专利名称：：用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片及使用方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因芯片及其使用方法和检测用试剂盒，特别涉及一种用于肠产毒性大肠杆菌o血清群和毒力基因检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒。
背景技术：
：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli)，通常称为大肠杆菌，是人和很多动物肠道中的一种兼性厌氧菌，是最占优势的正常栖居菌。它能发酵多种糖类，产酸产气，在婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。在肠道内正常栖居条件下的大肠杆菌，是不致病的。当机体免疫力低下，或当它侵入肠道以外部位时，可引起肠道内或肠道外疾病，因此大肠杆菌为条件致病菌。在肠道外，大肠杆菌可侵入胆囊、膀胱等处引起肠胃、中枢神经系统的化脓性感染或泌尿道炎症。而在肠道内，主要是由某些特殊血清群的大肠杆菌引起不同症状的腹泻，这些能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌(DiarrheagenicEscherichiacoli，DEC)。根据其致病机理和不同的生物学特性将其分为6类肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EnteroaggregativeE.coli，EAEC)、弥散粘附性大肠杆菌(DiffuselyadherentE.coli，DAEC)。在中国，肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)是由致泻性大肠杆菌引起的腹泻疾病的最常见病原菌。国内不同省市地区关于由DEC引起的腹泻疾病的流行病学调查显示，ETEC无论在地区覆盖范围还是在出现频率上，在引起腹泻的病原菌中始终处于最显著地位。国际上对于ETEC的相关报道也说明，它是在发展中国家引起婴幼儿腹泻和旅游者腹泻的最主要病原菌。据不完全统计，发展中国家每年受ETEC感染的5岁以下儿童约有2.8_4亿人次，5-14岁儿童大约1亿人次，15岁以上成年人大约4亿人次之多；在非洲、亚洲和拉丁美洲所出现过的旅游者腹泻事件中有1/5-1/3都是由ETEC所引起的；世界上每年都有30-50万人死于ETEC引起的腹泻，其中大部分为婴幼儿。根据国际上关于肠产毒性大肠杆菌的报道统计，ETEC最常见的0血清群有06，08，011，015，025，027，078，085，0114，0115，0126，0128，0139，0148，0149，0159，0166，0167，0173等19种。MARCIAWOLF统计分析了遍布世界各地的18个国家和地区的相关报道，建立了一套覆盖ETEC的0血清群、H血清群、黏附因子、表面抗原、毒素、地理位置和出现数目等多项信息的ETEC数据库。根据该数据库，大肠杆菌06、078、08和0128为ETEC最常见血清群，在该数据库中这些血清群的菌株出现频率各占17%、12%、11%和8%，四种3血清群的菌株数量总合(464株)大约占整个数据库菌株数量(954株)的一半。肠产毒性大肠杆菌区别于其它致泻性大肠杆菌的一项最显著特征是产生肠毒素，包括不耐热肠毒素(HeatLabileToxin，LT)和耐热肠毒素(HeatStabletoxin，ST)。肠产毒性大肠杆菌可表达LT、ST两者的一种，或者两者同时都表达。事实上，大肠杆菌只有表达LT、ST两种肠毒素中的至少一种，才可被鉴定为肠产毒性大肠杆菌。因此，该两种毒素的编码基因为鉴定ETEC提供了有效的分子标记。不耐热肠毒素(HeatLabileToxin，LT)是一种寡聚体毒素，在结构和功能上与霍乱弧菌素十分相似，其存在形式包括LT-I和LT-II两种。LT-I在人和动物中均常见，具有致病性；而LT-II很少在人体中出现，对人或动物，均无致病性。文献中通常所提到的LT，均指具有致病性的LT-I。LT-I是由分子量为28kDa的一个A亚基和分子量为11.5kDa大的五个相同的B亚基构成的大分子量寡聚体。而不同于大分子寡聚体LT的耐热肠毒素(HeatStabletoxin，ST)是个小分子单体小肽，其耐热性源于其氨基酸组成中所富含的半胱氨酸残基的二硫键。ST的存在形式也有两种STa和STb(有的文献中称作ST_I和ST-II)。STa是由18或19个氨基酸组成的小肽，分子量为2kDa，除了ETEC以外还可由小肠结肠炎耶尔森氏菌和霍乱弧菌产生。