人鼻咽癌辐射耐受细胞株的建立及机制初探的制作方法

专利名称：：人鼻咽癌辐射耐受细胞株的建立及机制初探的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人鼻咽癌辐射耐受细胞株的建立及机制初探，选择人鼻咽癌细胞株CNE2作为亲本细胞，选用爬坡式大剂量X线诱导照射，以反复大剂量冲击方式间歇照射，建立了辐射耐受NPC细胞株CNE2R及其生物学鉴定。
背景技术：
：鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区的高发性恶性肿瘤，是一种上皮源性的恶性肿瘤，高发于广东地区，其发病率在全世界范围内都是最高的，具有明显的地域和种族差异，这引起了国内外学者的研究兴趣，其病因发病学目前还不清楚，国内外学者试图通过新的技术和理论对其病理及治疗进行研究。目前研究鼻咽癌的辐射抗拒多用不同细胞或组织作为模型，这无法避免遗传背景差异和肿瘤组织异质性等对结果的影响，同时，有关NPC辐射抗拒机制至今仍未完全阐明，目前已有研究证实多个基因及蛋白与NPC的放射敏感性相关，但各作者就某选定指标研究其与辐射抗拒的相关性，所得结果相对局限和片面，目前尚未见到采用高通量筛选方法，从cDNA，蛋白和microRNA水平全方位审视同遗传背景辐射抗拒机制全貌的相关报道。
发明内容本发明的目的是用人鼻咽癌细胞株CNE2作为亲本细胞，选用爬坡式大剂量X线诱导照射，以反复大剂量冲击方式间歇照射，建立了辐射耐受NPC细胞株CNE2R及其生物学鉴定，建立同起源和遗传背景而不同辐射敏感性的细胞对比模型(CNE2R与CNE2)，从cDNA，蛋白，和microRNA水平筛查CNE2R与CNE2的差异，这对于揭示NPC辐射抗拒发生的本质，挖掘评价辐射抗拒的灵敏指标，并寻找和确立辐射抗拒的新靶点，从而找到有效预防和逆转NPC辐射抗拒新疗法的目的，具有至关重要的意义。本
发明内容主要包括1、爬坡式大剂量X线诱导辐射耐受NPC细胞株CNE2R初次剂量为200Gy,照射3次,后依次400Gy，600Gy各照射3次，每次照射后58周待存活的后代细胞状态稳定后进行下一次照射，整个照射及培养过程历时1年。2、MTT法、平板克隆形成法及血清饥饿细胞周期同步化方法描绘细胞株CNE2R和CNE2的生长曲线，分别计算两者的倍增时间，测定不同照射剂量下的存活分数，线性二次模型拟和剂量存活曲线并求出放射生物学参数ou卩和2Gy存活分数(SF2)。3、染色体核型分析和STR分型分析染色体核型分析探讨细胞株CNE2R与CNE2染色体的差异，STR分型探讨CNE2R与CNE2两者之间染色体非编码区STR基因座的差异。4、基因芯片技术及DIGE技术分别从基因水平和蛋白质水平探讨细胞株CNE2R与CNE2差异表达的机制。本发明的技术方案是1.人鼻咽癌辐射耐受细胞株的建立选用爬坡式大剂量X线诱导照射，建立同起源和同遗传背景的辐射耐受NPC细胞株CNE2R,按以下步骤进行(1)射线选用X线；(2)剂量采用X线剂量分别为200Gy、400Gy、600Gy作爬坡式大剂量X线诱导；(3)亲代细胞培养人鼻咽癌细胞株CNE2细胞生长于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液屮，置于5%032、37'C培养箱屮培养；(4)人鼻咽癌辐射耐受细胞株诱导取处于对数生长期CNE2细胞，0.25%的胰酶消化后计数，以1.0xl0Vcm2细胞种植培养瓶，种植完毕用封口膜封好培养瓶口，采用北京医用X线机厂生产的深部X线机，照射条件为电压210kV、电流12mA,滤过板为0.25Qi、照射野大小为10cmxl5cm,焦皮距为40cm,剂量率为101.38cGy/min,半价层为0.52Cu进行照射，照射后的细胞置于37t:,5%C02培养箱中培养，每24h换液一次，待细胞状态稳定后再进行第二次冲击，如此反复作用，200Gy、400Gy、600Gy各冲击照射3次，共9次，历时1年建成人鼻咽癌辐射耐受细胞株CNE2R。2.人鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，所述的菌株是用上述方法建立、培养的CNE2R细胞株，对CNE2R细胞株进行机制初探。(1)CNE2R细胞株生长速度较原细胞株CNE2慢，且在进入指数增长期之前的潜伏期更长，CNE2R细胞的倍增时间是21.7h,其倍增时间较敏感细胞延长；CNE2R细胞2Gy照射下的存活分数(SF2)为0.574，其存活分数较敏感细胞延长；CNE2R处于S期的细胞比例(26.3%)要高于敏感细胞，而CNE2R处于G2期的细胞比例(8.4%)则明显少于敏感细胞细胞处于G2期的细胞；(2)CNE2R细胞株的正常染色体数目为52，较CNE2细胞的正常染色体数目多；(3)CNE2R细胞株的STR基因座D8S1179的表达与敏感细胞有质的差异，CNE2R的STR基因座D13S317和TH01的表达与敏感细胞有量的差异；(4)CNE2R细胞株与敏感细胞相比，两个细胞株中共同表达差异的基因共有855个，其中共同表达变化上调的基因有538个，共同表达变化下调的基因有317个；(5)CNE2R细胞株与敏感细胞相比，蛋白质组差异表达存在差异的点有16个，其中上调10个，下调6个；(6)CNE2R细胞株与敏感细胞相比，719个microRNA中差异表达存的有66个，其中上调37个，下调29个。