专利名称：生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种产γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、培养该酵母菌株的方法以及利用该酵母菌株细胞制备的食品。一种含有γ-谷氨酰半胱氨酸的材料和一种由γ-谷氨酰半胱氨酸制备得到的含半胱氨酸的材料可应用于食品领域。
背景技术：
半胱氨酸可用于增强食品的风味等等。已知的半胱氨酸生产方法包括，例如，蛋白水解法和半合成法，这些方法目前基本上还在使用。尽管含有半胱氨酸含量的天然食物材料已经被要求用来增加食品的风味，但是已知的这种天然材料非常少。另一方面，有报道称对含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物进行热处理或酶处理可以产生具有高半胱氨酸含量的食物材料(WO 00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸是以半胱氨酸和谷氨酸为底物由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶作用合成的。另一方面，谷胱甘肽是以γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸为底物由谷胱甘肽合成酶作用合成的。已经报道一种谷胱甘肽合成酶基因被破坏的酵母能够累积γ-谷氨酰半胱氨酸(Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。
具有高含量γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母已经在WO 00/30474，Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990，Chris et al.，Molecular Biology ofthe Cell.，8，1699-1707，1997，Inoue et al.，Biochimca et Biophysica Acta，1395，315-320，1998等文献中报道。然而，这些文献没有公开这些谷胱甘肽合成酶基因被破坏或衰减(weakened)以累积大量γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的培养条件。
培养酵母以在其细胞中累积大量谷胱甘肽——γ-谷氨酰半胱氨酸的一种代谢产物——的方法已经被公开(JP 48-92579A等)。该文献描述了当在培养酵母过程中添加半胱氨酸(谷胱甘肽的一种组成氨基酸)时，谷胱甘肽的累积量得到提高。因此，认为在培养谷胱甘肽合成酶基因被破坏或衰减的酵母过程中，添加半胱氨酸可以累积大量的γ-谷氨酰半胱氨酸。然而，由于含有γ-谷氨酰半胱氨酸的物质可用于制备含有半胱氨酸的物质，因此，从经济角度考虑，为获得含有半胱氨酸的物质而在培养含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母时添加半胱氨酸并不切实可行。
另外，Otake等还报道了在培养一种谷胱甘肽合成酶基因已被破坏的酵母——YL1菌株过程中，添加3mM半胱氨酸时，酵母细胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量(Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。该文献表明在半胱氨酸存在下培养YL1菌株时，累积的γ-谷氨酰半胱氨酸量是0.533％，而在不存在半胱氨酸时培养该菌株，γ-谷氨酰半胱氨酸的量是0.518％。这一结果暗示，在培养谷胱甘肽合成酶基因被破坏或衰减的酵母过程中添加半胱氨酸并不实用。
还有报道表明，当MET25基因的表达被增强时，酵母细胞中的谷胱甘肽含量有所提高。进一步地，作为提高MET25基因表达的方法，已经报道了一种利用MET4突变基因的方法(Omura et al.，FEBS Letters 387(1996)179-183和JP10-33161A)和一种利用MET30突变基因的方法(DOMINIQUE ET et al.，MOLECULARAND CELLUAR BIOLOGY，Dec 1995，第6526-6534页)。
MET25基因的表达机制如下。即，MET4基因产物对MET25基因表达起正调控作用。通常，MET4基因产物与MET30基因产物以及其它几种蛋白质形成了SCFMET30复合体，通过26S蛋白酶体蛋白水解系统，MET4基因产物与MET30基因产物一起被遍在蛋白化作用(ubiquitinated)并分解，因此，MET25基因的表达被抑制。另一方面，当SCFMET30复合体的功能被降低的时候，MET4基因产物和MET30基因产物不被分解，MET25基因得以表达(Patton et al，GenesDev.12692-705，1998and Rouillon et al.，EMBO Journal 19282-294，2000)。
这些报道表明γ-谷氨酰半胱氨酸的含量也可以在那些通过增强MET25基因的表达而具有高γ-谷氨酰半胱氨酸含量的酵母中得到提高。
另外，有报道表明，当“日本米酒(sake)”酵母在缺乏泛酸钙(calciumpanthotenate)条件下培养时，酵母在其对数生长期累积硫化氢。该报道焦点集中在从半胱氨酸到硫化氢的形成，它还描述了这一现象在缺乏泛酸条件下得到进一步促进。
发明内容
基于以上提到的技术背景，本发明的一个目的是提供一种适于生产γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、一种利用这样的酵母菌株生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法以及使用这样的酵母菌株获得的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或饮料。
本发明的发明人已经考虑到在培养酵母过程中酵母细胞中累积的γ-谷氨酰半胱氨酸的量并不需要保持不变，而可以在即将收获酵母细胞之前累积到所需量的γ-谷氨酰半胱氨酸。基于这一考虑，本发明发明人进行了广泛的研究，结果发现，通过在酵母所需最小量的泛酸存在下培养增殖酵母后，在泛酸限制条件下培养酵母，累积的γ-谷氨酰半胱氨酸的量即得到提高，其中所述酵母能够生产γ-谷氨酰半胱氨酸，并且为泛酸缺陷型。因此，发明人完成了本发明。
即，本发明如下 (1)一种具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的泛酸缺陷型酵母，其中当酵母被培养于含有有限量泛酸的培养基中时，单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量随时间而增加。
(2)根据(1)中的酵母，该酵母经过修饰使得细胞内谷胱甘肽合成酶活性降低或消除。
(3)根据(1)或(2)的酵母，该酵母经过修饰使得MET25基因的表达被去抑制(derepressed)。
