圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法

专利名称：：圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法
技术领域：
：本发明属于水产生物
技术领域：
中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。
背景技术：
：我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40%以上，而圆斑星鲽等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40%-100%，因此，开展这些鱼类遗传性别^r测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。圆斑星鲽(^^wrra,/eg"e"是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海冷水性鱼类，我国北方沿海均有分布，以黄海、渤海为多。圆斑星鲽由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，圓斑星鲽人工育苗技术获得突破，年产圆斑星鲽苗种近百万尾，但是，研究表明圆斑星鲽雌性个体和雄性个体在生长速率上存在很大差别，其雌性个体比雄性个体大80-100%。由于雄性个体生长过慢，降低了圆斑星鲽的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了圓斑星鲽苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定圆斑星鲽的遗传性别，严重影响了圓斑星鲽雌核发育和性别控制研究的进行。有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实—验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaYl)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp,这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到IO个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP4支术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(to/Y425、ft/Y382、to/Y227)和一个X染色体连锁(ft/X420)的AFLP标记。而有关圆斑星鲽性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。
发明内容本发明的目的是为了筛选出圆斑星鲽性别特异分子标记，建立遗传性别鉴定的分子生物学方法，为圆斑星鲽性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。本发明其技术内容如下一、圓斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列；二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法。一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列，包括1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法；2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列。1.圓斑星鲽性别特异分子标记篩选方法；包括1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；2)、基因组DNA的AFLP分析；3)、性别特异分子标记的筛选1)、圓斑星鲽鳍条DNA的提取剪取重约10mg鳍条置于600ju1裂解液中匀浆，加蛋白酶K和RNaseA,于55。C水浴消化至澄清。加入600iu1的酚氯仿异戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混匀后离心(12000rpm，10min);吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000jul的冰乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20。C备用。所述的裂解液组成为10mMTris-HCl，pH8.0;100mMEDTA，pH8.0;100mMNaCl;0.5%SDS;所述的蛋白酶K终浓度为18-22mg/ml;所述的RNaseA终;农度为95-105jug/ml;所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/ji1，基因组DNA的纯度要求OD26。/OD，值为1.76-1.80。2)、基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA才莫板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。所述的对DNA模板进行酶切，其方法是先用EcoRI/Msel酶混合物(1.25U/)i1)消化80-110ng模板DNA6小时，用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于7(TC孵育15分钟灭活限制性内切酶。所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0ju1接头混合物和0.5ia1T4DNA连接酶，20。C孵育20小时。所述的预扩增，其方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3，末端带有一个选择性石A^(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增。所述的选择性扩增其方法是将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板。用荧光标记的化oRI引物和他el引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3，末端带有三个选择性碱基。向PCR扩增产物中加入适量的变性剂，于94。C变性5分钟后立即置于水上待用。总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94。C变性后用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。所述的电泳分析，其方法是将变性好的扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V,功率40W,电流40mA，温度45°C,时间3.5小时。然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。3)、性别特异分子标记的筛选总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国LifeTechnologies^^司)对20尾圆斑星鲽Ji准性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出两个引物组合产生了两条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在其中商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4扩增出一条533bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF533;商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8扩增出一条长度为218bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF218。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记。82.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列，包括1)圆斑星鲽雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP标记的序列1)、雌性特异AFLP片段的回收选取能扩增出VevaF533bp、VevaF218bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下分别含有以上三种长度的雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。