一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用的制作方法

专利名称：：一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于动物分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种与猪胴体性状相关的分子标记的克隆及制备方法与应用。
背景技术：
：自占以来，猪在我国一直是六畜之首。养猪业的起伏，更是牵动着人民的生活水平的提高。猪肉在全世界的消费量占红色肉类消费总量的43%,并且猪是人类身体的重要模式系统同时也是未来器官移植的重要来源(Rothschild,2003)。因此对猪的研究不管是从国民经济角度出发还是从人类健康角度出发，都有着重要的实际意义。我国是世界上养猪最早的国家之一，养猪的历史达几千年之久，经过祖先辛勤的饲养和选育，形成了许许多多的各具特色的地方品种。长期以来,猪的育种以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标,并已取得显著成绩。但伴随着片面追求生产效益和利益的是大量优良品种面临着灭绝的危险，有的品种甚至已经灭绝。在猪的瘦肉率和生长速度大幅度提高的同时，传统的育种手段也遭遇到发展的瓶颈，已经很难象过去那样大幅度地提高猪的生产水平和抗病能力了。猪生产水平的提高实际上降低了猪的体质和适应性，并影响到猪的肌肉品质。随着我国社会经济的发展，人民生活水平与消费水平的提高，带来了人们膳食结构与饮食观念的变化，消费者对猪肉品质的耍求也越来越高。这些出现的一系列的新矛盾和新问题，迫切需要用新的手段和对策解决猪的育种问题。分于生物学的飞速发展使得猪的育种工作出现了新的曙光。利用遗传学或分子生物学手段对传统育种工作的不足之处进行了强有力的补充，也使得猪的育种能够突破传统育种工作面临的瓶颈问题，大大地促进了猪育种工作的发展。目前，标记辅助选择(MAS)、影响猪重要数量性状的基因组区域定位(QTL)、用基因组扫描(genomescanning)法和候选基因法(Candidategeneapproach)研究影响猪重要经济性状的主效基因(Economictraitsloci，ETLs)已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中，取得了巨大的经济效益和社会效益。随着分子遗传学技术在动物育种中的应用，世界各国猪的育种技术已迈入分子育种阶段。目前通过候选基因法与标记辅助选择(MAS),已经找到了一些影响猪的生产性状的基因。Casas-Carrillo等(1995)在以6头公猪与18头无相关的母猪杂交群体中，发现在一个公猪家系中位于猪5号染色体上的类胰岛素样生长肉子l(Insulinlikegrowthfactor1，/GF-/)基因型与断奶后日增重存在连锁(LOD=2.3);Nezer等(999)以大约克与皮特兰杂交的677头后代作为试验对象，研究了影响体脂与肌肉性状的QTL，同样发现了位于2号染色体短臂的QTL,同时筛选到2个候选基因JWKZ)/和/GF-//,.位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(M;;ogem'")是MyoD基因家族的成员，TePas等(1999)在两个大白猪群中检测了该基闲的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的A/;;oi)基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中;^ogew'"、WJ/-5、MyoZ)/的mRNA表达水平比L一系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(TePasMF等，Influencesofmyogeningenotypesonbirthweight,growthrate,carcassweight,backfatthickness,andleanweightofpigs.JAnimSci,1999,77:2352-2356);Fujii等(1991)发现氟烷基因(WW)是导致猪产生灰白水样肉(Pale,soft,exudativepork，PSE肉)的主效基因，该基因的编码产物为钙释放通道蛋白(calciumreleasechannel,C及C)或兰尼定受体l(ryanodinereceptor1,CTK/义如果猪只携带两个隐性突变基因(朋)就发生猪应激综合征(Porcinestresssyndrome,PSS)，严重影响到猪的存活率和猪肉品质，导致猪的应激死亡和产生劣质肉(PSE肉)，但隐性基因却对胴体性状具有正效应(Hamilton,etal.,2000)。进一步的研究也证明，iKR7位点的突变虽然对肉质性状具有负效应，但对几乎所有的胴体组成性状均具有正效应，有商业价值的iK^位点基因型的简化DNA检测法已成为专利并得到广泛应用(彭中镇等，1999);，(RendementNapole)基因又称酸肉基因，LeRoy等(1990)首先在汉普夏猪及其杂种中发现不利等位基因Ayr可使肌肉中肌糖原含量升高，终端pH值降低，造成酸肉和烹调损失，猪肉工艺学品质下降，影响火腿的产量。