(4)根据(3)的酵母，其中MET25基因表达通过锚定(harboring)突变MET30基因而去抑制，所述突变基因具有的一个突变导致由丝氨酸之外的氨基酸取代了MET30基因编码蛋白质第569位的丝氨酸。
(5)根据(4)的酵母，其中丝氨酸之外的氨基酸是苯丙氨酸。
(6)根据(1)至(5)的酵母，其为糖酵母属(Saccharomyces)。
(7)一种制备可在体内累积γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的方法，包括在含有足量泛酸的培养基中培养(1)至(6)中任一酵母以使其增殖的步骤，以及在含有有限量泛酸的培养基中培养酵母细胞，以提高酵母细胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量的步骤。
(8)一种食品或饮料，其含有通过在合适条件下培养(1)至(6)中任一酵母所获得的培养物，含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物的分级产物，或者是通过热处理产生了半胱氨酸的培养物或分级产物。
(9)根据(8)的食品或饮料，其选自酒精饮料、面包食品或发酵的食品调味物质。
(10)一种酵母抽提物，由合适条件下培养(1)至(6)中任一酵母所获得的培养物制备。
(11)一种制备含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或饮料的方法，包括在合适条件下培养(1)至(6)中任一酵母，将获得的培养物或其分级产物、或者热处理后的培养物或分级产物与食品或饮料原材料混合，并将混合物加工成食品或饮料。
(12)一种酵母，其中MET25基因的表达被去抑制，去抑制的原因是酵母中锚定突变的MET30基因，该突变基因带有的一个突变导致苯丙氨酸取代了MET30基因编码蛋白质第569位的丝氨酸。
图1是显示在含有或不含泛酸钙的培养基中培养酵母GMP菌株，细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量的时间过程图。
图2是显示在GM株和GMP株之间γ-谷氨酰半胱氨酸含量的比较图。
图3是显示在含有或不含泛酸钙的培养基中培养酵母AJ14861菌株，细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量的时间过程图。
具体实施例方式 下文中将对本发明进行详细描述。
<1>本发明的酵母 本发明的酵母具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力并且是泛酸缺陷型。此外，本发明的酵母当被培养于含有有限量泛酸的培养基中时，单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量随时间而增加。
本发明中，“一种γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力”的意思是“一种比野生型菌株在细胞中累积更大量γ-谷氨酰半胱氨酸的能力”。优选地，其意味着在含有足量泛酸的培养基上培养酵母之后，在含有有限量泛酸的培养基中培养时，单位干酵母细胞内能够累积1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸。更优选地，其意味着除以上所述累积的γ-谷氨酰半胱氨酸的量之外，单位干酵母细胞中累积的谷胱甘肽的量是0.1％或更少。
单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的累积量为例如，105℃热处理4小时后，酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的含量(重量％)。
具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的酵母的例子包括细胞内谷胱甘肽合成酶活性被减少或去除的，被修饰而使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增强的酵母，或者细胞内谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的并且被修饰而使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增强的酵母。
细胞内谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以使用DNA通过基因取代方法而获得，所述DNA含有一个通过去除部分基因序列而被修饰从而不产生具有正常功能酶的谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)，或者一个带有能够降低酶活性的突变的谷胱甘肽合成酶基因(下文中简称为“突变GSH2基因”)。此外，细胞内谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以通过对野生型酵母菌株进行一般的突变处理——例如紫外线照射或诱变剂——而获得，所述诱变剂例如N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸或吖啶。可以通过PCR等方法来证实获得的突变体确实含有目的突变。
降低谷胱甘肽合成酶活性的突变可以是，例如，用终止密码子取代SEQ IDNO2所示氨基酸序列第370位的精氨酸。
其它降低谷胱甘肽合成酶活性的突变的例子包括如下(WO 03/046155) (1)用异亮氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第47位的苏氨酸。
(2)用天冬氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第387位的甘氨酸。
(3)用亮氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第54位的脯氨酸。
上述(1)或(2)的突变可以单独或者组合使用，但是(1)和(3)突变组合以及(2)和(3)突变组合是优选的。
上述对谷胱甘肽合成酶基因突变的介绍可以通过合成的寡核苷酸进行定点突变来完成。
上面提到的基因取代可以按照如下实施。即，用含有突变GSH2基因的重组DNA转化酵母，以使得突变GSH2基因与染色体GSH2基因之间进行重组。此时，重组DNA中插入的标记基因使操作变得简单易行，该标记依赖于诸如宿主的营养缺陷型等特定性状。此外，例如通过限制性内切酶酶切使上述重组DNA线性化，以及从重组DNA上去除在酵母中起作用的复制调控序列都可以有效地制备出重组DNA整合到染色体上的菌株。
为进行酵母转化，那些传统使用的酵母转化方法，例如原生质体法、KU法、KUR法、电击转化法或类似方法可以被应用。用上述方法已经将重组DNA整合进入染色体的菌株经历了突变GSH2基因和本身存在于染色体上的GSH2基因之间的重组，因此这两个融合基因，即野生型的GSH2基因和突变GSH2基因，被插入染色体使得重组DNA的其余部分(载体部分和标记基因)存在于两个融合基因之间。