2)、AFLP片段的克隆将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、性别特异分子标记的序列选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自5个阳性克隆的相同长度的雌性特异AFLP片段的核苷^列，用DNAMANVersion4.0进行多序列比对，其同源性分别为99.56%、99.78%，表明各个个体得到的条带是同一个序列。两条序列之间也没有同源性。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法剪取待测圆斑星鲽的鳍条，应用上面建立的鳍条DNA提取方法提取DNA，再用上面筛选出来的能产生圆斑星鲽J难性特异DNA片賴:(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4,或商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8)对基因组DNA进行AFLP分牙斤，电泳证实DM条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的特异DNA片^殳，或者M-CAT和E-AGG的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的雌性特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有该片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。本发明与已有技术对比其特点是本发明采用分子标记技术，以圆斑星鲽为材料首次筛选到雌性特异DNA分子标记，建立了我国鲽类遗传性别鉴定的分子生物学^J支术。该纟支术具有准确、灵壽文、可靠等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类单性育种具有重要意义和应用价值。附图il明图1、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF533电泳图表示引物组合M3E4的扩增产物；M表示分子量标准；图2、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF218电泳图表示引物组合M4E8的扩增产物；M表示分子量标准；图3、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF533的核苷酸序列"有下划线的字符"表示选择性引物序列；图4、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF218的核苷酸序列"有下划线的字符"表示选择性引物序列；图5、圆斑星鲽雌性个体和雄性个体遗传性别PCR鉴定结果(M4E8引物组合)M表示分子量标准；"C"表示雌性对照；1-24表示检测了24尾个体，其中，6-10,15,16,18,19，24共10个个体为雌性，其余14个个体为雄性。具体实施例方式采用现代分子生物学技术，筛选出性别特异的分子标记，采用分子克隆技术，克隆出性别特异的AFLP片段，建立圆斑星鲽遗传性别鉴定的PCR分析技术，这对于培育圆斑星鲽全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将圆斑星鲽开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动圆斑星鲽养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。下面通过圆斑星鲽雌性特异AFLP分子标记的筛选及遗传性别鉴定方法的建立，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明本发明其技术内容如下一、圆斑星鲽性别特异分子标记篩选及其序列；二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法。一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列，包括1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列。1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；包括1)、圆斑星鲽鳍条DNA提取，2)、基因组DNA的AFLP分析，3)、性别特异分子标记的篩选。1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取剪取重约10mg鳍条置于600m1裂解液(lOmMTris-HC1，pH8.0;100mMEDTA，pH8.0;100mMNaCl;0.5%SDS)中匀浆，加蛋白酶K(终浓度为18-22mg/ml)和RNaseA(终浓度为95-105jug/ml)，于55。C水浴消化至澄清。加入600jul的酚氯仿异戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混匀后离心(12000rpm,10min);吸取上清液再次抽^是、离心；最后，用1000ju1的水乙醇沉淀DNA,经70%乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20。C备用。基因组DNA的浓度应不低于20ng/ju1，基因组DNA的纯度要求0026。/0028。值为1.8左右。2)、基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。(1)、对DNA模板进行酶切用1.0ia1fcoRI/v^el酶混合物(1.25U/ju1)消化80-110ng模板DNA6小时，再用ly。的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于7(TC孵育15分钟灭活限制性内切酶。(2)、将特异接头连接到酶切片段上向上面的酶切反应混合液中加入12.0ju1接头混合物和0.5m1T4DNA连接酶，2(TC孵育20小时，保证接头充分连接。(3)、预扩增将连接产物稀释10倍，作为预扩增的模板；预扩增引物是3，末端带有一个选4奪性石絲(A或者C)的引物混合物。PCR反应条件为92-94°C，30秒；54-56°C,1分钟；70-72°C，1分钟。20个循环后，4。C待用。(4)、选择性扩增将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点#"1的引物和含酶切位点fcoRI的引物进行扩增，这两种引物3，末端带有三个选择性石成基。PCR反应分为三步第一步进行1个循环92-94°C，30秒；63-65°C，30秒；70-72°C,1分钟；第二步进4亍12个循环92-94°C,30秒；65-54°C,30秒；70-72°C,1分钟；第三步进行23个循环——92-94°C,30秒；54-56°C，30秒；70-72°C，1分钟。扩增产物加入适量的变性剂，94'C变性5分钟，立即置于水上。(5)、电泳分析将变性好的扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V,功率40W,电流40mA,温度45。C，时间3.5小时。总共用了64个引物组合对20尾圆斑星鲽雌性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析，用SAGA软件分析电泳图谱后，筛选出产生特异片段的引物组合两个，这两个引物组合共产生了两条雌性特异的DNA片段。3)性别特异分子标记的筛选总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国LifeTechnologies/>司)对20尾圆斑星鲽jt准性个体和20尾圆斑星鲽i,性个体的基因组DNA进^亍了AFLP-PCR扩增，这64个引物组合的核苷酸序列见表1。20尾雌性个体为性成熟的雌性亲鱼，20尾雄性个体为能挤得出精液的雄性亲鱼。表l64个AFLP引物组合的核苷^列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通过SAGA软件分析筛选出两个引物组合产生了两条雌性特异的DNA片段(图1、图2),这些片段在雄性个体基因组DM中不存在其中商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4扩增出一条533bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF533;商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8扩增出一条长度为218bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF218。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记，即可用于遗传性别鉴定。2、圓斑星鲽性别特异分子标记的序列包括1)、雌性特异AFLP片段的回收；2)、AFLP片段的克隆；3)、雌性特异分子标记的序列。1)、雌性特异AFLP片段的回收根据雌性特异AFLP标记的筛选结果，选取能分别扩增533bp、218bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别获得533bp、218bp的雌性特异AFLP条带，用无污染的刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶，力口20iul超纯水，50。