附图图1CNE2R及CNE2的生长曲线比较；图2CNE2R与CNE2剂量存活曲线；图3CNE2R与CNE2细胞周期同步化前后及去同步化24h后的细胞周期变化；图4细胞周期同步化前后及解除同步化后的细胞周期比例变化；图5CNE2R与CNE2染色体核型分析结果(箭头所指为8号染色体)；图6CNE2R与CNE2染色体核型分析结果(箭头所指为13号染色体)；图7CNE2R和CNE2细胞基因座D8S1179的差异表达；图8CNE2R和CNE2细胞基因座D13S317的差异表达；图9CNE2R和CNE2细胞基因座TH01的差异表达；图10CNE2和CNE2R细胞内总RNA提取产物的电泳鉴定；图11CNE2/CNE2R基因表达散点图12CNE2R及CNE2细胞2D-DIGE检测出的差异点在凝胶上的分布。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例辐射抗拒鼻咽癌细胞株的构建及其放射生物学活性的鉴定选择人鼻咽癌细胞株CNE2作为亲本细胞，选用爬坡式大剂量X线诱导照射，以反复大剂量冲击方式间歇照射，建立了辐射耐受NPC细胞株CNE2R;采用MTT法检测CNE2R及CNE2细胞生长的倍增时间，平板集落形成法和线性二次模型(L-Q模型)拟合CNE2R及CNE2细胞的存活曲线并计算相关放射生物学参数和SF2值。血清饥饿细胞周期同步化方法检测CNE2R及CNE2细胞的细胞周期变化。1.1构建辐射抗拒鼻咽癌细胞株CNE2R实验步骤取处于对数生长期、生长状态良好的CNE2细胞，用pH7.4的PBS溶液洗2次,0.25%的胰酶消化2min,弃去胰酶，加入适量含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，吹打均匀，使其分散成单细胞悬液。1.细胞计数板计数确定细胞浓度，种植细胞密度为1.0x104/cm2培养瓶，种植完毕用封口膜封好培养瓶口进行照射。细胞照射采用北京医用X线机厂生产的深部X线机，照射条件为电压210kV、电流12mA，滤过板为0.25Cu、照射野大小为10cmxl5cm，焦皮距为40cm，剂量率为101.38cGy/min,半价层为0.52Cu。2.照射后的细胞置于37'C,5o/。C02,饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，每24h换液一次，去除死亡细胞，存活的细胞长满后用0.25%胰酶消化传代。3.初次剂量为200Gy,照射3次，后依次400Gy，600Gy各照射3次，每次照射后58周待存活的后代细胞状态稳定后进行下一次照射，整个照射及培养过程历时1年。1.2绘制CNE2R及CNE2细胞生长曲线，计算其倍增时间MTT法实验分组CNE2R组，CNE2组和RPMI-1640培养液空白对照组。CNE2R组和CNE2组各设12个平行孔，RPMI-1640培养液空白对照组设3个平行孔。重复实验2次。实验步骤1.MTT溶液。MTT溶于PH7.4的0.01mol/lPBS液中，磁场搅拌30分钟，过滤除菌，配制成5mg/ml的MTT液，4'C冰箱存备用。2.单细胞悬液接种于96孔平板，500个/孔，每孔培养基总量180^1(96孔培养板每孔容积为37(V1)，轻摇平板使细胞分布均匀，37°C、5%<:02培养箱中培养，每隔24h测量一块板的吸光度，连续7天。3.测板前加入MTT液(20—孔)，继续培养2.5个小时。4.快速翻转法除去孔内液体，加入DMSO液(150nl/孔)，室温下，将平板置于微孔板震荡器上震荡10min，使结晶物溶解。5.酶标仪检测各孔OD值a=490nm)。记录结果，绘制细胞活力曲线图。6.计算倍增时间。1.3拟合CNE2R及CNE2细胞的存活曲线并计算相关放射生物学参数和SF2值平板克隆形成法和线性二次模型(L-Q模型)实验分组CNE2R和CNE2组，接种细胞数及相对应的照射剂量见表1-1:表l-l:平板克隆形成法接种的不同细胞数及对应的照射剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验步骤1.取指数生长期细胞，O.25%胰酶消化成单细胞悬液，单个细胞百分率应在95%以上。2.梯度倍数稀释将102105个细胞种植到直径3cm的6孔培养板中，培养箱中过夜，换新鲜培养液后照射。细胞数及对应的辐射剂量如表1所示，每个剂量设3个平行样本。3.细胞接受照射后，37°C、5%C02条件下培养10d，肉眼可见克隆形成。4.弃培养液用PBS洗涤2次，甲醇固定15min，姬姆萨应用液染色20min。5.流水冲洗染色液，空气干燥。6.灯箱下计数每个培养孔中的集落数，以>50个细胞数作为一个集落，计算每组均值。7.