接下来，为使得只有突变GSH2基因留在基因组DNA上，GSH2基因的一个拷贝和载体部分(也包括标记基因)通过两个GSH2基因间的重组从染色体DNA上被去除。此时，有两种情况。一种情况是，野生型GSH2基因被留在染色体DNA上而突变GSH2基因被切除。相反另一种情况是，突变GSH2基因被留在染色体DNA上而野生型GSH2基因被切除。这两种情况中标记基因都被去除了，因此第二次重组的发生可以通过与标记基因相应的表型来证实。目标基因取代菌株可以通过用PCR方法扩增GSH2基因和检查其结构进行选择。
在基因取代中使用的突变GSH2基因可以编码全长谷胱甘肽合成酶，但也可以是编码部分酶的基因片段，只要这部分酶含有突变位点。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)的核酸序列已经被报道(Inoue et al.，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)，315-320，GenBank Accession NO.Y13804，SEQ ID NO1)，而且该基因可以用PCR法，根据核苷酸序列制备的寡核苷酸为引物，从酿酒酵母染色体DNA获得。基因取代中使用的基因也可以来自一个不属于糖酵母属的微生物。
本发明所用的突变GSH2基因可以是一个编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的谷胱甘肽合成酶基因，它在上述第47、387和54位点之外的一个或几个位点具有一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或增加。尽管数字“几个”可以根据蛋白质的三维结构和氨基酸类型的不同而变化，但它通常是指2至10个，优选为2至6个，更优选为2至3个。或者，突变GSH2基因可以是编码与SEQ ID NO2所示整个氨基酸序列具有至少30～40％，优选不少于55～65％同源性的蛋白质的DNA。
导致谷胱甘肽合成酶基因中取代、缺失、插入、增加、倒位的突变也包括基于带有谷胱甘肽合成酶基因的细菌个体差异或种间、属间差异而自然发生的突变或变化。
在破坏酵母菌株谷胱甘肽合成酶基因时，不仅可以使用全长谷胱甘肽合成酶基因，而且还可以使用具有足够长的可以导致基因破坏的基因片段。基因破坏中使用的谷胱甘肽合成酶基因并没有特别的限定，只要它具有足够的同源性可以与酵母菌株染色体谷胱甘肽合成酶基因发生同源重组。基因可以从待用酵母菌之外的微生物制备获得。
能够与酿酒酵母GSH2基因发生同源重组的DNA的例子包括，与具有SEQID NO1所示核苷酸序列的DNA具有70％或更高，优选为80％或更高，更优选为90％或更高的同源性的DNA。这样的DNA包括在严谨条件下可以与具有SEQID NO1所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA。举例说明严谨条件，可以是60℃下盐浓度为1×SSC和0.1％SDS，优选0.1×SSC和0.1％SDS的洗涤条件。
谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以通过对野生型酵母进行一般的突变处理而获得，例如紫外线照射或诱变剂，如N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸或吖啶。
举例说明提高酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的方法，可以是利用带有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的质粒转化酵母来增加酵母细胞中该基因拷贝数量的方法，或者用强启动子取代其天然启动子来增强染色体γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的转录的方法(Yasuyuki Otake et al.，Bioscience andIndustry，第50卷，第10期，第989～994页，1992年)。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的示范性例子为来自酿酒酵母(GenBank Accession NO.D90220)的基因。
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的细胞内活性可以用Jackson的方法(Jackson，R.C.，Biochem.J.，111，309(1969))和Gushima等的方法(Gsushima，T et al.，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))进行检测。
本发明的酵母具有γ-谷氨酰半胱氨酸的生产能力并且为泛酸缺陷型。本发明中，“泛酸缺陷型”是指酵母生长所需的泛酸浓度高于未经修饰的酵母菌株例如野生型菌株生长所需的泛酸浓度。
泛酸缺陷型突变体可以按下述获得将酵母进行突变处理，在含有泛酸的培养基和不含泛酸的培养基上复制处理过的酵母，选择出在不含泛酸的培养基中不能形成菌落而在含泛酸的培养基中能够形成菌落的菌株。该菌株即为泛酸缺陷型，可以在不含泛酸但含抗生素(例如特别影响细胞增殖的制霉菌素)的培养基中培养经过突变处理的酵母，以此来浓缩该菌株。
不含泛酸的培养基示范性例子为具有下述成分的培养基。
表1
含有泛酸的培养基可以通过例如向上述培养基中添加0.1至10mg/L，优选0.4mg/L泛酸盐而制得。添加的泛酸盐可以是泛酸钙。如果是固体培养基，培养基中可以含有适量的琼脂。
具有上述特征的本发明酵母可以在含有足量泛酸的培养基中增殖，然后，在含有有限量泛酸的培养基中培养酵母，这样，单位干细胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸的含量会随时程而增加。“足量的泛酸”是指在该量下，对数生长期的酵母可以增殖。该量一般是0.1mg/L或更高，优选为0.4mg/L或更高。虽然该量的上限没有特殊限定，但是一般来说10mg/L或更多的量是过量的。因此，泛酸的量一般为0.1到10mg/L。
“有限量的泛酸”是指这样的量在该量下，在含有足量泛酸的培养基中培养过的处于对数生长期的酵母不能生长或以降低的速率生长。有限量一般是0.1mg/L或更少，优选0.01mg/L或更少。有限量的泛酸可以是0mg/L。
“单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量随时程增加”是指，当本发明的酵母在含有足量泛酸的培养基中培养后再转入含有有限量泛酸的培养基中培养时，γ-谷氨酰半胱氨酸的最高含量比在培养基改变后单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量，优选至少增加1.5倍，更优选至少增加1.8倍，特别优选增加至少2倍。
本发明的酵母可被修饰以使得MET25基因的表达被去抑制。“MET25基因的表达被去抑制”是指，MET25基因的表达没有在DOMINIQUE等的报告中所述的条件下被甲硫氨酸抑制(MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，Dec，1995，p6526-6534)。
