专利名称：：一种频率可控的gc特异性dna诱变方法
技术领域：
：本发明属于基闲工程领域，具体涉及一种人工诱变基因方法，与体外分子进化有关。
背景技术：
：体外分子进化技术即在实验室模拟自然进化的过程，人为的引入突变和重组，构建出多样性突变文库，配合适当的选择压，在短时间内定向选择出所需性质的突变酶。通过该技术，人们可以赋予天然酶不同的特性，使之更适合工农业生产的要求，如高活性、耐高温高压、极端pH等。对目标基因进行诱变，构建突变体库是该技术关键的一步。目前诱变的方法主要是易错PCR(error-pronePCR)，该方法基于TaqDNA聚合酶的低保真度或用M^+取代Mg^使酶保真度降低的特性，或使用碱基类似物在PCR过程中导致错配掺入错误的碱基，这些方法突变频率都局限在一个较低的范围内，且突变频率不易控制，突变谱主要倾向于AT向GC转换，这就大大限制了酶分子诱变的多样性和随机性，特别想得到在结构上发生较大变化的高活性酶或具有新功能的酶，往往需要多轮诱变。对于GC含量较高的基因(如来源于高等动植物、霉菌、链霉菌)，上述方法更是不适用。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种频率可控的GC特异性DNA诱变方法，即利用化学诱变剂对苯二酚和亚硫酸氢纳(NaHS03)将单链DNA分子中未被甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，结合PCR方法，建立起一种频率可控GC特异诱变方法，以解决目前酶体外定向进化方法中由于基W(特别是小片段和富含GC的基R)诱变频率低使应用受限的问题。通过该方法，可以将DNA分子中的GC碱基转换为AT，从而使富含GC的基因中GC含量降低，突变频率更高。并且根据不同需要，可以控制反应条件，得到不同突变频率的DNA分子。本发明通过以下方案实施通过用对苯二酚和亚硫酸氢纳处理基因片段，使其中的部分C脱氨基成U，得到含dUMP的杂合DNA分子；以该DNA分子为模板，进行PCR;使其中的U跟A配对，并使DNA分子中原来G的位置被A取代；在接下来的扩增中，A又跟T配对，使原来DNA中的C就被诱变成为T。从而使基因中的GC变为AT(如图6所示)。本发明的详细步骤包括1.对待诱变的基因片段用亚硫酸氢钠进行修饰1)先通过PCR扩增得到需要突变的基因片段，并用DNA回收kit得到纯化的片段2)将约5吗纯化的DNA片段于1.5mL离心管中用双蒸水稀释至50(_tL;3)加5.5nL新鲜配制的3MNaOH，42'C水浴30min;4)加30^新鲜配制的lOmM对苯二酚(氢醌)至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色)；5)加520nL新鲜配制的3.6M亚硫酸氢钠(pH5.0)至上述水浴后溶液中，轻柔颠倒混匀溶液；6)加200nL矿物油，防止水分蒸发，限制氧化，离心管外裹以铝箔纸，5(TC避光水浴不同时间。2.用PromegaWizardCleanupDNA纯化回收系统(购自Promega公司，货号A7280)回收修饰过的DNA1)将移液器枪头伸入矿物油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mL离心管中。2)向混合液中加lmLPromega'sWizardDNAClean-upresin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；3)将2mL注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2mL的离心管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。4)将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入lmL80X的异丙醇，插入针栓,轻轻加压，将异丙醇挤出。重复一次，此为洗涤步骤。5)将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5mL洁净离心管上，离心12000rpm,lmin，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。6)将小柱取下置于另一洁净1.5mL离心管上，加50nL预热好的双蒸水，室温放置2min。7)离心12000rpm，lmin，此为洗脱步骤,此时离心管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50&。8)加5.5pL新鲜配制的3MNaOH，室温放置15min。9)加33nL10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH至7.0左右。10)力口4pL10mg/mL糖原，作为沉淀指示剂；11)加27(HiL无水乙醇，置于-20'C,沉淀1小时。12)12000rpm离心，10min,倒去上清液，收集沉淀。13)力B500(iL70。/。乙醇，轻柔倾斜离心管，旋转一圈，再次离心，4'Cl2000rpm,5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。14)倒掉上清，室温干燥至沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入30nL双蒸水，溶解沉淀，所得为修饰后DNA溶液。3.以修饰后DNA为模板，进行PCR。