以0Gy组克隆形成率作为对照，计算不同辐射剂量下的细胞存活分数贴壁率(PlantingEfficiency,PE)-对照组克隆数(0Gy克隆数)/细胞接种数x100。/。;存活分数(SurvivingFraction,SF)=实验组克隆数/(接种细胞数xPE)。8.分别绘制CNE2R和CNE2组细胞辐射剂量存活曲线在SPSS16.0统计软件中，根据不同的照射剂量和该剂量下的存活分数(SF)运用Curveestimation拟合出线性二次模型(LQ模型)SF^xp(-aD-pD、的a和卩值，绘制剂量存活曲线,计算SF2值。1.4检测CNE2R及CNE2细胞细胞周期血清饥饿细胞周期同步化法实验分组CNE2R和CNE2组实验步骤1.取对数生长期的细胞，pH7.4的PBS溶液洗2次,0.25%的胰酶消化，去胰酶，收集细胞，计数，分2份，其中一份取^1.0xl()S细胞用PBS洗2次，缓慢加入75%乙醇lml固定，4'C冰箱中保存过夜，第二天离心去上清，PBS清洗后重悬于含100mg/L碘化丙啶(PI)和100mg/LRNase酶的0.5mlPI染色液中，4。C避光染色30min后，EUTE(Beckman公司)流式细胞仪检测细胞周期。2.另一份加入适量无血清RPMI-1640培养液，37。C，5%C02，饱和湿度下培养24h，收集细胞，计数，按体积平均分成2份。一份中取^1,106细胞检测细胞周期。3.无血清RPMI-1640培养液，37。C,5%C02，饱和湿度下培养24h后的另一份细胞离心去上清，加适量含10%的新生牛血清的RPMI-1640培养液重悬，培养24h后，收集细胞并检测细胞周期。比较正常对数生长期细胞和同步化及去同步化24h后的细胞周期改变情况。1.5结果1.CNE2R及CNE2细胞生长曲线及倍增时间(MTT法)镜下观察，细胞种板24h后已基本贴壁，两种细胞在形态学上无明显差异。MTT法检测发现CNE2在种板的第3天进入对数生长期，约在第6天到达平台期，CNE2R约在种板后第5天进入对数生长期，在第8天到达平台期，CNE2R的生长速度较原细胞株CNE2慢，且在进入指数增长期之前的潜伏期更长。根据公式TD=(t-to)lg2/(lgN-lgNo)计算,CNE2的倍增时间是21.7h,CNE2R的倍增时间是20.5h，其倍增时间较C.NE2延长。CNE2R禾HCNE2的细胞生长曲线见图1。2.CNE2R及CNE2细胞的存活曲线，相关放射生物学参数和SF2值(平板克隆形成法和线性二次模型)平板克隆形成法所得不同剂量下两株细胞的存活分数见下表1-2:表1-2不同剂量下CNE2R和CNE2细胞存活分数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在SPSS16.0统计软件中，根据不同的照射剂量和该剂量下的存活分数(SF)运用Curveestimation拟合出线性二次模型(LQ模型)SF二e邓(-(xD-卩D、的a禾卩P值，绘制剂量存活曲线,计算SF2值。结果见图2、表1-3:表1-3CNE2R和CNE2的线性二次模型参数(n二3，尸O.Ol)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.CNE2R及CNE2细胞的细胞周期血清饥饿细胞周期同步化法血清饥饿细胞周期同步化是指部分细胞在无血清的培养基中2448h内停止生长，细胞多数静止于G0/G1期，加入血清后，处于G0/G1细胞继续生长、增殖去同步化，约12h后进入下一期,不同的细胞进入下一周期的时间和比例不同。从图3屮可以看出，撤去血清后24h细胞同步化，CNE2R和CNE2中分别有52.9%和52.1%的细胞停滞在GO/Gl期。加入血清去同步化24h后再测周期，发现CNE2细胞周期中G1期细胞下降到48.5%,而G2期细胞有所上升，但是CNE2R的G1期细胞与同步化前相比反而有所增加，为65.3%，出现G1期阻滞。相比之下，撤去血清后24h细胞同步化，CNE2R处于S期的细胞比例(26.3%)要高于CNE2(25.1%)，而CNE2R处于G2期的细胞比例(8.4%)则明显少于CNE2细胞处于G2期的细胞(26.5%)，见图3，图4。不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株遗传学差异的研究利用染色体核型分析寻找CNE2R及CNE2之间染色体的差异，STR分型分析CNE2R及CNE2细胞常染色体STR基因座和性别基因(Amelogenin基因)。2.1染色体核型分析实验步骤1.细胞长至80%，培养液中加秋水仙素(Sigma,40呢/ml)5pl/ml培养液，混匀。2.2.5h后，弃旧液，PBS洗两次，胰酶消化'离心，1000rpm/min,3min。3.去上清，各加基础培养液lml，混匀。4.缓慢加入提前预热至37。C的低渗KCL(0.075M)10ml,混匀，37。C孵育20min。5.加入7滴预冷至-2(TC的甲醇冰醋酸固定液(甲醇冰醋酸=3:1)，轻轻混匀。6.离心,4。C,210+g，10min。7.去上清，仅留lml，重悬，加预冷至-20'C的甲醇冰醋酸固定液(甲醇冰醋酸=3:1)lml，轻轻混匀。