举例说明去抑制MET25基因表达的方法，可以是这样的方法用编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白的突变MET30基因来转化酵母，所述氨基酸序列第569位的丝氨酸被除丝氨酸以外的氨基酸取代。“除丝氨酸以外的氨基酸”可以是苯丙氨酸。具有上述特性的酵母可以按下文实施例所述的酵母突变处理来获得。由于目的突变已经在上面详细说明，因此，具有这种突变的酵母可以通过基因工程技术很容易地获得。例如，MET25基因表达被去抑制的酵母，可以用上述的突变MET30基因通过基因置换来获得。基因置换可以通过与上述GSH2基因同样的方式完成。锚定突变MET30基因的酵母还可以通过用包含突变MET30基因的质粒转化酵母以增加突变基因的拷贝数而获得。此外，含有突变MET30基因的酵母还可以通过对野生型酵母进行如实施例所述的常规突变处理而获得，如UV照射或诱变剂，如N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝酸，或吖啶。可以通过PCR证实，所获得的突变株含有目的突变。可以利用含有编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列蛋白的突变MET30基因的菌株，来生产谷胱甘肽，所述氢基酸序列中第569位丝氨酸被苯丙氨酸取代。
MET30基因是一种能与MET4基因产物和其它几种蛋白形成SCFMET30复合体的基因，并且其编码的蛋白质涉及MET25基因表达的调控。示范性地例举MET30基因，可以是来自啤酒酵母的、具有SEQ ID NO3核苷酸序列的MET30基因，或其同源物。同源物可以是在严格条件下能与具有SEQ ID NO3核苷酸序列的DNA杂交的DNA。这里所用的“严格条件”是指，在该条件下，能够发生所谓的特异性杂交，而不发生非特异性杂交。但很难根据数字定义该条件，该条件的一个例子是这样的条件允许有较高同源性的DNA杂交，例如，有50％或更高的同源性，但不允许同源性低于50％的DNA杂交，或这样的条件在该条件下，以及在与Southern杂交的一般洗脱条件相应的盐浓度下(即60℃，1×SSC，和0.1％SDS，优选0.1×SSC和0.1％SDS)，DNA能彼此杂交。
“第569位的丝氨酸”是指，在SEQ ID NO4的氨基酸序列中位于第569位的丝氨酸残基。一个氨基酸残基在氨基酸序列中的位置，可以通过在该残基的上游区域进行插入，缺失，或类似的方法而被改变。如果是处于上述的氨基酸序列绝对位置被改变的情况下，本发明中的“第569位的丝氨酸”可以是一个与SEQ ID NO4氨基酸序列中位于第569位的丝氨酸残基相应的氨基酸残基。
本发明中所用的突变MET30基因可以是一种保守变异体，其编码的蛋白质与具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白功能相同，也就是说，突变的MET30编码一种具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白，该蛋白在除第569位之外的一个或几个位点具有一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，或增加。虽然“几个”氨基酸的数目可以根据其在蛋白质的三维结构中的位置或氨基酸的类型而有所不同，但一般是2到10个，优选2到6个，更优选2到3个。或者，突变的MET25基因可以是一种DNA，其编码与SEQ ID NO4的整个氨基酸序列具有不少于30％到40％同源性，优选不少于55％到65％的同源性的蛋白。
导致MET30蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失、插入、增加、倒位的突变也包括基于含有MET30基因的细菌的个体差异或种间、属间差异而自然发生的突变或变化。
本发明的酵母没有特殊的限定，只要其能够生产γ-谷氨酰半胱氨酸，可包括例如糖酵母属(Saccharomyces)的酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假丝酵母属(Candida)的酵母如产朊假丝酵母(Candida utilis)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。本发明的酵母株可以是单倍体，但由于多倍体菌株的生长更强，因此优选二倍体或更多倍的多倍体。
具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的菌株可以通过对多倍体菌株进行突变处理并筛选出具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的菌株来获得，也可以这样获得将用于培养产γ-谷氨酰半胱氨酸单倍体菌株的单倍体菌株，与野生型单倍体菌株交配，使获得的单倍体菌株产生孢子，筛选显示出降低的谷胱甘肽合成酶活性以及具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的菌株，并使得到的不同交配型的产γ-谷氨酰半胱氨酸的两个单倍体菌株交配。用类似的方法，也可以获得三倍体或更多倍的有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力的菌株。
上述的培养和修饰酵母的方法，描述于Hirokawa Shoten出版的“Chemistryand Life，Experimental Line 31，Yeast Experimental Technology”第一版，Yohdosha出版的“Bio Manual Series 10，Gene Experimental Method using Yeast”第一版，ColdSpring Harbor Laboratory Press出版的“Methods in Yeast Genetics 2000版”等文献。
<2>本发明酵母的应用 可以通过在含有足量泛酸的培养基中培养本发明的酵母使其增殖，然后通过在含有有限量泛酸的培养基中培养，使细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸含量增加，从而获得细胞内积累了γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。
优选地，可以通过试验预先测定要获得指定量的酵母细胞所需要的泛酸的量，然后计算要获得目标量的酵母细胞所需要的泛酸的量，来决定泛酸的“足够量”。
在培养酵母使其增殖的步骤中，可以在培养开始前加入全部量的泛酸，或分成几部分在培养的过程中分批加入。培养基和培养条件没有特别的限制，只要它们能控制泛酸的量即可，一般用于生产酵母提取物等的培养基和培养条件都可采用。
在本发明的一个优选具体实施方式
中，可以采用工业使用的常规培养基，因为谷胱甘肽合成酶活性降低的酵母能在不含谷胱甘肽的培养基中较好地生长。可以根据待用酵母的特性任选地加入必要的营养物质。