反应体系如下10xPCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL修饰后的模板DNA5pLdNTP(10nM)1mL正向引物(10nM，根据目标分子设计)lpL反向引物(10^M，根据目标分子设计)l^LTaqDNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203'2.5U/|iL)l^L加双蒸水至50nL反应程序为94。C预热3分钟，94。C40秒，40°C40秒，72°C1分钟'IO个循环。如果扩增效果不好，也可尝试将程序改为94。C预热3分钟，94。C35秒，30°C+0.5'C/cycle40秒，72'C1分钟，15个循环。此处模板DNA浓度较低，所以需要至少加5^L。因为模板DNA被突变，可能导致与引物配对情况不好，所以需要降低退火温度使其更容易退火结合。具体延伸时间可根据基因大小调节。通过这一步骤，所得到的PCR产物即为部分GC被AT取代的突变DNA分子。4.构建突变表达文库纯化PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。DNA纯化过程采用Qiagen公司试剂盒(QIAEXIIGelextractionkit,Cat.NoJ0021)进行。纯化过程为用刀片在紫外灯下取出PCR产物谱带，放入1.5mL离心管，加入3倍体积的3MNal，置55"C保温10分钟使琼脂糖凝胶完全溶解，将混合物加至纯化柱，将柱放入2mL离心管，以8000rpm离心30秒，弃去流出液，加750&缓冲液PE洗柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，加50pL预热的双蒸水，以12000rpm离心2分钟，收集DNA流出液即为纯化的DNA溶液。DNA片段和载体酶切PCR产物和所需表达载体用限制性内切酶双酶解，酶解反应(50nL)含有5|iL10x双酶切缓冲液，30pLPCR产物或表达载体质粒，限制性内切酶各2pL，加水至终体积为50nL,在37°C下保温8-10小时。酶解产物纯化按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit，Cat.No.28104)及操作程序进行。具体过程是取150nLPB缓冲液(购自Qiagen公司)，与50^iL酶解产物混合，上纯化柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，再加750&PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000rpm离心1分钟，弃去流出液，最后，加50pL预热双蒸水，12000rpm离心l分钟，收集酶解的DNA片段和载体。连接20nL连接反应含有10x连接缓冲(购自takara公司)，2pL双酶切的载体，8pL酶切PCR产物，lpLT4DNA连接酶(购自takara公司)，加水至终体积20nL,16。C水浴5-8小时。转化取10pL连接混合物与100|iL大肠杆菌感受态细胞DH5a(购自NewEnglandBiolabs公司)混合，冰浴放置30分钟，42'C热激90秒，加800nL液体LB培养基(其中含1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl,pH7.0),37'C温育1小时。涂布含100ng/mL氨苄青霉素固体LB培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，1.5%琼脂粉，pH7.0)平皿，37卩培养12小时，获得突变表达文库的转化子。本发明的积极效果是DNA的突变频率可最高至5%左右，且可根据不同的需耍选择不同的诱变时间，达到不同的突变频率。其中卯。/。以上突变是GC向AT的转换，尤其使用于GC含量高的基因。该方法可用于体外分子进化技术。序列表SEQIDNO:1是本发明实施例所用的解淀粉芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的核苷酸和氨基酸序列图1:是本发明中对甘露聚糖酶基因不同诱变条件导致的突变核苷酸序列比对结果图2:是本发明中对甘露聚糖酶基因不同诱变条件导致的突变氨基酸序列比对结果图3:亚硫酸氢钠处理时间与DNA中GC碱基突变频率的关系图4:亚硫酸氢钠处理时间与DNA总突变频率的关系图5:亚硫酸氢钠处理时间与氨基酸突变频率的关系图6:是本发明方法导致GC向AT转换的原理图。具体实施方式实施例1利用本发明方法对解淀粉芽孢杆菌(5ac///za，/o/,Xadera)的甘露聚糖酶(mannanase)基因进行不同时间诱变的结果以从解淀粉芽孢杆菌克隆的甘露聚糖酶(具体序列见序列表SEQIDNO:l所示)作为目标，用本发明方法进行诱变，并对突变频率和结果进行统计归纳，得出诱变频率与亚硫酸氢钠修饰条件的规律。具体操作如下1.纯化的甘露聚糖酶基因片段的制备以甘露聚糖酶克隆载体pGEX-man为模板，PCR扩增得到甘露聚糖酶基因片段。PCR反应体系为10xPCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pLpGEX-manlpLdNTP(10nM)lpL正向引物(10nM，5'-GCCGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAGTCTG)lpL反向引物OO)xM，5'-CAGCTCGAGTTTTGAACGGTAACAATATGCC)lpLTaqDNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/nL)lpL加双蒸水至50pL扩增条件为94'C3分钟；94'C40秒；53'C30秒；72。