8.另加5-10ml预冷至-2(TC的甲醇冰醋酸固定液(甲醇冰醋酸=3:1)，充分混匀。9.-20。C固定，30min。10.重复步骤8-115次。11.-2(TC的甲醇冰醋酸固定液(甲醇冰醋酸=3:1)中至少固定24h。12.滴片。载玻片事先放在0。C水浴，取出玻片后在玻片温度上升及干燥前从高处滴片。13.快速过火或空气干燥。14.吉姆萨染色。15.镜下观察。2.2STR分型实验分组CNE2R组及CNE2组实验步骤1.CNE-2R和CNE-2的DNA提取及定量。分别取含有对数生长期CNE-2R和CNE-2细胞的悬浮液200nl，离心(10000rpmx2min),弃上清，留取细胞沉淀，采用快速Chelex-lOO提取法提取DNA，用DNAIQTMSystem(DC6700)对其进行定量。2.DNA扩增及检测在PCR扩增管内建立扩增体系，将其置于热循环仪上，用PowerPlex㊣16系统进行DNA扩增，将扩增产物进行电泳，用ABI3100DNA遗传分析仪检测扩增片段。3.数据分析及STR分型。用GeneScan⑧分析软件对从ABI3100遗传分析仪得到的数据进行分析，然后再经GeneMapper⑧3.0软件处理对15个常染色体STR基因座和性别基因(Amelogenin基因)进行STR分型。2.3结果1.CNE2R及CNE2细胞染色体的差异(染色体核型分析)染色体核型分析结果表明CNE2R和CNE2细胞间的染色体变异程度较大，而同一细胞株的不同细胞之间染色体变异程度相近。具体结果见表2-l、表2-2、表2-3及图5，图6所示。表2-1CNE2R和CNE2细胞间的染色体差异程度比较ttM总染色体正常染色体相同或相似(变未找到两者相似的备注细胞数目数目异)染色体数目CNE2R81521-218不同细胞株之间染色体CNE280421-2117变异程度相差较大表2-2CNE2R的两个不同细胞之间染色体差异程度的比较总染色体正常染色体相同或相似未找到两者相似的备注细胞数目数目(变异)染色体数目CNE2R-181521-227同一细胞株不同细胞之CNE2R-278521-224间染色体变异程度颇为相似_表2-3CNE2的两个不同细胞之间染色体差异程度的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.CNE2R及CNE2细胞染色体STR基因座的差异(STR分型)与CNE2细胞相比，经辐射诱导的CNE2R细胞中，其D8S1179基因座存在等位基因的缺失，即CNE2有3个波峰，而CNE2R有2个波峰，如图7。这表明STR基因座D8S1179的表达在CNE2R和CNE2细胞之间有质的差异。在CNE2R细胞中D13S317基因座的等位基因间的峰高比值接近于6:1:2，而CNE2细胞中D13S317基因座的等位基因间的峰高比值接近于5:3:2，；在CNE2R细胞中TH01基因座的等位基因间的峰高比值接近于1:1:1，而CNE2细胞中TH01基因座的等位基因间的峰高比值接近于1:1:2，见图8，图9。这表明STR基因座D13S317和TH01的表达在CNE2R和CNE2细胞两者之间有量的差异。不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株基因水平差异的研究实验分组CNE2R组及CNE2组实验步骤1.总RNA的提取(TRIzol)。每2><106细胞加入lmlTRIzol,用lml移液器反复吹打。均质化的样品在153(TC放置5min，然后加入0.2倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇15s使混匀，在1530。C放置23min，4°C7,000rpm离心15min，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相。将上层水相转移至一个新的离心管(水相的体积大约为均质化时所用TRIzol体积的60。/。)，加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈振摇使混匀，4'C7,000rpm离心15min，弃上清。加入70%酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分,4'C7,000rpm离心10min，弃上清。重复以上步骤1次。1530'C晾干，加入适量的无RNase的水溶解。用分光光度计分析RNA浓度，在260nm10D约等于40吗/ml的RNA。用260和280nm测定吸光度以确定样品的浓度和纯度，A，JA，应接近2.0为较纯的RNA(比值260280在1.9-2.1也可)，1%琼脂糖电泳。2.RNA的纯化(QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit)及Poly(A)+mRNA的提取(QIAGENOligotexDirectmRNAkit)严格按照QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册进行。