在增殖酵母获得足够量的酵母细胞后，将酵母细胞培养在含有有限量泛酸的培养基中。例如，将酵母培养在含有足量泛酸的培养基中，然后，将获得的培养物或酵母细胞转到含有有限量泛酸或不含泛酸的培养基中培养。或者也可以不改变培养基，而是通过停止加入另一部分的泛酸来限制泛酸的量。优选当酵母处于对数生长期时限制泛酸的量。在使用面包酵母时，例如将培养对数生长期或稳定期的酵母所获得的培养物接种到浓度为2％的营养培养基中，在30℃振荡培养8到16小时，就可以获得对数生长期的酵母细胞。
在含有有限量泛酸的培养基中培养酵母的步骤中，酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的积累量随时间而增加。优选地，当γ-谷氨酰半胱氨酸的累积量达到目标量时，停止培养。一般来说，在优选条件下，培养时间是10到30小时，优选15到27小时。
获得的培养物或其分级产物中含有γ-谷氨酰半胱氨酸。培养物可以是含有酵母细胞的培养基，或从培养基中收集的酵母细胞，细胞匀浆，或细胞提取物(酵母提取物)。含有γ-谷氨酰半胱氨酸的分级产物也可以从细胞匀浆或酵母提取物中获得。
可以通过加热上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物或其分级产物的方式，使半胱氨酸从γ-谷氨酰半胱氨酸上离解下来。
可以用制备酵母提取物的常规方法，制备酵母提取物等。可以通过用热水提取处理酵母细胞，或消化来处理酵母细胞，从而获得酵母提取物。
上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的培养物或其分级产物，可用于生产食品和饮料。食品和饮料包括酒精饮料，面包食品，和发酵的食用调味物质。通过加热处理γ-谷氨酰半胱氨酸来生产半胱氨酸，可以在生产食品和饮料的过程中或之后进行该生产。
上述的食品和饮料，是通过将所述的培养物或其分级产物与食品和饮料的原材料混合，并把得到的混合物加工为食品和饮料而得到的。本发明的食品和饮料可以通过与一般食品和饮料相同的原材料生产得到，只是本发明还使用了上述的培养物或其分级产物。这些原材料包括，例如，大米，大麦，玉米淀粉等，用于生产酒精饮料；小麦粉，糖，精制食盐，黄油，发酵酵母等，用于生产面包食品；大豆，小麦等，用于生产发酵的食用调味物质。
实施例 在下文中，将通过实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1 <1>培养谷胱甘肽合成酶的活性被降低的酵母 根据常规方法，使食品工业所用的市售单倍体啤酒酵母产生孢子。使用随机孢子方法，从孢子中获得一个单倍体酵母，YN0001菌株(MAT α)。用EMS对YN0001菌株进行突变处理，从突变体中筛选得到突变的YN0002菌株(MATα)，该菌株具有降低的谷胱甘肽含量。四分孢子分析证实YN0002菌株的GSH2基因发生了突变。具体而言，GSH2基因编码蛋白质的第387位甘氨酸被天冬氨酸取代。另外，还获得了谷胱甘肽含量有所降低的突变YN0003菌株。
突变处理在死亡率为90％的条件下进行。将YN0001菌株在50ml YPD培养基中于30℃振荡培养1天。收集酵母细胞，并用0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.5)清洗3次。将酵母细胞悬浮于含有9.2ml 0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，0.5ml 40％D-葡萄糖，和0.3ml EMS的溶液中(Nacalai Tesque，Inc.，Code 155-19)，并于30℃振荡培养90min。向悬浮物中加入10ml 10％硫代硫酸钠(已过滤灭菌)，并于室温放置10min以中和诱变剂。收集酵母细胞并用0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.5)清洗。
将YN0001菌株和YN0002菌株分别接种到YPD培养基中，30℃振荡培养。获得的培养物以2％的浓度接种到SD培养基中，30℃振荡培养。测定处于对数生长期的酵母细胞中谷胱甘肽的含量。结果表明，YN0001菌株中谷胱甘肽的含量是0.52％，而YN0002菌株中谷胱甘肽的含量是0.006％或更少。
<2>培养MET30基因突变的突变菌株 通过与上述同样的方法，用EMS对前述的单倍体YN0001菌株(MATα)进行突变处理，从突变体中获得突变的AJ14819菌株(MATα)，该菌株中MET25基因的表达没有被甲硫氨酸抑制。该菌株被命名为AJ14819，并于2002年9月11日保藏在国家高级工业科学和技术研究中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，国际专利微生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(Central-6，1-1，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERM P-19007。然后，于2003年10月1日在布达佩斯条约的规定下转为国际保藏，保藏号为FERM BP-08502。
可以通过检测菌株在含有硒的培养基中的生长能力来测定MET25基因的表达是否被甲硫氨酸抑制，(DOMINIQUE et al.，MOLECULAR ANDCELLUAR BIOLOGY，Dec.1995，p.6526-6534)。具体地，可以用下述方法来筛选突变体。也就是，把已经进行过突变处理的酵母涂布在YPD琼脂培养基上，涂布的浓度为在琼脂培养基上能够得到大约100个酵母细胞。通过复制法，将YPD培养基上出现的酵母菌株接种到含硒和不含硒的培养基中(前面提及的如DOMINIQUE等所述的琼脂培养基)。筛选出不能在含硒的培养基中生长，但是能在不含硒的培养基中生长的酵母菌株。
可以用下面的方法来检测筛选到的菌株中MET25基因的表达是否增加。将筛选到的酵母菌株和YN0001菌株分别培养在SD培养基中，并收集对数生长期的酵母细胞。然后，分离细胞中的RNA，并使用ACT1基因作为内部标准，测定分离RNA中MET25基因的转录产物的量。使用定量PCR仪(PCR5700，AppliedBiosystem)和TaqMan One-Step RT-PCR试剂盒(Applied Biosystem)进行定量检测。ACT1-986T(SEQ ID NO5)和MET25-1077T(SEQ ID NO6)用作TaqMan探针(Applied Biosystem)。引物ACT1-963F(SEQ ID NO7)和引物ACT1-1039R(SEQ ID NO8)用来扩增ACT1基因，引物MET251056F(SEQ ID NO9)和引物MET25-1134R(SEQ ID NO10)用来扩增MET25基因(Applied Biosystem)。结果表明，与YN0001菌株相比，获得的酵母AJ14819菌株中MET25基因的表达增加了两倍或更多。
用四分孢子分析详细说明获得的AJ14819菌株中突变的基因，并测定该基因的序列。结果发现，MET30基因编码的蛋白中第569位的丝氨酸被苯丙氨酸取代。根据上述方法，获得了MET25基因的表达不被甲硫氨酸抑制的酵母AJ14819菌株。
