专利名称：：血液hbv、hcv、hiv-1集成检测dna微阵列芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人类血液中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒l型(HIV-1)集成高通量检测DNA微阵列芯片。本发明采用固相载体基片，针对HBV、HCV、HIV-1病毒基因设计的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本中三种病毒，主要应用于血液、血制品病毒核酸筛査。
背景技术：
：确保血液及血液制品的安全，最大限度地降低经血传播病毒的危险，一直是世界各国关注的问题。随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性己大大降低，但由于病毒感染者"窗口期"献血、病毒变异、低病毒载量感染等因素,使得临床输血安全依然存在一定风险。与原有的免疫学检测技术相比，核酸检测技术(NAT)可直接检测病毒核酸,能大大縮短病毒"窗口期"，极大提高血液的安全性，已在国内外广泛应用于血液常规筛查。自1971年开始HBsAg作为常规筛査项目引入到血液筛查中，使得输血后感染乙肝的发生率大大降低，酶免疫检测(ELISA)技术已经广泛应用于血液筛査，检测HBs-Ag的灵敏度已由最初30-50ng/ml到现在的0.5—1.0ng/ml，有的试剂甚至达到0.1ng/ml以下，但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1/6.3万，这些危险主来自HBV"窗口期"、病毒变异、低病毒载量感染等。ELISA法筛查并不能从根本上排除病毒存在的危险，由于HBV感染后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中，在约50d的"窗口期"里，感染者HBsAg检测阴性，但病毒已经存在于血液中。HBV、HIV-1的情况与HBV具有相似的情况。核酸检测技术的应用可以大幅度縮短检测的窗口期，大大提高血液安全性。欧美国家的经验表明，核酸检测应用于血液筛査能够有效縮短HCV抗体检测窗口期72%，縮短HIV-1抗体检测窗口期50%。日本也报道使用HBV核酸检测筛査可以进一步减少HBsAg的漏检。1993年，Chiron公司的TMA技术和Roch公司的AmpliScreen技术在美国FDA获批用于血液筛査；1999年欧洲规定所有的血浆制品生产均应进行HCVPCR检测；2001年日本和法国将NAT技术应用于血筛。我国卫生行政部门也规定，2003年1月1曰以后，所有血浆制品的原料在投产前，必须进行NAT检测。输血和血制品HBV、HCV、HIV-1核酸筛查检测也正在广泛推广。对于血液筛査核酸检测技术和试剂，目前我国卫生行政部门在国内组织尝试荧光PCR检测方法，基本筛査方式是采用Pooling法，即12或者24个样本混合，作为一个样本检测，有阳性结果时，再分别逐个检测混合样本中各个单样本，从而溯源到阳性样本。这个方法要求所用的核酸提取和荧光PCR检测试剂具有高度灵敏度。但是，目前国内外最先进的核酸提取和荧光PCR试剂都很难达到要求；如果不采用Pooling法，直接检测每一份样本，检测通量之低和试剂成本之高又是无法接受的！如何解决这个问题？DNA微阵列技术是本世纪90年代以来发展起来的新型筛査检测技术，该技术具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析。该技术应用于血液筛查将很好地解决灵敏度和通量之间的矛盾，可以在非Pooling情况下，一次检测数十个样本，是血液筛査的良好检测技术。
发明内容本发明所解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的DNA微阵列芯片，可以一次同时对数十例血液或血制品样本中HBV、HCV、HIV-1病毒进行检测，适合血液和血制品病毒筛査。因此，本发明的目的是制备一种血液HBV、HCV、HIV-1集成检测DNA微阵列芯片，以满足大规模血液和血制品中病毒筛査检测的需要。为此，本发明采用以下技术方案采用固相载体基片，针对HBV、HCV、HIV-1核酸设计特异寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以特殊PCR系统，使得每张芯片可以一次性同时检测数十个样本中三种病毒。根据本发明一个优选的实施方案，针对HBV、HCV、HIV-1核酸保守序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(见表l)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制40个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测38个样本和2个参照品。根据本发明另一个优选的实施方案，在上述的DNA微阵列芯片的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(见表2)，即组成完整的产品。RT-PCR反应采用单管多重扩增，实际检测时，取38份人血液或者血制品提取的基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称RT-PCR方法，扩增出可能存在的病毒基因组CY3标记靶标片段。取DNA微阵列芯片一张，在38个杂交区分别加入38种PCR产物2ul和杂交液8ul，同时在阳性和阴性参照区加入参照产物溶液，将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度优选为45'C，杂交时间优选30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本检测结果。根据本发明另一个优选的实施方案，DNA微阵列芯片的片基载体可以是玻片、尼龙膜或其它可以附着探针的载体。表l寡核苷酸探针序列以及所检测的病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>图1血液HBV、HCV、HIV-1集成检测DNA微阵列芯片1芯片整体外观(示意图)2杂交区以及探针微阵列(示意图)图2HBV阳性扫描图(示意图)图3HCV阳性扫描图(示意图)图4HIV-1阳性扫描图(示意图)图5HCV、HIV-1混合阳性扫描图(示意图)图6HBV、HCV、HIV-1阴性扫描图(示意图)图7HBV、HCV、HIV-1阳性对照区扫描图(示意图)图8HBV、HCV、HIV-1阴性对照区扫描图(示意图)具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1:HBV、HCV、HIV-1病毒基因特异引物和探针的设计HBV在5'UTR区设计特异探针一条和特异性引物一对；HCV针对5'NCR区设计涵盖4个基因型，6个亚型的探针共6条。六条探针按照等比浓度混合后点制芯片；HCV在5'NCR区设计两对PCR引物，外引物序列正义5'-TGTGAGGAACTTCTGTCTTC-3'，反义5'-CATGATGCACGGTCTACGA-3';内引物序列正义5'-GCCATGGCGTTAGTACGA-3'，反义5'-TCGCAAGCACCCTATCAGG-3'。内引物CY3荧光标记。HIV-1在较为保守的gag区，设计探针一条，序列为5'-AGTAAGAATGTATACCCCT-3';设计引物一对，序列为上游5'-AACCACCTATCCCAGTAGGATAA-3'，下游5,-GGTCCTTGTCTTATGTCCAGMT-3',下游引物CY3荧光标记。以上所有引物放入一管RT-PCR反应体系中。实施例2:使用本发明产品检测38份血液样本取38份临床血液样本和阴性、阳性参照品，采用本发明产品进行检测和筛査。使用商品化提取试剂盒，同时提取DNA和RNA病毒核酸，进行RT-PCR反应。7使用商品化RT-PCR反应试剂盒，按照说明书进行RT-PCR反应。