根据其最早发现时候的菌株分离来源不同，STa还分为猪源STp(STIa)和人源STh(STIb)两大类，编码STp和STh的基因核苷酸序列相似性达70%。STb是由48个氨基酸组成的，分子量为5.lkDa的小肽，在蛋白序列上与STa没有任何同源性，不同于STa的是它会导致肠上皮组织损伤，包括绒毛上皮细胞的损失和局部绒毛萎縮。以上这些肠毒素均由质粒介导产生编码STa的基因常与编码定居因子的基因同位于一大质粒Ent上；而编码STb的质粒与编码LT的质粒同位于一个质粒上；也有些ST基因位于转座子上。肠产毒性大肠杆菌的致病机理是，它首先通过具有高度专一性的定居因子(colonizationfactor)黏附于宿主小肠黏膜表面，释放出肠毒素。毒素经过内吞作用进入粘膜细胞内腔，通过高尔基体-小囊泡运输机制运输至极化的肠上皮细胞基底外侧，与受体GM1结合。LT与GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶，使细胞质中的cAMP含量持续增高；ST与GM1结合后，激活肠上皮细胞的鸟甘酸环化酶，促使细胞浆中cGMP水平上升。cAMP和cGMP均能引起肠腺分泌增强，使大量液体集聚于小肠内，大大超过了其吸收能力，于是出现腹泻，使水、钠离子、碳酸根离子大量丧失，造成脱水、代谢性酸中毒、高血钾症，致使心力衰竭，有部分病例还会死亡。受污染的水和食品是ETEC最常见的传播载体。为了尽早发现造成ETEC传播的水和食品源，建立一种快速、准确、有效的ETEC检测技术是当前迫在眉捷的需要。美国食品药物管理局(FDA)制订的关于食品卫生检验的标准方法中，对大肠杆菌的检测是基于稀释培养和对生化反应结果的观察，沿用了费时繁琐的传统技术。而中国国家商检局当前所采用的对出口食品中大肠杆菌的检测标准，也大体等效采用了美国FDA的标准方法，同样在检测精度和效率上受着很大的限制。中国现行的国家标准方法对于ETEC的检测也是通过分离培养，生化反应，血清分型，毒素测定等一系列步骤，整个流程大约需要4-5天，不但耗时长，操作繁琐，费用高，而且易受人为因素影响。此外，大部分血清极难生产，在血清型检测中容易出现漏检或假阳性结果。基因芯片作为上个世纪九十年代末刚刚开始发展起来的一项新兴技术，目前已经广泛应用到了分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药研发、环境污染监测等诸多领域。基因芯片综合运用了生物技术、微制造、微加工、微电子等学科的最新成果，体现出高速度、高通量、集约化和低成本等多项优点。它从生命的本质——核酸分子水平入手，利用最忠实、特异的DNA碱基互补原则，通过分子杂交过程来对细菌、病毒等进行区分和鉴定，因此其准确度和可靠性也是毋庸置疑的。基因芯片，在今后的食品安全检测，饮用水和环境卫生的监督，以及临床感染性疾病的诊断工作中，具有重大的影响和作用。以肠产毒性大肠杆菌的检测为例，它就能够在同一时间，快速准确地给出待检样品中大肠杆菌的血清群鉴定结果和毒素测定结果两方面的重要报告。在基因芯片检测中，耙基因的扩增环节是极为重要的。采用的随机引物PCR扩增法，先后只用两条引物便可完成对任何细菌DNA进行全基因组范围的扩增。随机引物PCR扩增法，克服了以往在MultiplexPCR中不可避免的引物相互干扰问题，成功实现了对多种靶标DNA的同步有效的扩增。通过该方法，一些检测范围以外的细菌也能被扩增DNA，从而有望发现新的致病菌株。综上所述，有必要发明出一种结合最有发展意义的随机引物PCR扩增法和最先进的基因芯片技术的检测方法，使对肠产毒性大肠杆菌的检测工作变得更加快速、准确和全面。
发明内容本发明的一个目的是提供一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片，以弥补传统大肠杆菌分型检测技术存在的不足，实现肠产毒性大肠杆菌检测的快速、准确和可靠。本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针具有下述基因序列中的至少一种1)不同血清群大肠杆菌的0-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列(包括转运酶基因wzx和聚合酶基因wzy)中选取的DNA片段中的至少一种；2)肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因中(如LT、STp、STh、STb四种肠毒素的编码基因elt、estA(p)、estA(h)、estB中)选取的DNA片段;3)痢疾志贺氏菌1型的基因(如痢疾志贺氏菌半乳糖苷基转移酶RfpB的编码基因rfpB)中选取的DNA片段，其作用是将0-抗原寡糖单位处理酶基因序列十分相近的大肠杆菌0148和痢疾志贺氏菌1型进行区分鉴别。4)上述1)、2)或3)中所述的DNA片段的互补DNA或RNA片段。