专利名称：：百喜草成熟种子离体培养植株再生方法
技术领域：
：本发明百喜草成熟种子离体培养植株再生方法，涉及一种适用于微繁殖、体细胞突变体筛选和基因转化的受体材料的培养技术，属于植物组织培养方法。
背景技术：
：百喜草(？^p"/wm"ota/w附尸/昭geJ为禾本科雀稗属植物,原产拉丁美洲，其分布范围为北纬30。南讳30。间、海拔高度〈2000m的广大热带、亚热带地区，现已在北美洲、拉丁美洲、澳洲、非洲、日本及我国广泛引种栽培。百喜草在我国台湾省应用范围已由果(桑、茶)园覆盖、梯壁植草、山边沟植草、坡地草带等形式发展到公路护坡、荒山荒坡治理和大地绿化等，有效减轻了全岛水土流失和自然灾害的发生与危害(刘士余，聂明英，彭鸿燕.百喜草及其应用研究[J].安徽农业科学，2007，35(25):7808-7810)。80年代末江西省从台湾引种百喜草，目前百喜草已被农业部列为农业新草种进行推广，在四川、重庆、云南、贵州、广东、江西、福建等省引种栽培，具有广阔的发展前景(夏汉平，蔡锡安，刘世忠.百喜草研究与应用进展[J].中国草地，2003，25(1):44-53)。植物体细胞突变体筛选和转基因技术的日趋成熟为改良草坪草开辟细胞和分子生物学育种新途径。至今，离体培养植株再生在百喜草上尚未见报道，其主要原因是难以获得颗粒状胚性愈伤组织。在植物组织培养中，半透明、湿润、粘状胚性愈伤组织在继代培养过程中逐渐丧失绿苗分化的能力，尤其是在理化诱变因子的选择压下或农杆菌侵染时，彻底丧失其植株再生的能力，从而影响微繁殖、体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化工作的进程。
发明内容技术问题本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是提供一种百喜草成熟种子离体培养植株再生技术。以百喜草的成熟种子作为外植体材料，调控外源植物激素，获得较高比例的颗粒状胚性愈伤组织，建立高频率植株再生的技术体系。技术方案百喜草成熟种子离体培养植株再生方法，包括-1)材料选用百喜草的成熟种子为外植体材料；2)培养基基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与Bs维生素组成；愈伤组织诱导培养基和愈伤组织继代培养基附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.04.0mg/L和6-节基氨基嘌呤0.05mg/L;愈伤组织分化培养基附加激素氯吡苯脲2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L;在愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基和愈伤组织分化培养基中，添加蔗糖30g/L;以8g/L的琼脂条作为固化剂；上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8;3)培养方法百喜草的成熟种子先在30叱水中浸泡48h，取出吸干种子表面水分，在超净工作台上用70%的酒精浸泡30s，然后再用0.1%的氯化汞处理20min，经过表面消毒的种子接种在愈伤组织诱导培养基上。在散射光下培养，15d左右从种子诱导产生出愈伤组织。选择白色、湿润、颗粒状的愈伤组织，在愈伤组织继代培养基上进行继代培养。经过连续4次继代培养后的颗粒状愈伤组织转移到愈伤组织分化培养基上，在光照条件下培养，15d左右分化出绿苗。—培养室温度为25±2QC，光照强度为15001x，光照时间为16h/d。有益效果本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果-在离体培养条件下，选用成熟种子为外植体材料，通过调控愈伤组织诱导培养基中外源激素的配比，提高了百喜草颗粒状胚性愈伤组织的诱导频率。选择颗粒状愈伤组织进行继代培养，在愈伤组织继代培养过程中颗粒状愈伤组织的胚性保持不变，有利于保持较高频率的植株再生能力。本发明建立的百喜草成熟种子离体培养植株再生技术体系，适宜用作体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化的受体材料，为开展百喜草细胞和分子生物学育种研究工作提供条件。在愈伤组织诱导培养基和继代培养基中，附加激素2,4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L和6-苄基氨基嘌呤0.05mg/L，白色、湿润、颗粒状愈伤组织的诱导达50%。经过连续4代继代培养的愈伤组织绿苗分化率达30%以上。使用本发明方法获得的白色或浅黄色、千燥、颗粒状愈伤组织用于耐寒体细胞突变体筛选工作，已获得批量细胞工程植株。图1百喜草成熟种子诱导愈伤组织。图2颗粒状愈伤组织。图3愈伤组织分化绿苗。图4再生小植株。具体实施例方式1.材料和方法1.1试验材料以百喜草"太阳花"品种为试验材料，选用其成熟种子为外植体，该供试材料由北京林业大学科技有限公司提供。1.2培养基基本培养基由MS大量元素,、MS微量元素(MurashigeT,SkoogRArevisedmediumfromrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures[J].Physiolplant,1962,15:473497)和B5维生素(GamborgOL,MillerRA,OjimaK.Nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells[J].Exp.CellRes"1968.50:151158)组成，为植物组织培养中一种常用的培养基；愈伤组织诱导培养基和愈伤组织继代培养基附加激素2,4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D，上海化学试剂四厂)2.0、3.0、4.