Cl分钟；30个循环。PCR产物纯化按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit,Cat.No.28104)及操作程序进行。具体过程是取600nLPB缓冲液(购自Qiagen公司)，与200pL酶解产物混合，上纯化柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，再加750^iLPE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000rpm离心1分钟，弃去流出液，最后，加150nL预热双蒸水，用12000rpm离心1分钟，所得即为纯的甘露聚糖酶基因片段。DNA浓度测定取纯化后的DNA10nL，用双蒸水稀释至lmL，在260nm条件下测光吸收，得到OD260为0.4480，用公式DNA(mg/mL)二50xOD260x稀释倍数/1000计算得到DNA浓度为2.24mg/mL。2.甘露聚糖酶基因的亚硫酸氢钠修饰取2.5nL纯化好的甘露聚糖酶基因片段，按前述方法步骤进行修饰和纯化。亚硫酸氢钠处理时间分别为1小时、2小时、4小时、8小时、16小时5个梯度。3.对修饰后的基因进行扩增诱变PCR体系如下10xPCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL修饰后的模板DNA5nLdNTP(10|iM)叫正向引物(10pM，5，-GCCGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAGTCTG)lpL反向引物(10|aM，5，-CAGCTCGAGTTTTGAACGGTAACAATATGCC)lpLTaqDNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/^L)l(iL加双蒸水至50nL反应程序为94'C预热3分钟，94-C40秒，40'C40秒，72°C1分钟，IO个循环。4.甘露聚糖酶基因突变体库的构建纯化PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。DNA纯化过程采用Qiagen公司试剂盒(Q1AEXIIGelextractionkit,Cat.No.20021)进行。纯化过程为用刀片在紫外灯下取出PCR产物谱带，放入1.5mL离心管，加入3倍体积的3MNal，置55。C保温IO分钟使琼脂糖凝胶完全溶解，将混合物加至纯化柱，将柱放入2mL离心管，以8000卬m离心30秒，弃去流出液，加750pL缓冲液PE洗柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，加50nL预热的双蒸水，以12000rpm离心2分钟，收集DNA流出液即为纯化的DNA溶液。DNA片段和载体酶切PCR产物和表达载体pGEX-6p-l(购自通用电气医疗集团(GEHealthcare))用限制性内切酶5a附HI和Wol(购自takara公司)双酶切，酶切体系(50nL)含有5pL10xKbuffer(购自takara公司)，30nLPCR产物或质粒pGEX-6p-l，限制性内切酶各2^,加水至终体积为50^L，在37。C下保温8-10小时。酶解产物纯化按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit,Cat.No.28104)及操作程序进行。具体过程是取150nLPB缓冲液(购自Qiagen公司)，与50pL酶解产物混合，上纯化柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，再加750pLPE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000rpm离心1分钟，弃去流出液，最后加50nL预热双蒸水，12000rpm离心1分钟，收集酶切的DNA片段和载体。连接后转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(购自NewEnglandBiolabs公司)，所长出的转化子即为甘露聚糖酶突变株。5.突变子的序列分析转化子质粒制备从5种梯度的随机突变文库中各挑取10个转化子接种到含10(Vg/mL氨苄青霉素LB液体培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCl，pH7.0)中37'C培养过夜，取1.5mL菌液于灭菌离心管中，12000ipm离心lmin,弃上清液，收集菌体。加入100nLSolutionI(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0),RNaseA100jxg/mL)充分混匀，然后加入200iaLSolutionII(0.2MNaOH,1%SDS)轻轻混匀，室温静置3-5min，最后加入150pLSolutionIII(3M醋酸钾，5M冰醋酸)快速混匀，12000rpm离心5分钟，收集上清；加入等体积的酚氯仿异戊醇(25:24:1)，混匀，室温放置5-10min，12000rpm离心5min;再次收集上清，加2/3倍体积的异丙醇混匀后12000rpm离心5分钟沉淀DNA;弃上清，沉淀用70°/0乙醇洗l次；置于室温干燥后，溶于50nL双蒸水中，置-2(TC保存备用。