上述1)中所述不同血清群大肠杆菌包括06、08、011、015、025、027、078、085、0114、0115、0126、0128、0139、0148、0149、0159、0166、0167、0173中的一种或多种。本发明的优选实施例中，固定在固相载体上的特异寡聚核苷酸探针具有SEQIDN0:4-SEQIDNO:51所示的核苷酸序列中的至少一种。本发明所述的基因芯片中，固相载体上还固定有阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针为从细菌16SrRNA基因序列中选取的5DNA片段，具有SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；荧光探针和阴性对照探针，分别具有SEQIDNO:1与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本发明还提供上述的基因芯片的使用方法，其主要包含步骤1)根据不同血清群大肠杆菌的0-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列、肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因或痢疾志贺氏菌1型半乳糖苷基转移酶RfpB的编码基因rfpB基因设计并制备出用于芯片杂交检测的寡核苷酸特异探针；2)将步骤1)中所得的寡核苷酸特异探针与阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针一同点置于芯片片基，制备出所需基因芯片；3)制备待测样品的基因组DNA，利用随机引物PCR法对其进行扩增，获得耙序列；4)荧光标记步骤3)中得到的耙序列，并将标记样品与步骤2)所述基因芯片进行杂交；5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并鉴定结果。其中步骤3)中所述随机引物PCR法中包括使用PCR引物，该PCR引物优选具有SEQIDN0:52-SEQIDNO:53所示的核苷酸序列。在基因芯片检测中，耙基因的扩增环节是极为重要的。本发明所采用的随机引物PCR扩增法，先后只用两条引物便可完成对任何细菌DNA进行全基因组范围的扩增。随机弓I物PCR扩增法基本原理是，首先由引物A引导合成第一步PCR产物，由于该引物3'末端有长度为9bp的随机序列，所以很容易与变性的模板DNA各相应区段互补结合，随机产生长短不一致的DNA片断。这些第一步反应的产物的总体序列基本覆盖整个基因组序列，故其琼脂糖凝胶电泳结果也是亮度均匀的，大小为250-1000bp之间的拖影(smear)。经纯化后的第一步PCR产物用来作为第二步PCR的模板，在引物B的引导下扩增和富集第一步的产物，其中的tag为标签标记(见图1)。随机引物PCR扩增法，克服了以往在MultiplexPCR中不可避免的引物相互干扰问题，成功实现了对多种靶标DNA的同步有效的扩增。通过该方法，一些检测范围以外的细菌也能被扩增DNA，从而有望发现新的致病菌株。本发明所述的基因芯片可用于检测大肠杆菌06、08、011、015、025、027、078、085、0114、0115、0126、0128、0139、0148、0149、0159、0166、0167、0173中至少一种血清群、肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子。本发明还提供一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的试剂盒，其包括上述的基因芯片。上述试剂盒还包括PCR引物，该PCR引物优选具有SEQIDNO:52_SEQIDNO:53所示的DNA序列或其互补DNA序列。上述试剂盒还包括杂交盒、杂交液配方试剂以及芯片洗液配方试剂。本发明所述的试剂盒可用于检测大肠杆菌06、08、011、015、025、027、078、085、0114、0115、0126、0128、0139、0148、0149、0159、0166、0167、0173中至少一种血清群、肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子。由上述的技术方案可见，本发明弥补了肠产毒性大肠杆菌的传统检测法的不足，相比于以往的分离培养、生化反应、血清鉴定、毒素测定的一系列繁琐步骤，提供了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的肠产毒性血清型检测的基因芯片及其检测方法。6针对致病菌检测方面的基因芯片大部分为对细菌种的鉴别(如发明者冯露,王磊,王苏日古嘎,王荃申请人:天津生物芯片技术有限责任公司