3.由RNA合成双链DNA第1链cDNA合成。在E卯endorf管中加入逆转录试齐U，然后70°C温浴10min,稍微离心，立即放置冰上至少2min.在相应E卯endorf管中再加入dNTP及缓冲液，混合均匀，42'C温浴1h,反应结束放置冰上至少2min.第2链DNA合成在第1链合成的管中加入第2链反应试剂，混匀后稍微离心，16'C放置2h.加210U/jaLT4DNA聚合酶，16。C放置5min.再加0.5mol/LEDTA10终止反应.纯化双链DNA,在合成的双链cDNA产物中加入cDNABindingBuffer600pL,然后混匀待用.把500|iL样品加入cDNACleanupSpinColumn,^8000g离心1min，弃流出液.把剩余的样品加入离心柱，以上述同样的方法离心.弃流出液和收集管.把离心柱转移至一个新的收集管.加入cDNAWashBuffer750iaL至离心柱内.^8000g离心1min,弃流出液.打开离心柱管盖,以最大速度离心5min(S25000g)，弃流出液和收集管.打开管盖离心可以确保离心柱内膜的干燥.把离心柱转移至一个新的1.5mL收集管，加入cDNAElutionBuffer14室温下静置1min.以最大转速(《5000g)离心1min洗脱DNA.—般14的洗脱液可以收集到约12pL流出液.用纯化生物素标记的cRNA，用分光光度计分析RNA浓度。4.杂交和分析。芯片使用前需平衡至室温，在新的1.5mLRNase-free离心管中配制杂交液。杂交液先99。C，5min，然后45。C,5min。在进行上述步骤的同时通过加样孔加入适量体积x杂交缓冲液湿润芯片。杂交炉中45°C,60rpm预杂交芯片10min.把以上处理过的样品最大速离心5min，从芯片中取出杂交缓冲液，加等体积处理好的杂交液,杂交炉中45°C,60rpm杂交芯片16h.把杂交好的芯片进行洗脱、染色，最后扫描芯片.用Affymetrix扫描仪扫描芯片后，GCOS软件读取、处理数据.差异基因筛选标准change为Increase或MarginalIncrease,logratio(实验组和对照组比值取Log2后的值)^1,实验组(CNE2R)Detection为Present的为上调基因；change为Decrease或MarginalDecrease,logration1,对照组(CNE2)Detection为Present的为下调基因.结果1.cne2r及cne2细胞总rna的提取经紫外分光光度计测定各组提纯的RNA样本，CNE1和CNE2的A26Q/A28q值均>1.9，基本符合RNA芯片的要求。1。/。琼脂糖电泳显示明显的28SRNA和18SRNA的条带(图10)，28SRNA条带的亮度是18SRNA的2倍左右，说明没有明显的降解，提纯符合要求。2.基因表达谱芯片差异表达杂交后表达谱芯片的扫描结果符合质控标准，信号强度达到要求，5，/3'比值正常，芯片均一性正常。图11以散点图的形式描述了CNE2R/CNE2对应的转录本的信号平均强度。检测的基因共有38500个，共同差异表达的基因共有855个，其中表达变化上调的基因有538个，下调表达变化的基因有317个。3.基因表达谱芯片杂交及筛选结果CNE2R与CNE2相比较，两个细胞株中共同表达差异的基因共有855个，其中共同表达变化上调的基因有538个，包括抗氧化活性相关基因、结合蛋白相关基因、细胞周期相关基因、酶活性调节相关基因、代谢相关基因、信号传导相关基因、结构分子相关基因、转录调控相关基因、翻译调控相关基因、物质运输相关基因和凋亡或肿瘤相关基因。两个细胞株中未发现共同上调的包括分子伴侣调控相关基因和营养储备相关基因(表3-l)。共同表达变化下调的基因有317个，包括抗氧化活性相关基因、分子马达相关基因、结合蛋白相关基因、细胞周期相关基因、酶活性调节相关基因、代谢相关基因、信号传导相关基因、结构分子相关基因、转录调控相关基因、翻译调控相关基因、物质运输相关基因和凋亡或肿瘤相关基因。两个细胞株中未发现共同上调的包括分子伴侣调控相关基因和营养储备相关基因(表3-2)。很多基因具有多功能，参与凋亡、结合、代谢、细胞周期、信号转导、转录、翻译、结构及物质运输，这些基因至少参与两种不同的细胞活动过程(表3-3)。表3-1CNE2R与CNE2共同表达差异上调的基因CNE2vs功能分类GeneBank工D基因名称基因代码染色体定位R-9—SigalLogRatio抗氧化活性画—001908.1组织蛋白酶BCTSBchr8p22-l肿瘤或细胞凋亡U57059.1Apo-2配体TNFSF10chr3q26-1.2NM—005879.1TRAF相互作用蛋白TRA1Pchr3p21.31-1.3结构蛋白NM—000094.1胶原质VIalC0L7A1chr3p2U-1.4画—001853.1胶原质IXa3COL9A3chr20ql3.3-1.2转录调节NM一002971.1富含AT序列的结合蛋白lSATB1ctw3p23-1,2信号转导雇—002222.1肌糖1,4，5