序列分析以pGEX载体5'通用引物(GGCAAGCCACGTTTGGTG)为测序引物，以突变的重组质粒为模板，由北京华大生物公司测序。核苷酸和翻译后的氨基酸序列比对结果如图1和2。可以看到随着亚硫酸氢钠修饰时间的加长，突变率逐渐增加。每条序列统计930个碱基，每个梯度统计10条共93000个碱基，具体修饰时间与DNA中GC突变率、总突变率及氨基酸突变率的关系见表1和图3，4，5所示。表1亚硫酸氢钠处理时间与DNA突变频率统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2用本发明方法对TEM-1型p-内酰胺酶进行诱变改变其底物特异性p-内酰胺酶是一类能特异水解p-内酰胺类抗生素如青霉素、头孢菌素等的酶。TEM-1型)3-内酰胺酶是第一个被人们认识的p-内酰胺酶，也是革兰阴性菌中最常见的p-内酰胺酶，是细菌耐p-内酰胺类抗生素最原始的机制之一。分子生物学实验中常用的具有氨苄青霉素抗性的载体中所用的几乎都是TEM-1型p-内酰胺酶基因。对氨苄青霉素和其他第一代头孢菌素敏感，但对第三代头孢菌素如头孢他啶、头孢噻肟等没有水解作用。为了验证本发明方法的可行性与实用性，我们选择来自pGEX系列载体上的TEM-1型p-内酰胺酶基因ted乍为目标，用本发明方法进行体外诱变，以期改变其底物特异性，从中筛选具有水解头孢他啶活性的突变酶。1.a/fl基因及其启动子序列的克隆PCR扩增pGEX-6p-l上的W"基因及其启动子序列pcr体系如下10xPCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL模板质粒pGEX-6p-l(购自通用电气医疗集团(GEHealthcare))lpLdNTP(10(iM)1HL正向引物(10nM,5，-GACGGATCCCAGTCACGTAGCGATAG)lpL反向引物(10nM,5，-GACAAGCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGG)l^LTaqDNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/tiL)l^L加双蒸水至50mL反应程序为94'C预热3分钟，94'C40秒，53。C40秒，72。C1分钟，30个循环。纯化PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。DNA纯化过程采用Qiagen公司试剂盒(QIAEXIIGelextractionkit,Cat,No.20021)进行。纯化过程为用刀片在紫外灯下取出PCR产物谱带，放入1.5mL离心管，加入3倍体积的3MNal，置55。C保温10分钟使琼脂糖凝胶完全溶解，将混合物加至纯化柱，将柱放入2mL离心管，以8000rpm离心30秒，弃去流出液；加750pL缓冲液PE洗柱，以12000rpm离心1分钟，弃去流出液，加50^L预热的双蒸水，以12000rpm离心2分钟，收集DNA流出液即为纯化的DNA溶液。DNA片段和载体酶切PCR产物和表达载体pET28a(购自Novagen公司)用限制性内切酶5awHI和(购自takara公司)双酶切，酶切反应(50pL)含有5pL10xKbuffer(购自takara公司)，30pLPCR产物或质粒pET28a，限制性内切酶各2nL，加水至终体积为50^，在3TC下保温8-10小时。将双酶切后的载体和片段纯化后连接，转化，涂布含100ng/mL氨苄青霉素LB平板'经质粒抽提验证后得到正确克隆。2.Mi基因的突变体库的构建对上轮扩出的Wa基因片段前述方法进行，用亚硫酸氢钠处理2小时，纯化后进行PCR扩增，克隆至制备好的载体pET28a上，转化涂布至含有2pg/mL的头孢他啶的LB培养基(1。/。胰蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCI，1.5%琼脂粉，pH7.0)平皿，能在头孢他啶平皿上生长出来的即为能水解头孢他啶的突变的p-内酰胺酶。3.突变的6to基因序列分析以pET28a载体通用的T7Terminator引物(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)为测序引物，以突变的重组质粒为模板，由北京华大生物公司测序。突变株的核苷酸和氨基酸突变情况见表2。可以看到突变中绝大部分是GC向AT突变，与预期情况相符。表2突变的W"基因序列分析突变株氨基酸突变核苷酸突变MlR164CC484TM2D179NG114A,G529AM3E104K，L162FG304A,C478TM4E147K，D179N,G218ET408C，G433A,G495A,G529A，G606A，G627AM5D179NG529AM6R164HG417A,G485A,C678T,M7R164H，G196NG485A,G580A,G581A，注红色表示无义突变，没有引起氨基酸突变。_序列表〈110〉华中农业大学<120〉一种频率可控的GC特异性DNA诱变方法<130〉<141〉2008-11-10<160〉2<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211〉腦〈212〉DNA<213〉解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)<220〉<221〉gene<222〉(l)..