Milan等(2000)通过对候选区域进行大规模的测序分析，发现单磷酸腺苷活化酶Y3亚基基因(AMP-activatedproteinkinase(AMPK)，Y—subunit3,/ffiK4tfJ)编码第200位氨基酸的密码子的错义突变与汉普夏猪的酸肉表型直接相关，RN—猪的该位点均为不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(2001)在1800个商品猪群中对该基因进行分型，结果发现了新的等位基因与肌糖原含量相关并进一步影响肉质性状。与Milan等发现的位点不同的是，这个位点的不同等位基因不仅仅在汉普夏猪中分离，它在典型的商品猪群中多态性也比较丰富，对育种具有更广泛的适用价值；猪FOS原癌基因(proto-oncogene)被认为是骨骼肌肌纤维特性的候选基因，位于猪7号染色体上影响肌纤维的QTL区域内(Reiner,etal.,2002)。Reiner等(2002)报道了^OS染色体区域与骨骼肌纤维特性的关系，发现代表欧洲猪种的BB基因型个体比AA基因型梅山猪的白肌纤维多10.9%。W"//^是MuRF(Muscle-specificRINGfinger,MuRFs)蛋白家族的成员之一，该家族包括有三个成员，分别是浙W尸厶#^/^及#"必％它们只特异性的在心肌和骨骼肌中表达。该家族三个蛋A在结构上具有较高的保守性，它们都包含有一个N末端的高保守的环指结构，以及紧随其后的锌结合B-box结构域和富亮氨酸的巻曲螺旋结构(SpencerJA等.RegulationofmicrotubuledynamicsandmyogenicdifferentiationbyMURF,astriatedmuscleRING-fingerprotein.JCellBiol,2000,150:771—784;CentnerT等.Identificationofmusclespecificringfingerproteinsaspotentialregulatorsofthetitinkinasedomain.JMolBiol,2001,306:717—726.)。由于这种结构上的共性，MuRF家族蛋白又被认为是RBCC(RING-B-box-coiled-coiled)蛋白家族的成员。目前研究表明，RBCC蛋白家族的成员在信号转导、基因转录、细胞分化生长以及组织形成过程中发挥重要作用(FreemontPS.RINGfordestruction.CurrBiol,2000，10:R84-R87)。iW尸i通过与肌纤维，微管以及细胞核因子的结合来发挥其作为细胞骨架接头及信号转导因子的作用(PizonV等.TransientassociationoftitinandmyosinwithmicrotubulesinnascentmyofibrilsdirectedbytheMURF2RING-fingerprotein.JCellSci，2002,115:44694482)，在原代培养的鸡胚胎骨骼肌细胞中利用反义RNA技术抑制i/i^F溯表达，可明显观察到成肌细胞融合和肌原纤维生长延迟，使得肌纤维的伸縮性受到影响(McElhinnyAS等,Muscle-specificRINGfinger-2(MURF-2)isimportantformicrotubule,intermediatefilamentandsarcomericM-linemaintenanceinstriatedmuscledevelopment.JCellSci，2004117:3175-3188)。鉴于M"/F2基因对成肌细胞的作用，我们认为它很可能在猪的肌纤维发育过程中起到重要作用，进而影响猪的重要经济性状一生产性状。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它对生产性状的影响。
发明内容本发明的目的在于克隆一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的MW/^基因片段，寻找突变位点，筛选一种与猪胴体性状相关的分子标记，利用该分子标记进行猪胴体性状的标记辅助选择及应用。本发明通过以下技术实现一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的傲/AK基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。在序列表SEQIDNO:1所述的的第112bp处有1个A112-G112的碱基突变，导致历/j/7-RFLP多态性。申请人设计了一种检测基因片段突变的引物对，所述引物对的正向引物为5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3';反向引物为5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'。一种制备所述的与猪胴体性状相关的ifeBK基因片段的方法，按照以下步骤(1)以鼠Afe/^2基因的mRNA为信息探针，做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分核苷酸序列，用该核苷酸序列与鼠cDNA序列比对，预测猪Mw/F2cDNA序列，以该预测的cDNA序列作模板设计引物，以成年中国地方猪品种通城猪的肌肉组织总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得猪Mw/F2基因cDNA序列；(2)提取猪基因组DNA,设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得猪Af"iF2基因片段核苷酸序列，以该基因片段的核苷酸序列为模板设计突变引物，获得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。