C溶解约1.5小时，得到了微量的DNA,回收目的片段备用。2)、AFLP片段的克隆采用商品化的pMD18-T连接试剂盒将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到PMD18-T载体中，采用标准的CaCl2转化方法将连接产物转化感受态细菌，将转化产物涂布LB培养m,37。C过夜培养。次日，用灭菌的牙签挑取单菌落，投入1mlLB(含氨卞青霉素)液体培养基中，37°C,250rpm过夜培养。然后采用pcr法筛选目的克隆，从每个样品中取1m1菌液做为模板，用所对应的选择性扩增的引物和反应程序进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、雌性特异分子标记的序列选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自5个阳性克隆的相同长度的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMANVersion4.0进行多序列比对，其同源性分别为99.56%、99.78%，表明各个个体得到的条带是同一个序列。两条序列之间也没有同源性。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到4壬何同源的序列。圆斑星鲽雌性特异AFLP片段的核苷酸序列(示于图3、图4)。二、遗传性别鉴定方法应用上面建立的鳍条DNA提取技术提取DNA,这种方法不用杀鱼，为非损伤性技术，适于推广应用；然后再用上面筛选出来的能产生圆斑星鲽雌性特异DM片段(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4或商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8，这两个引物组合中的任意一个组合)对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的特异DNA片段，或者M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的Ji准性特异片^:，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有该片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。通过这种方法就可以鉴定圓斑星鲽的遗传性别，为圓斑星鲽性别控制和全雌育种研究提供技术手^更。这种方法准确、可靠，在圆斑星鲽性别控制和单性育种中具有重要应用价值(图5)。14序列表<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>533、218<212〉DNA<213>圆斑星鲽(Veraspervariegates)<400>1gactgcgtaccaattcaccctccttttagctcagttttggtctccaccagcUgtg柳a60agatatttgtctctttagctgctacgtgttctacttttttttagcagctcattgtttgcg120tgtcttctggagctgg織ggtcgtgcacagcgggtttttatctttactgaaaagcagct180gcctgccgctgctggc"cggcgttgatgagagggctgagactcgtgctgagactcgtgc240gcacacagatggtctgctcgtgcaaggagtgaaacactgaagtgatcctctgcagagaag300ccttctctctcactacagggUataaaaccattacgatgccnggtgc"360gcacacctggctttcaaacggagaggcaggtggatttattgcatgtcactccc"aatct420gc柳atccgaaggtgaggcacacgatctcagggctggagtgaaaagcatcagctgttgg480ctttttteatUatctteatteatatgeagaaagctgttactcaggactcate533gatgagtcctgagtaacatgctaacaggctcgtgttaacttccgttgtgtggatgg"tc60C3tCtgttCggettgeattccaactaaaggaggctatcagcgagctaacg"gcaggagc120UacagcgagcUacggatacacggcagctacaagacaaaccgagctaaxcgagctuag180gctagataaacacattacacctg^ttggtaegcagtc218权利要求1、一种圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法及其序列，其特征在于它技术内容如下1)、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；2)、圆斑星鲽性别特异分子标记克隆及其序列；1)、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法，包括(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；(2)、基因组DNA的AFLP分析；(3)、性别特异分子标记的筛选(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液中匀浆，加终浓度为18-22mg/ml的蛋白酶K和终浓度为95-105μg/ml的RNaseA，于55℃水浴消化至澄清；加入600μl的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1混合物抽提，充分混匀后离心12000rpm，10min；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用；所述的裂解液组成为10mMTris-HCl，pH8.0；100mMEDTA，pH8.0；100mMNaCl；0.5％SDS；所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD260/OD280值为1.76-1.80；(2)、基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切，其方法是先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μlT4DNA连接酶，20℃孵育20小时；所述的预扩增，其方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增其方法是将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的EcoRI引物和MseI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的变性剂，于94℃变性5分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析，其方法是将变性好的扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；2、一种圆斑星鲽遗传性别鉴定方法，其特征在于它的方法是:剪取待测圆斑星鲽的鳍条，应用上面建立的鳍条DNA提取方法提取DNA，再用上面筛选出来的M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4，或M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的雌性特异DNA片革爻，或者M-CAT和E-AGG的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的雌性特异DNA片段，即可认为这些鱼为全文摘要一种圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别检测方法，它的方法是鳍条DNA的提取、基因组DNA的AFLP分析、性别特异AFLP标记的筛选及其序列，以及遗传性别鉴定方法的建立。本发明建立了圆斑星鲽鳍条DNA提取方法和AFLP分析技术，筛选出分子量分别为533bp和218bp的2个雌性特异AFLP分子标记，获得了这2个AFLP标记的核苷酸序列，创建了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明首次筛选到圆斑星鲽雌性特异AFLP分子标记，建立了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明方法具有先进、准确、可靠的特点，在圆斑星鲽性别控制和全雌苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。文档编号C12Q1/68GK101429557SQ20081018227公开日2009年5月13日申请日期2008年11月26日优先权日2008年11月26日发明者田永胜,陈松林,马洪雨申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所