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)0.05mg/L;愈伤组织分化培养基附加激素氯吡苯脲(简称CPPU，上海稼丰园艺用品有限公司)2.0mg/L和萘乙酸(简称NAA，南京生兴生物技术有限公司)0.05mg/L;在愈伤组织诱导培养基和继代培养基、愈伤组织分化培养基中，添加蔗糖30g/L;琼脂条(乘风牌，福建泉州市泉港化工厂)的用量为8g/L;培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8;1.3培养方法'取百喜草成熟种子，在超净工作台上先用70。/。的酒精浸泡30s，再用0.1%氯化汞处理20min，然后接种在愈伤组织诱导培养基上。在散射光下培养，20d左右从种子诱导产生出白色、湿润、颗粒状的愈伤组织，25d后统计白色、湿润、颗粒状愈伤组织的诱导频率。选择白色、较干燥、颗粒状的愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基上进行继代培养，25d为l周期，经过连续4次继代培养后的颗粒状愈伤组织再转移到愈伤组织分化培养基上，在光照条件下培养，15d左右开始分化出绿苗，25d后统计绿苗分化频率。培养室温度为25±2QC，光照强度为15001x，光照时间为16h/d。2.结果2.12,4-D和BAP对愈伤组织诱导率的影响试验结果显示以成熟种子为外植体材料，随着2,4-D浓度的升高，愈伤组织的诱导频率明显下降；2,4-D的适宜浓度为2.0mg/L;添加低浓度的BAP对愈伤组织的诱导频率无明显作用。在附加激素2，4-D2.0mg/L、BAP0.05mg/L的愈伤组织诱导培养基上，成熟种子诱导愈伤组织发生的频率达50%(表1)。表12，4-D和BAP对愈伤组织诱导率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2颗粒状愈伤组织植株再生从愈伤组织诱导培养基上挑选颗粒状愈伤组织进行继代增殖培养，经过连续继代培养4代后转移到愈伤组织分化培养基上，绿苗分化率达30%以上(表2)。表2颗粒状愈伤组织绿苗分化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.结论本研究以百喜草成熟种子为外植体材料，愈伤组织诱导培养基附加激素2,4-D2.0mg/L和BAP0.05mg/L，白色、湿润、颗粒状愈伤组织的诱导频率达50%。经过连续4代继代培养后，愈伤组织的绿苗分化率达30%以上，建立起百喜草成熟种子离体培养较高频率植株再生技术体系。颗粒状胚性愈伤组织适用于体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化，为开展百喜草细胞和分子生物学育种研究工作提供条件。以上以一个具体的例子对本发明的技术方案作出了详细说明，但并非只限于上述具体实施细节；以本发明技术方案的数据范围内的其它数据实施本发明的技术方案，达到了同样的技术效果，在此不再赘述。权利要求1.百喜草成熟种子离体培养植株再生方法，其特征在于1)材料选用百喜草的成熟种子为外植体材料；2)培养基基本培养基由MS大量元素、MS微量元素和B5维生素组成；愈伤组织诱导培养基和愈伤组织继代培养基附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.0～4.0mg/L和6-苄基氨基嘌呤0.05mg/L；愈伤组织分化培养基附加激素氯吡苯脲2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L；在愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基和愈伤组织分化培养基中，添加蔗糖30g/L，并以8g/L的琼脂条作为固化剂；上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；3)培养方法百喜草的成熟种子先在300C水中浸泡48h，取出吸干种子表面水分，在超净工作台上用体积比70％的酒精浸泡30s，然后再用质量比0.1％的氯化汞处理20min，经过表面消毒的种子接种在愈伤组织诱导培养基上，在散射光下培养，15d从种子诱导产生出愈伤组织，选择白色、湿润、颗粒状的愈伤组织，在愈伤组织继代培养基上进行继代培养，经过连续4次继代培养后的颗粒状愈伤组织转移到愈伤组织分化培养基上，在光照条件下培养，15d分化出绿苗；培养室温度为25±20C，光照强度为15001x，光照时间为16h/d。全文摘要本发明涉及百喜草成熟种子离体培养植株再生方法，属于植物组织培养方法。以百喜草的成熟种子为外植体材料，在附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.05mg/L的愈伤组织诱导培养基上，白色、湿润、颗粒状愈伤组织的诱导率达50％。在附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.05mg/L的愈伤组织继代培养基上，白色或浅黄色、较干燥、颗粒状愈伤组织保持胚性状态。经过连续4代继代培养的颗粒状愈伤组织转到附加激素氯吡苯脲2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L的愈伤组织分化培养基上，绿苗分化率达30％以上。本项技术适用于百喜草的微繁殖、体细胞突变体筛选和基因转化。文档编号C12N5/04GK101366358SQ200810156158公开日2009年2月18日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者佘建明,叶晓青,汤日圣,王松凤,郑安俭申请人:江苏省农业科学院