在本发明的实施例中申请人已将制备的与猪生产性状相关分子标记应用在猪分子标记辅助育种的关联分析中的应用。更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。本发明的效果是发现了一个与猪胴体性状相关的分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。序列表SEQIDNO:l是本发明克隆的与猪胴体性状相关的傲W/^基因片段的核苷酸序列；图l:是本发明技术流程图2:是本发明中猪MW/^基因cDNA序列(它包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR)，图中起始密码子和终止密码子用标有下划线的加粗斜体显述；图3:是本发明中猪浙/y/^基因用于寻找SNP位点的部分DNA序列，图中有加粗下划线的为突变位点；图4:是本发明中猪浙说e基因用于性状关联分析的核苷酸序列，图中有加粗下划线的为突变位点；图5:是本发明中猪浙W/^基因用于性状关联分析DNA序列扩增电泳结果，图中泳道M:DNAMarkerl;图6:是本发明中猪#"//2>基因测序发现的A-G突变；图7:是本发明中猪J/"兄K基因CDS区的历'"/7-RFLP的三种基因型(AAAGGG)电泳结果，图中泳道M:DNAMarkerl。具体实施例方式实施例1:(一)猪俯W/^基因的CDS克隆及部分DNA序列扩增(1)引物设计用鼠M/ZP/2"基因的mRNA序列(GenBank登录号NM—001081281)为信息探针，利用NCBI的BLAST工具在GenomicBiology猪基因组数据库中做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分同源DNA序列，然后用此DNA序列与鼠CDS序列比对，预测出抓/Z^i完整的cDNA序列，以此预测序列作模板利用PrimerPremier5.0软件设计两对引物分段扩增浙/zKS因cDNA，对两序列进行拼接获得浙My^cDNA序列(包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR);利用BLAST获得的i/"^^DNA序列设计引物扩增猪MuRF2部分核苷酸序列，发现一个碱基突变位点(A779-G779)。扩增#"7/^基因cDNA序列的引物对如下所示MuRF2CDSl正向引物5，AGCCCAGCCTGAAACAATG3'，反向引物5'CTTTCTGATGAGAGCACGG3';MuRF2CDS2正向引物5，TGAACTGCTMGTCCCCACG3'反向引物5，GAGGTCCCTATCATCATCGG3，扩增i/WP/^基因部分核苷酸序列的引物对如下所示MuRF2SNP正向引物5'CCTMCCCACCTAACAGGAATG3''反向引物5'CTACCCAGTGCTAMTGCCC3'。(2)反转录PCR扩增反应利fflTRIzoL试剂盒(购自美国GIBC0公司)从成年"通城猪"(一种具有中国地方猪血缘的地方猪种)肌肉组织中提取总RNA，具体操作方法参照TRIzoL试剂盒说明书进行。cDNA第一链的的合成反应总体积为50u1,首先将总RNA2yg与oligod(T)u4n1，随机引物1u1，DEPC水9ul混合于一离心管中'TO。C变性5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后加入M-MLV1.5u1,5Xbuffer10u1，dNTP2.5u1，RNASE抑制剂1u1和DEPC水20nl,于42'C温育1h后将温度升至95'C灭活反转录酶，置于-2(TC保存备用。PCR反应反应总体积为10ul，其中猪cDNA模板0.5u1,双蒸水6.9ul，bufferlul，Mg2+0.6ul，10mM正向引物和反向引物各O.3ul，dNTP0.2ul，T叫酶0.2u1(1U/ul)。PCR反应条件为:94r预变性5min后，循环35次94'C变性30s、62t:退火30s、72。C延伸25s，最后72。C延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化使用小量DNA回收试剂盒(购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切卜含目的片段的凝胶，放入1.5mLEpendorff管中，按每IOOnglW凝胶加入700^L溶胶液的比例，加入溶胶液，于65'C温育至凝胶完全融化。将胶液上柱，体积过大可分几次上柱，9000rmp离心30s。倒掉收集管中液体，在吸附柱中加入50(HiL漂洗液，1200rmp离心30s，倒掉收集管中液体，重复此操作一次。将柱子1200rmp离心2min，除去乙醇。将吸附柱放入新的1.5mLEpendorff管中，往柱子中央加入30nL双蒸水，室温放置2分钟，1200rmp离心2min，得到回收产物。