-三磷酸受体1ITPR]chr3p26-p25-lNM—000096.1血浆铜蓝蛋白磷酸二脂酶4D，cAMPCPcMq23陽q25-4.5妙At口HBC008390.1特异的果蝇同源磷酸二脂酶E3chr5ql2-l画—006472.1上调的l，25-(OH)2VD3TXNIPchrlq2U-1.8U36跳lp311蛋白C5orfl3chr5q22.1-l菌—002964.2S100f丐结合蛋白A8S100A8chrlq21-1,4觀—002736.1依赖cAMP的蛋白激酶即PRKAR2Bchr7q22-1.4NM一00086ai羟基前列腺素脱氢15-(NAD)HPGDchr4q34-q35-2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-2CNE2R与CNE2共同表达差异下调的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage15</tabl<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株蛋白质组差异表达的硏究实验分组CNE2R组及CNE2组实验步骤制备样品。倒出细胞培养液，预冷的PBS清洗三遍，彻底吸出PBS。冰上加入裂解液(350ul裂解液/107细胞)，用细胞刮刀将细胞刮下(裂解液和酶抑制剂以体积比50:l混合，7M尿素，2MThiourea,4%CHAPS，0.2%IPGbuffer，25mMTris，PH8.3),裂解液震荡均匀，超声破碎细胞(80W，5次，每次10秒，间隔15秒，冰上完成)。离心，15,000g，4°C，45分钟，上清用Bio-Radproteinassayreagent定量，并准备内标(internalstandard)(2个样品的等量混合物)。-S(TC保存。1.标记样品。准备荧光染料，-20°C，避光保存，备用。用50mMNaOH调样品的pH值到8.0-9.0，调整好pH值后，按照400pmol:50ug的比例进行荧光标记，Cy2标记内标，Cy3与Cy5标记样品。混匀，于冰上暗处标记30min。加入10mMlysine终止反应。标记完成。2.双向电泳(正F+SDS-PAGE)。准备样品、内标及13cmpH值3-10的非线性胶条，沿着聚焦盘的边缘自左而右线性连贯地加入样品溶液，避免产生气泡，在每根胶条上覆盖适量IPG覆盖油，防止胶条水化过程中液体蒸发。分清正负极，在IPGphor仪器上水化样品。样品水化后，进行等电聚焦，电泳条件为30v12hrs,500vlhr,1000vlhr,8000v8hrs,500v4hrs;聚焦后立即将IPG胶条分别置于2ml平衡缓冲液A和2ml平衡缓冲液B中各平衡15min;提前准备12.5%垂直SDS凝胶，平衡好的IPG胶条浸入电泳缓冲液中几秒钟后，将IPG胶条小心地放置于SDS胶面上，使二者充分接触，其间不要产生任何气泡，用热的低熔点琼脂糖封胶，将凝胶转移至电泳槽中，进行电泳15mA/gel20min,30mA/geL至溴酚蓝离胶下沿0.5cm。实验重复3次。3.扫描和图像分析。将胶小心放到扫描仪上。打开TyphoonScannerControl,根据胶所在位置和大小选择扫描区域。设置扫描参数(AcquisitionMode:fluorescence;EmissionFilter:Cy2，Cy3，Cy5;PMT值550)进行预扫。扫描后的图像通过ImageQuant打开，査看每一块图谱的Maximumpixelvalue值，大约在60000-100000之间。然后将分辨率(PixelSize)设为100，设定合适的PMT值，正式扫描。当Cy2，Cy3，Cy5三个图谱的Maximumpixelvalue都在60000-100000之间时，保存扫描结果。扫描完毕。胶内的分析使用Decyder6.5DIA(DifferentialIn-gelanalysis),胶间的匹配和统计分析使用Decyder6.5BVA((BiologicalVarianceAnalysis)。DIA程序中估计点的数目设置为2000，DIA将自动对胶进行共找点，然后计算胶上每个蛋白点相对于重叠的内标的同一点的比值。BVA统计分析蛋白结果采用Studentttest,P<0.05，AvRatio^l.00或者AvRatioS-1.00。4.选点及LC-MS/MS分析。手术刀片切下胶上目标条带，置于EP管中(胶块切成约1mm3大小)，Trypsin溶液酶解。酶解后的多肽样品冻干，加入0.1%甲酸溶液10^1，混匀溶解，转移至自动进样瓶中，上样5pl。色谱柱以95。/。的A液(0.1%甲酸的水溶液)平衡后，样品由自动进样器上样到Trap柱。95%A液中平衡15min,B液线性梯度在30min中内从5°/0到60%，然后再在5min中内从从60%到100%，维持5min后，B液线性梯度从100%到5%。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集每次全扫描(fullscan)后采集十个碎片图谱(MS2scan)。