(腦)<223〉<220><221〉CDS<222〉(1)..(1083)<223>〈400〉1atgcttaaaaagttagcagtctgtctgtctateattttattaetcate48MetLeuLysLysLeuAlaValCysLeuSerlielieLeuLeuLeulie151015teagccgcccgtccgatateggetcacaccgtttaccctgtcaatccc96SerAlaAlaArgProlieSerAlaHisThrValTyrProValAsnPro202530satgcccsgcsgscgaceia肌gscgtcatg幼ctggctggcgcatttg144AsnAlaGinGinThrThrLysAspValMetAsnTrpLeuAlaHisLeu354045cccaaccgtteagaaaacagggtcatgtecggtgcattcggcgggtac192ProAsnArgSerGluAsnArgValMetSerGlyAlaPheGlyGlyTyr505560agegatgtcacettttea3tgax;ggaggaaaaccgcttgaaeiaacgcg240SerAspValThrPheSerMetThrGluGluAsnArgLeuLysAsnAla65707580acgggacagtctcccgccatetacggctgtgattatgggagagggtgg288ThrGlyGinSerProAlalieTyrGlyCysAspTyrGlyArgGlyTrp859095ctggaaac8teggatateaccgattctategactacagetgcaacage336LeuGluThrSerAsplieThrAspSerlieAspTyrSerCysAsnSer100105110ageetcatttegtactggaaaageggcggcetccctcaggtcagectg384SerLeulieSerTyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGinValSerLeu115120125catetcgcaaatccggcctttccateaggacactataaaacggccatt432HisLeuAlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyrLysThrAlalie130135140tea肌cagecagtataaaaatatectgaaccctteaactgttg肪gga480SerAsnSerGinTyrLysAsnlieLeuAsnProSerThrValGluGly145150155160eggeggcttgaggccttgetcageaaaategccgacggccttactcag528ArgArgLeuGluAlaLeuLeuSerLyslieAlaAspGlyLeuThrGin165170175ctgaaaaatcaaggcgtcaccgttctgttcaggccgctgcatgagatg576LeuLysAsnGinGlyValThrValLeuPheArgProLeuHisGluMet180185190sacggtgaatggttctggtgggggctgacsggctacaax;c肌aaagac624AsnGlyGluTrpPheTrpTrpGlyLeuThrGlyTyrAsnGinLysAsp195200205actgagagaatetegctgtacaaagagctttacaagaagatataccgc672ThrGluArglieSerLeuTyrLysGluLeuTyrLysLyslieTyrArg210215220t3tatgaceigagacaaga_ggattgga^taatcttttgtgggtgtetteg720TyrMetThrGluThrArgGlyLeuAspAsnLeuLeuTrpValTyrSer225230235240cctgatgccaacagagacttcaaaacagacttctacccaggcteatct768ProAspAlaAsnArgAspPheLysThrAspPheTyrProGlySerSer245250255tatgtggatattaccggactggatgettacttcaccgacccgtatgcg816TyrValAsplieThrGlyLeuAspAlaTyrPheThrAspProTyrAla260265270atateaggctatgatgaaatgctgtctctgaaaaaaccgtttgccttt864lieSerGlyTyrAspGluMetLeuSerLeuLysLysProPheAlaPhe275.280285gccgagaccggtccgtecggtaatateggaagetttgattacgetgtt912AlaGluThrGlyProSerGlyAsnlieGlySerPheAspTyrAlaVal290295300tttateaatgcgateaggcaaaagtatcccgagacaacctactttttg960PhelieAsnAlalieArgGinLysTyrProGluThrThrTyrPheLeu305310315320seatgggatgasc肪ttaageccggcagccaatc肪ggcgcgcaaage1008ThrTrpAspGluGinLeuSerProAlaAlaAsnGinGlyAlaGinSer325330335ctttatc犯aacagetggacgctg肪caagggcgaaatgtggaatggc1056LeuTyrGinAsnSerTrpThrLeuAsnLysGlyGluMetTrpAsnGly340345350ggaaccttgacgccgategcggaataa1083GlyThrLeuThrProlieAlaGlu355360〈210〉2<211>360<212>PRT〈213〉解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)<400>2MetLeuLysLysLeuAlaValCysLeuSerlielieLeuLeuLeulie151015SerAlaAlaArgProlieSerAlaHisThrValTyrProValAsnPro202530AsnAlaGinGinThrThrLysAspValMetAsnTrpLeuAlaHisLeuGin35ProAsnArgSerGluAsn50A印ValThrPheAsp40ValMetSerGlySer65ThrGlyGinSerLeuGluThrSer100SerArg55MetThrGluGluLeu45PheGlyGlyTyrSer70AlalieTyrGlyCysA印TyrGlyArgAsn75AspAla60ArgLeuLysProAlalieTyrGlyCys8590AsplieThrAspSerlieAspTyrSerAsnAla80GlyTrp95AsnSerSerlieAspTyrSerCys105110TyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGinValSerLeuSerUulieSerTyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGin115120125AlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyrLysThrAlalieHisLeuAlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyr130135140SerAsnSerGinTyrLysAsnlieLeuAsnProSerThrValGluGly145ArgArgLeuGlu150AlaLeuLeuSerLys165GlyValThrValLeuLysAsnGin180AsnGlyGluTrpPheTrpTrp195ArglieSerLeu155160lieAlaAspGlyLeuThrGin170175PheArgProLeuHisGluMetThrGlu210TyrMetThrGluThr225ProAspAlaAsnLeu185GlyLeuThrGlyTyr200LysGluLeuTyrTyr215ArgGlyLeuAspAsn230AspPheLysThrHis190AsnGinLysAsp205LyslieTyrArgArg245TyrValAsplieThrGlyLeuAsp260TyrAspGluMetLys220LeuLeuTrpValTyr235PheTyrProGlylieSerGly275ThrGlyProSerAsp250AlaTyrPheThrAsp265SerLeuLysLysSer255TyrSer240SerAlaAlaGlu290PhelieAsnAlalie305ThrTrpAspGluLeu280GlyAsnlieGlySer295GinLysTyrProPro270PheAlaPheArg310LeuSerProAlaPro285PheAspTyrAlaVal300ThrThrTyrPheGin325LeuTyrGinAsnSerTrpThrLeu340ThrProlieAlaAsn345Glu315AlaAsnGinGlyAlaGin330335LysGlyGluMetTrpAsn350Leu320SerGlyGlyThrLeu355Glu360权利要求1、一种频率可控的GC特异性DNA诱变方法，其特征在于，包括以下步骤用氢氧化钠使纯化的DNA变性，加入化学诱变剂对苯二酚和亚硫酸氢纳使其中的C脱氨基变成U，再通过PCR方法，使U与A配对，导致DNA中的GC向AT转换，从而达到诱变效果。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入化学诱变剂处理过程中，需加入矿物油防止氧化。3、权利要求l所述的方法，其特征在于，PCR过程中，退火温度需要适当降低。全文摘要本发明属于基因工程
技术领域：
。具体涉及一种频率可控的GC特异性DNA诱变方法。先用氢氧化钠将待诱变基因变性为单链，再用对苯二酚和亚硫酸氢钠处理，使DNA链中的C脱氨基成为U；以修饰过的DNA为模板，PCR扩增使U跟A配对，后续扩增中，A继续与T配对，从而使原始DNA链中的GC向AT方向转换，获得突变DNA分子；将突变的DNA分子装载到表达载体，即可构建成DNA分子突变文库。随着亚硫酸氢钠处理时间的延长，DNA的最终突变频率也逐渐增大，最终可得突变频率达5％左右的DNA，从而克服一些常规随机诱变方法中诱变频率过低的问题。本发明是针对DNA分子中的GC碱基，GC突变占总突变率的90％以上，尤其适用于富含GC基因的诱变。本发明可用于DNA分子体外改良。文档编号C12N15/10GK101402953SQ20081019756公开日2009年4月8日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者刘子铎,林拥军,柳鹏福,洪玉枝申请人:华中农业大学