连接反应将纯化PCR产物与pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接反应总体积是5ul，其中包括SolutionI2.5ul，pMD18-T0.5ul，纯化PCR产物2ul，4'C过夜。感受态细胞的制备从37。C培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5a单菌落接种于2mlLB中，于37'C振荡培养3h，转接lml菌液于含有30mlLB的盐水瓶中，继续在37'C振荡培养约4h,待ODs。。达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取山，冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4'C4000rpm离心10min，弃去培养液，用lOml冰预冷的O.1mo1/1的CaCL重悬沉淀，冰浴30rain，重复4'C4000rpm离心10min，用4ml冰预冷的0.lmo1/1的CaCh重悬沉淀，置4'C保存备用。转化无菌状态下取100-120ul感受态细胞于1.5ml离心管中，将5ul的连接产物加入混匀，在冰上放置30rain,42。C热激90s,其间不要摇动离心管，取出后冰浴3-4min，加入400u1无抗生素的LB液体培养基，37。C振荡培养45min。取100u1涂布于已提前4h涂布了异丙基硫代-P半乳糖苷(IPTG)和X-gal的琼脂平板上，37'C平方夂1h后倒置培养。克隆测序是挑取单个阳性克隆子用于测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。(4)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件'将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的己知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。(一)PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列由于该A/G碱基突变未能引起限制性内切酶切割位点的改变，因此设计突变引物引入内切酶&^/7酶切位点(GTANTC),PCR扩增包含此突变位点的DNA序列(137bp),如序列表SEQIDN0:1所示，突变位点位于其112bp处。pol正向引物5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3'反向引物5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'该引物扩增片段长度为137bp。(2)PCR扩增条件PCR反应总体积lOu1，其中猪基因组DNA模板ln1，双蒸水7.lul，10Xbuffer1n1,lOraM正向引物和反向引物各0.3n1，dNTPO.2ul，Taq酶O.ltil(5U/ul)。PCR反应条件为:94'C预变性5min，94。C变性30s、54。C退火30s、72。C延伸15s,循环35次，72。C延伸5min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)RFLP检测PCR产物酶切反应体积是10u1,其中PCR产物5ul，双蒸水3.8ul，IXbufferTango限制性内切酶氾"/I为0.2ul(10U/lU)，将样品混匀后离心，37'C培养箱放置4h，用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。用引物扩增猪基因组DNA得到了137bp特异性扩增片段，该片段的第112位是1个A-G碱基转换，通过设计突变引物使得该突变位点能导致恥'fif/酶切位点(GTANTC)的变化，其中第112bp-113bp处为/fe/7^"/^多态性酶切位点。酶切产生三种基因型，AA基因型只有137bp—条带，GG基因型有112bp和25bp两条带，杂合子AG基因型有137bp，112bp和25bp的三条带。其中25bp片段太小在琼脂糖凝胶电泳中难以分辨，但不影响判型，如图7所述。实施例2:利用-RFLP(参见J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)检测了本申请人所在动物遗传育种实验室通城试验猪群，包括5个猪品种其中通城猪为中国地方猪血缘品种，长白猪、大白猪为外来猪血缘，长大通、大长通为中国地方猪与外来猪杂交的品种。该突变位点在不同血缘猪种中的基因型和基因频率如表l所示，结果显示浙///^基因各基因型在各猪种中均有分布，在通城猪、长白猪和长大通猪中G等位基因占优势，在大白猪和大长通猪中A等位基因占优势。表1不同血缘猪品种中浙ww基因沿Vj/1多态性的基因型和基因频率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>五个血缘猪品种间基因型频率的卡方检验结果如表2所示。xS检验表明，通城猪与K:白猪、大白猪及大长通猪之间存在极显著差异，与长大通猪之间存在显著差异；其他猪种间基因型频率差异不显著。