取反应产物进行DNA微阵列杂交反应取一张微阵列芯片，分别取38个样本和2个参照品PCR或RT-PCR产物各2ul加到芯片对应的杂交区，再在各孔加入杂交液(5XSSC)5ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度5(TC，杂交时间40分钟。杂交后自动洗涤和风干。采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的阴阳性结果。检测结果见表3。同时对受检样本进行DNA测序，作为参照。实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测38个样本，可以同时检测三种病毒)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与样本测序结果完全相符)。表3本次检测结果与样本测序结果的比较样本编号测序结果本次试验结果是否相符HBVHCVHIV-1HBVHCVHIV--101—是02———是03———是04一是05———一是06———是07——是08++—++是09-———是10+—++_+是11—是12+——+_是13—是14—+—+是15+——+是16——是17+——+——是18------是19------是20--+--+是21-+--+-是22——————是23------是24------是25--+-_+是26------是27+--+_-是28+_-+--是29+-++-+是30------是31------是32------是33-+_-+-是34------是35------是36------是37----是38++-++-是阴性参照------是阳性参照++++++是序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>血液HBV、HCV、H1V-1集成检测DNA微阵列芯片<140><141><160>16<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>1ctagtttactagtgccat<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>2gagtagtgttgggtcgcg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>3cgccagcggcgtcttcac<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>4魄gcggtcagatcgttg<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>5aaagcgtctagccatggc<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>6aaaggccttgtggtactg<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>7acgtiaagttcccggg<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。<400>8agtaagaatgtatagccct<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。<400>9ctgtattcccatcccatca<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR弓I物。<400>10caagatgttgtacagacttg<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR弓I物。<400>11tgtgaggaacttctgtcttc<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR弓I物。<400>12catgatgcacggtctacga<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。<400>13gccatggcgttagtacga<210>14<2]1>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR弓I物。<400>14tcgcaagcaccctatcagg<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。<400>15aaccacctatcccagtaggataa<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。<400>16ggtccttgtcttatgtccagaat权利要求1、一种DNA微阵列芯片，采用DNA微阵列芯片技术，对人类血液中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)进行集成高通量检测筛查，其特征在于将HBV、HCV、HIV-1特异性寡核苷酸探针，点制在载体上，并分成40个区，制成DNA微阵列芯片，再配以PCR引物以及其它组分，组成完整的试剂盒。2、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于其中扩增HBV、HCV、HIV-1基因的特异性PCR引物共8条，引物序列分别是PR-B15，-CTAGTTTACTAGTGCCAT-3'PR-C15,-GAGTAGTGTTGGGTCGCG-3,PR-C25,-CGCCAGCGGCGTCTTCAC-3，PR-C35,-GTGGCGGTCAGATCGTTG.-3，PR-C45，-AAAGCGTCTAGCCATGGC--3，PR-C55，-AAAGGCCTTGTGGTACTG--3，PR-C65，-ACGTIAAGTTCCCGGG陽3'PR-V5,_AGTAAGAATGTATAGCCCT-3,。3、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于其中采用8条寡核苷酸探针，分40个区点制在载体上，制成DNA微阵列，用于与样本PCR产物的杂交反应，8条寡核苷酸探针的序列分别是PB-15，-CTGTATTCCCATCCCATCA-3'PB-25，-CAAGATGTTGTACAGACTTG-3'PC-15，-TGTGAGGAACTTCTGTCTTC-3'PC-25，-CATGATGCACGGTCTACGA-3'PC-35,-GCCATGGCGTTAGTACGA-3'PC-45，-TCGCAAGCACCCTATCAGG-3'PV-15，-AACCACCTATCCCAGTAGGATAAPV-25，曙GGTCCTTGTCTTATGTCCAGAAT4、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于其中寡核苷酸探针点样的载体可以是玻片、尼龙膜或者其它可以固着探针的载体。5、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征是还在于主要应用于血液、血制品病毒核酸筛査。全文摘要本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人类血液中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)集成高通量检测DNA微阵列芯片。本发明采用固相载体基片，针对HBV、HCV、HIV-1病毒基因设计的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以PCR引物以及其它组分，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本中三种病毒，主要应用于血液、血制品病毒核酸筛查。文档编号C12Q1/70GK101660003SQ20081019801公开日2010年3月3日申请日期2008年8月27日优先权日2008年8月27日发明者何蕴韶,帆张,明李,胡守旺申请人:中山大学达安基因股份有限公司