<3>培养泛酸钙缺陷型酵母 通过与上述同样的方法用EMS对前述的单倍体酵母YN0001菌株(MATα)进行突变处理。为了从突变菌株中获得泛酸钙缺陷型的酵母，将菌株在不含泛酸钙并添加制霉菌素(10μg/ml)的培养基中30℃培养2小时，然后把培养过的培养基涂布在YPD琼脂培养基上。用复制法将产生的突变菌株接种到不含泛酸钙的琼脂培养基和含有泛酸钙的琼脂培养基中(每种琼脂培养基的组分见表1)。然后，筛选出不能在前面的琼脂培养基但是能在后面的琼脂培养基中生长的酵母。根据这些方法，获得了泛酸钙营养缺陷型的酵母Pa0001菌株(MAT a)。
<4>培养泛酸钙缺陷型并且GSH2基因和MET30基因都发生突变的酵母(GMP菌株；二倍体gsh2met30pa-) 根据常规方法，使AJ14819菌株和Pa0001菌株交配获得二倍体。使得到的二倍体产生孢子，通过随机孢子分析，得到了含有突变的MET30基因并且为泛酸钙缺陷型的单倍体酵母MP菌株。随后，使MP菌株和YN0002菌株交配获得二倍体菌株。使得到的二倍体产生孢子，通过随机孢子分析，获得了单倍体酵母GMP-1菌株(MATα)和GMP-2菌株(MAT a)，其中每个菌株都含有突变的GSH2基因和突变的MET30基因并且表现泛酸钙缺陷型。使GMP-1菌株和GMP-2菌株交配获得二倍体酵母GMP菌株。
<5>用GMP菌株生产γ-谷氨酰半胱氨酸 将GMP菌株接种到YPD培养基中(试管中装4ml培养基)，30℃振荡培养1天。将获得的培养物接种到含有0.4mg/dl泛酸钙的培养基中，30℃振荡培养。在其对数生长期，将含有酵母细胞的培养基分成等份，并将等分试样以60mg(干酵母重量)/dl(培养基)的浓度，分别加到不含泛酸钙的培养基以及含有0.4mg/L泛酸钙的培养基中进行培养。随时程测定单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量。结果如图1所示。当菌株培养在不含泛酸钙的培养基中时，其体内γ-谷氨酰半胱氨酸含量随时程的增加量高于在含有高浓度泛酸钙的培养基中培养的菌株。
上述结果表明，GMP菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量随着泛酸钙的缺乏而增加。
对比实施例1.培养含有突变GSH2基因和突变MET30基因的酵母 根据常规方法，将前述的含有突变MET30基因的AJ14819菌株，与从市售酵母中获得的单倍体Pa0001菌株交配获得二倍体。使得到的二倍体产生孢子，并通过随机孢子分析，获得含有突变的MET30基因的单倍体酵母M菌株(MAT a)。随后将M菌株和前述的YN0002菌株交配，得到二倍体。使二倍体形成孢子，通过随机孢子分析获得单倍体GM-1菌株(MAT a)和GM-2菌株(MAT a)，其中每个菌株都含有突变的GSH2基因或突变的MET30基因。GM-1菌株和GM-2菌株交配得到二倍体酵母GM菌株。
实施例2用GMP菌株和GM菌株生产γ-谷氨酰半胱氨酸 将GM菌株和GMP菌株分别接种到YPD培养基中，30℃振荡培养。将获得的培养物接种到含有0.4mg/dl泛酸钙的培养基中，30℃振荡培养。收集对数期的细胞，并以60mg(干酵母重量)/dl(培养基)接种到不含泛酸钙的培养基中，30℃振荡培养。随时程测定单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量。结果如图2所示。
结果显示，当在缺乏泛酸钙的条件下培养GMP菌株时，其单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量随时程而增加。
实施例3.培养泛酸钙营养缺陷型酵母(AJ14861菌株)，其中MET30基因突变而且GSH2基因被破坏 <1>制备用于破坏谷胱甘肽合成酶基因的表达盒 以GSH2-AUR1-C-F(SEQ ID NO11)和GSH2-AUR1-C-R(SEQ ID NO12)为引物，用KpnI消化的pAUR123载体(Takara Shuzo code No.3602)为模板，进行PCR，反应条件如下 用KpnI消化的pAUR123载体 1μl 10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5μl dNTP 4μl 10pmol/μl GSH2-AUR1-C-F引物 1μl 10pmol/μl GSH2-AUR1-C-R引物 1μl KOD Dash DNA聚合酶(Takara Shuzo code LDP-101) 0.5μl 纯水 37.5μl 总计 50μl PCR反应的一个循环为94℃40sec，54℃40sec，74℃1min，重复30个循环。
获得的PCR产物含有GSH2基因开放式阅读框的N-末端区域和C-末端区域，该GSH2基因中插入了AUR1-C基因，因此它可用于破坏GSH2基因。
<2>培养谷胱甘肽合成酶基因破坏的酵母 用上述制备的表达盒，按下述方法破坏GMP菌株中的GSH2基因。也就是说，在YPD培养基中培养GMP菌株，并在对数生长期收集细胞。收集的细胞用1M山梨糖醇溶液洗2次，并悬浮于溶液中5℃放置1小时，所述溶液的成分为0.1M LiCl，10mM DTT，10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA。然后，所得的细胞用1M山梨糖醇溶液洗2次。把制备到的细胞和上述的PCR产物混合，根据“BioManual Series 10，Experimental Techniques on Yeasts”第一版，Youdosha中所述的方法，对得到的混合物进行电穿孔。将电穿孔后的细胞接种到YPD培养基中，于30℃培养16小时。然后，将获得的培养物涂布到含有0.2μg/ml aureobandin A(Takara Shuzo code 9000)作为选择标记的YPD琼脂平板上，30℃培养3天。注意抑制GMP菌株生长的aureobandin A的最小浓度为0.05μg/ml。将出现的菌落涂布到含有0.2μg/ml aureobandin A的YPD琼脂平板上，筛选出具有aureobandin A抗性的菌落。该菌株被命名为AJ14861，并根据布达佩斯条约规定，于2003年11月19日保藏在国家高级工业科学和技术研究中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，国际专利微生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(Central-6，1-1，Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，作为国际保藏，保藏号为FERM BP-08553。
<3>用AJ14861菌株生产γ-谷氨酰半胱氨酸 将AJ14861菌株接种到YPD培养基中(试管中装4ml培养基)，30℃振荡培养1天。将获得的培养物接种到含有0.4mg/dl泛酸钙的培养基中，30℃振荡培养。在其对数生长期，将含有酵母细胞的培养基分成等份，并将等分试样以60mg(干酵母重量)/dl(培养基)的浓度，分别加到不含泛酸钙的培养基或含0.4mg/L泛酸钙的培养基(表1)中进行培养。随时程测定单位干酵母细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量。结果如图3所示。当菌株培养在不含泛酸钙的培养基中时，其γ-谷氨酰半胱氨酸含量随时程而增加的量，要高于在含有高浓度泛酸钙的培养基中培养的菌株。