表2不同血缘猪品种中ifo^^基因多态性基因频率的x2检验结果品种长白猪大白猪长大通猪大长通猪通城猪21.1752"27.3094"18,4172.40.4619"长白猪5.15822.069214.24265大白猪13.17831.50252长大通猪_12.3492注肩注'表述P<0.05:肩注"表述PO.01;df=8，x20.05(8)=15.50731，x20.01(8)=20.09024实施例3用Mw/^2基因检测了通城试验猪群159头猪，对MwiF2基因的该位点历^-RFLP多态检测的三种基因型与通城试验猪群部分生产性能进行了初步相关分析。所分析的性状有部分生长性状，部分胴体性状和部分肉质性状。对基因型资料用如下模型进行性状关联分析<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>Y,jkhn表示观测值，n表示均值，G,表示基因型效应，Bj表示组合效应，Sk表示性别效应，&表示父系效应，Eij!dm表示残差，假定服从N(0,Icj2)分布，分析软件为SPSS13.0软件。基因型检测结果表明在159个个体中AA基因型有26个，AG基因型有65个个体，GG基因型有68个。分析结果表明，该位点的基因型与胴体直长存在显著相关，AA型和GG型之间无显著差异，AG型胴体直长显著低于纯合基因型AA和GG型；_表3猪#"必^基因历7z/7酶切基因型与部分生产性状的关联分析检测_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><110>华中农业大学<120>—种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用<130><141>2008-10-29<藤1〈170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211>137<212>DNA<213〉猪(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..(137)<223><220><221>primer—bind<222〉(113)..(137)<223>〈220><221>primer—bind<222>(l)..咖<223><220><221〉mutation<222>(112)..(112)<223><400>1cccaaggctatcacactttacacagtgac8aaaagtggcaactggtctttgttgcagaatttctgaagC3tcgaaggcatUcagatgg3gaaaatagaacatggttatgagaeitatgsatcacttcacagtcaacc权利要求1、一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于在序列表SEQIDNO:l所述的的第112bp处有1个A112-G112的碱基突变，导致历/7/7-RFLP多态性。3、检测权利要求2所述的基因片段突变的引物对，所述引物对的正向引物为5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3';反向引物为5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'。4、制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤(1)以鼠M"及i^基因的mRNA为信息探针，做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分核苷酸序列，用该核苷酸序列与鼠cDNA序列比对，预测猪M"7F2cDNA序列，以该测的cDNA序列作模板设计引物，以成年中国地方猪品种通城猪的肌肉组织中总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得猪MWF2基因cDNA序列；(2)提取猪基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得猪M"及i^基因片段核苷酸序列，以该基因片段的核苷酸序列为模板设计突变引物，获得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。5、权利要求2所述的基因片段在猪标记辅助育种中的应用。全文摘要本发明属于家畜分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种作为猪分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段的克隆及应用。所述的分子标记由猪MuRF2基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，在序列表SEQIDNO1的第112位碱基处有一个A112-G112的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测的应用，为猪的标记辅助选择的关联分析提供了一个新的分子标记。文档编号C12N15/11GK101418298SQ20081019744公开日2009年4月29日申请日期2008年10月30日优先权日2008年10月30日发明者梅余,榜刘,徐学文,朱猛进,李新云,李长春,斌樊,鹤沈,赵书红申请人:华中农业大学