有利于持续诱导菌 体表达。
本发明方法中的重组菌培养时间对筛选的影响如表2
表2细菌培养时间对筛选的影响
结果统计9h12h15h18h21h24h
菌落大小小中等中等大大大
转印成功率(％)68951001009578
筛选平板上透明圈(《5100100907560
注小，(km <直径《lmm;中等，lmm 〈直径《2咖；大，直径>2mm
由表2可以看出重组菌培养9小时，长出的菌落非常小，膜的
转印成功率较低且几乎在筛选平板上看不到透明圈，继续培养到12 —15小时，平板上菌落中等大小适于转化，转化成功率和筛选平板 上透明圈的比率都比较高，在15小时可以达到100% ，菌株继续培 养至18—24小时，菌落裂解后产生的透明圈比率反而下降，这可能 是菌落较大而不易裂解或酶被降解的缘故；因此，选定15小时为较 合适的培养时间。
本发明的方法中的筛选平板温度和反应时间对筛选的影响如表3 当筛选平板中的琼脂含量为15g/L时，平板在7CTC和75"C的温 度条件下熔化了，于是改变了琼脂的含量，70。C时琼脂含量为20g/L ， 75'C时琼脂含量为25g/L，琼脂不再熔化。
表3筛选温度和时间对透明圈的影响
55 °C60 °C65 °C70 °C75 °C
lh很小很小小小小
2h小中中中中
3h中大大很大大
4h中中中大中
注很小，直径《4.5mm;小，4.5mm〈直径《6mm;中等，6mm〈直径《7mm;
大，7mm〈直径《8mm;很大，8mm〈直径《9mm 结果显示在温度不变的情况下，在1一3小时内，透明圈的大 小随着时间的延长而增加，但到4小时后透明圈不再增大，反而在减 小；在时间不变的情况下，在55°C—7(TC之间，随着温度的升高， 透明圈也在变大，但当达到75'C时透明圈与7(TC时相比不再增大， 反而在变小；因此，筛选平板中琼脂的含量为20g/L，筛选培养温度 为7(TC时，为最佳的筛选条件。
权利要求
1.极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法，其特征在于筛选方法依以下步骤进行(1)将直径9cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121℃灭菌，15min；(2)极耐热葡聚糖酶重组菌为E.coli JM109BL21(DE3)pET-20b—Cel12B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55℃加入氨苄青霉素100mg；其中，LB液体培养基中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL；(3)将4μl的浓度5μg/mL的IPTG均匀地涂在直径9cm培养皿的LB固体培养基上，37℃正放2—3小时；其中，LB固体培养基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g，调pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55℃加入氨苄青霉素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL；(4)将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步已涂有IPTG的LB固体平板上，37℃培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；(5)第四步培养好的平板4℃放置1—2小时；(6)菌落的原位膜转印取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上影印菌落；37℃继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；(7)将第六步菌落转印的尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的含有氨苄青霉素100μg/mL的LB固体平板上，37℃倒置培养4—5小时；(8)用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸上30min；其中，1升细胞壁裂解液含25mmol Tris-HCl(pH8.0)、1g溶菌酶和1mmol EDTA(pH8.0)；其中，1升细胞膜裂解液含10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1g(wt/vol)Triton-x-100；其中，1升平衡缓冲液含50mmol Tris-HCl(pH8.0)；(9)将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，70℃放置3小时；其中，筛选平板制备将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液1L混匀，高压灭菌，冷却后倒平板；(10)揭去第九步筛选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1％的刚果红，显色15min，弃去刚果红，倒上1mol/L NaCl脱色15min，确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候选。
全文摘要
本发明公开了极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法，依以下步骤进行尼龙膜121℃灭菌15min；E.coli JM109BL21(DE3)pET-20b-Cel12B在5mL的LB液体培养基中培养6小时；4μl浓度5μg/mLIPTG涂在LB固体培养基上，37℃正放2-3小时；菌液涂LB固体平板上，37℃培养15小时；平板4℃放置1-2小时；尼龙膜置于平板上影印菌落；尼龙膜影响菌落面向上置于LB固体平板上，37℃倒置培养4-5小时；尼龙膜置于经细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液浸泡上30min；尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，70℃放置3小时；在揭去尼龙膜筛选平板上0.1％的刚果红显色15min，1mol/L NaCl脱色15min，挑取透明圈菌株。本发明方法简单，省时省事，筛选效率高，筛选效果好。
文档编号C12N1/00GK101372667SQ20081015546
公开日2009年2月25日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者李相前 申请人:淮阴工学院