上述结果表明，AJ14861菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量随着泛酸钙的缺乏而增加。
工业实用性 本发明提供了一种泛酸缺陷型酵母，其中谷胱甘肽合成酶的活性被降低或消除，并且MET25基因的表达被去抑制。在优化条件下培养本发明的酵母，可以得到含有高浓度γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母培养物的培养基。本发明的酵母和酵母培养物的培养基，可用于生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸的食品和饮料。
序列表
<110>味之素公司
<120>生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法
<130>
<150>JP 2002/361918
<151>2002-12-13
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2466
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1476)
<223>
<400>1
atg gca cac tat cca cct tcc aag gat caa ttg aat gaa ttg atc cag 48
Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln
1 5 10 15
gaa gtt aac caa tgg gct atc act aat gga tta tcc atg tat cct cct 96
Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn 6ly Leu Ser Met Tyr Pro Pro
20 25 30
aaa ttc gag gag aac cca tca aat gca tcg gtg tca cca gta act atc144
Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile
35 40 45
tat cca acc cca att cct agg aaa tgt ttt gat gag gcc gtt caa ata192
Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile
50 55 60
caa ccg gta ttc aat gaa tta tac gcc cgt att acc caa gat atg gcc240
Gln Pro Val Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Arg Ile Thr Gln Asp Met Ala
65 70 75 80
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Gln Pro Asp Ser Tyr Leu His Lys Thr Thr Glu Ala Leu Ala Leu Ser
85 90 95
gat tcc gag ttt act gga aaa ctg tgg tct cta tac ctt gct acc tta 336
Asp Ser Glu Phe Thr Gly Lys Leu Trp Ser Leu Tyr Leu Ala Thr Leu
100 105 110
aaa tct gca cag tac aaa aag cag aat ttt agg cta ggt ata ttt aga 384
Lys Ser Ala Gln Tyr Lys Lys Gln Asn Phe Arg Leu Gly Ile Phe Arg
115 120 125
tca gat tat ttg att gat aag aaa aag ggt act gaa cag att aag caa 432
Ser Asp Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Lys Gly Thr Glu Gln Ile Lys Gln
130 135 140
gtc gag ttt aat aca gtg tca gtg tca ttt gca ggc ctt agc gag aaa 480
Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Ala Gly Leu Ser Glu Lys
145 150 155 160
gtt gat aga ttg cac tct tat tta aat agg gca aac aag tac gat cct 528
Val Asp Arg Leu His Ser Tyr Leu Asn Arg Ala Asn Lys Tyr Asp Pro
165 170 175
aaa gga cca att tat aat gat caa aat atg gtc att tct gat tca gga 576
Lys Gly Pro Ile Tyr Asn Asp Gln Asn Met Val Ile Ser Asp Ser Gly
180 185 190
tac ctt ttg tct aag gca ttg gcc aaa gct gtg gaa tcg tat aag tca 624
Tyr Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Lys Ala Val Glu Ser Tyr Lys Ser
195 200 205
caa caa agt tct tct aca act agt gat cct att gtc gca ttc att gtg 672
Gln Gln Ser Ser Ser Thr Thr Ser Asp Pro Ile Val Ala Phe Ile Val
210 215 220
caa aga aac gag aga aat gtg ttt gat caa aag gtc ttg gaa ttg aat 720
Gln Arg Asn Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Lys Val Leu Glu Leu Asn
225 230 235 240
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Leu Leu Glu Lys Phe Gly Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Phe Asp Asp
245 250 255
gtt aac gat aaa ttg ttc att gat gat aaa acg gga aag ctt ttc att816
Val Asn Asp Lys Leu Phe Ile Asp Asp Lys Thr Gly Lys Leu Phe Ile
260 265 270
agg gac aca gag cag gaa ata gcg gtg gtt tat tac aga acg ggt tac864
Arg Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Val Val Tyr Tyr Arg Thr Gly Tyr
275 280 285
aca acc act gat tac acg tcc gaa aag gac tgg gag gca aga cta ttc912
Thr Thr Thr Asp Tyr Thr Ser Glu Lys Asp Trp Glu Ala Arg Leu Phe
290 295 300
ctc gaa aaa agt ttc gca ata aag gcc cca gat tta ctc act caa tta960
Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ile Lys Ala Pro Asp Leu Leu Thr Gln Leu
305 310 315 320
tct ggc tcc aag aaa att cag caa ttg ttg aca gat gag ggc gta tta 1008
Ser Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Leu Leu Thr Asp Glu Gly Val Leu
325 330 335
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Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Glu Lys Lys Ser Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
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Phe Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Glu Gly
355 360 365
aag agg ctg gca tta agt gag ccc tct aaa tac gtg tta aaa cca cag 1152
Lys Arg Leu Ala Leu Ser Glu Pro Ser Lys Tyr Val Leu Lys Pro Gln
370 375 380
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Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Val Tyr Lys Glu Asn Ile Pro Asn Phe
385 390 395 400
ttg aaa ggt atc gaa gaa cgt cac tgg gat gca tat att ctc atg gag 1248
Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu
405 410 415
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Leu Ile Glu Pro Glu Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ile Leu Arg Asp Asn
420 425 430
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Lys Ser Tyr Asn Glu Pro Ile Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Cys
435 440 445
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Val Leu Phe Asn Asp Glu Gln Val Leu Ser Asn Glu Phe Ser Gly Ser
450 455 460
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Leu Leu Arg Ser Lys Phe Asn Thr Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala
465 470 475 480
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Gly Phe Gly Cys Leu Asp Ser Ile Ile Leu Tyr
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<210>2
<211>491
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<213>酿酒酵母
<400>2
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<210>3
<211>1923
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1920)
<223>
<400>3
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权利要求
1.一种酵母，其中MET25基因的表达通过锚定突变MET30基因而去抑制，所述MET30基因具有一个突变，所述突变为MET30基因编码蛋白的第569位丝氨酸被苯丙氨酸取代。
全文摘要
本发明涉及生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法。一种具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力并且为泛酸缺陷型的酵母，其是在含有足够量的泛酸的培养基中增殖，然后在含有有限量的泛酸的培养基中培养，以增加细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量，从而获得了体内累积有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。
文档编号C12P13/12GK101402921SQ20081016873
公开日2009年4月8日 申请日期2003年12月12日 优先权日2002年12月13日
发明者末广真理子, 西内博章, 西村康史 申请人:味之素株式会社