得到的原始文件(rawfile)用BIOWORKERS软件(ThermoFinnigan,SanJose,CA)搜索相应的库。5.实验结果及分析。蛋白搜索使用的数据库为ipiHUMANv3.36蛋白库,SEQUEST结果过滤参数为当Charge+1，Xcorr2l.9;当Charge+2，Xcorr22.2;当Charge+3，Xcorr23.75;其中DelCN^0.1。结果1.CNE2R及CNE2细胞DIGE匹配结果分别从每株细胞的蛋白样品中取3次样(各50ug)，按表4-l进行标记。每50yg样品标记400pmo1的染料分子，内标为所有2个样品的等量混合物，每块凝胶上样也是50ng。将标记有Cy3或Cy5的样本和标记有Cy2的内标混合，在同一块胶上电泳。实验重复3次。同一胶内利用Decyder6.5软件进行DIA分析，自动对胶进行共找点，然后计算胶上每个点相对于重叠的内标的同一点的比值。三块胶上的点数分别为Gell:1859，Gel2:1762，Gel3:1988，以软件定义的点数最多的胶(Gel3)为参考胶，利用BVA模块将所有的Cy2图谱与参考胶进行匹配，随后对匹配的点进行差异分析。表4-12D-DIGE上样表格<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>A:CNE2,B:CNE2RCNE2R与CNE2细胞相比，按照Studentttest,P<0.05，AvRatio》1.00或者AvRatio《-1.00的标准过滤，存在差异的点有16个(见图12，表4-2),其中上调10个，下调6个。表4-2CNE2R及CNE2细胞2D-D1GE检测出的差异点<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.CNE2R及CNE2细胞差异蛋白点LC-MS/MS分析结果选取Av.Ratio2U0或者AvRatio^-1.10的点共11个(3个下调No.1745，No.1713，No.l438;8个上调No.1289，No.1800，No.912，No.1805,No.1842，No.1845，No.1677，Nal735)进行质谱分析。BIOWORKERS软件搜索相应的数据库，查库结果可信的蛋白质点的标准为一个蛋白质检索到两段不重复的肽段或者一个肽段重复搜到4次。结果显示，每个点都检测到了多个蛋白，其中有的不至一个蛋白包含有相问的肽段，这样的结果归为一个群，称为一个鉴定蛋白群。结果见表4-3。表4-3CNE2R及CNE2细胞2D-DIGE检测出的差异点蛋白SamplenameGroupnumberProteinnameP071011289P071011438P0710116771Lsoform1ofSTIP1homologyandUbox-containingprotein12lsoformASF-1ofSplicingfactor,arginine/serine-rich1CBR3Carbonylreductase[NADPH]3GGPS1GeranylgeranylpyrophosphatesyiiUietasePPA2lsoform1ofInorganicpyrophosphatase2,mitochondrialprecursorSULT1A3;SULT1A4Phenolsulfotransferase1A5*1ApossiblealternativesplicingformTOMM34MitochondrialimportreceptorsubunitTOM34PPA1InorganicpyrophosphataseHNRNPA1lsoformAl-BofHeterogeneousnuclearribonucleoproteinAlMY腦lsoform1ofMyosin-10PHB2Prohibitin-2LDHAlsoform1ofL-lactatedehydrogenaseAchainPHBProhibitinRPL760SribosomaiproteinL7YWHAG14-3-3proteingammaRPS4X40SribosomalproteinS4，XisoformPSMB7Proteasomcsubunitbetatype-7precursorPSME1UncharacterizedproteinPSME丄PAFAH1B2Platelet-activatingfactoracetylhydrolaseIBsubunitbetaHRNRHornerinGCLIvIGlutamate--cystemeligaseregulatorysubunitFKBP3FK506-bindingprotein3YWHAZ14-3-3proteinzeta/deltaDCIIsoform1of3,2-trans-e呵l-CoAisomerase,mitochondrialprecursorRNF149E3ubiquitiii-proteinligaseRNF149precursorCLIC4Chlorideintracellularchannelprotein4CACYBPIsoform1ofCalcyclin-bindingproteinDSG1Desmoglein-1precursorB3GALTLBeta-1,3-glucosyltransferaseYWHAQ14-3-3proteinthetaCFL1Cofilin-1ARMETProteinARMETprecursorPeptidyl-prolylcis-transisomeraseHMRPS28Mitochondrial28SribosomalproteinS28FLJ13305PutativeuncharacterizedproteinFLJ13305NSDHLSterol"4-alpha匿carboxylate3-dehydrogenase,decarboxylatingTTNIsoform2ofTitin-HEJ1EEF1E1Eukaryotictranslationelongationfactor1epsilon-1DSPIsoformDPIofDesmoplakinBLOCIS1Biogenesisoflysosome匿relatedorganellesc;omplex-lsubunit1RPEIsoform1ofRibulose-phosphate3-epimerase34689101112123467891011121314151617181P07101171313HRNRHornerin1STMN1Stathmin2SUB1ActivatedRNApolymeraseIItranscriptionalcoactivatorp153RPl1-413M3.2Chromosome9openreadingframe1514APITD1Isoform1ofCentromereproteinS5FLJ10357hypotheticalproteinLOC557016MY018AIsoform2ofMyosin-XVIlIa7RPL2860SribosomalproteinL28P0710117358HIST1H4A;HIST1H4K;HIST1H4J;HIST1H4D;HIST1H4E;HIST1H4H;HIST1H4C;HIST4H4;H1ST1H4I;H1ST1H4F;H1ST2H4B;HIST1H4B;HIST2H4A;HTSTIH4LHistoneH49PFDN2Prefoldinsubunit210BRWDlIsoformBofBromodomainandWDrepeat-containingprotein11EDFlIsoform1ofEndothelialdifferentiation-relatedfactor12hCG—21078hypotheticalproteinLOC3894353DCDDermcidinprecursor4H2AFVHistoneH2AVP071011745P0710118005HISTIH4A;HIST1H4K;HIST1H4J;HIST1H4D;HIST1H4E;HIST1H4H;H1ST腦C;H1ST4H4;HISTIH4I;HIST1H4F;HIST2H4B;H[ST1H4B;HIST2H4A;HIST1H4LHistoneH46PLP2Proteolipidprotein27RPL3560SribosomalprotdnL351RPS1840SribosomalproteinS182DCDDermcidinprecursor3HIST1H4A;HIST1H4K;HIST1H4J，HIST1H4D;HIST1H4E;HIST1H4H;HIST1H4C;HIST4H4;HIST1H4I;HIST1H4F;HIST2H4B;HIST1H4B;HIST2H4A;HIST1H4LHistoneH44RPS2540SribosomalproteinS255SUBlActivatedRNApolymeraseIItranscriptionalcoactivatorpi56RPL3560SribosomalproteinL351-Putativeubiquitin-conjugatingenzymeE2D3-likeprotein2H2AFVHistoneH2AVP0710118053HIST1H4A;HIST1H4K;HIST1H4J;HIST1H4D;HIST1H4E;HIST1H4H;HIST1H4C;HIST4H4;HIST1H4I;HIST1H4F;HIST2H4B;HIST1H4B;HIST2H4A;HIST1H4T,HistoneH44RPS26P10similarto40SribosomalproLeinS265HRNRHomerin6CFT」Cofilin-11HISTlH2BKIIistoneH2Btypcl-K2CCDC58Coiled-coildomain-containingprotein583FISlMitochondrialfission1protein4RPL3160SribosomalproteinL315RPL2260SribosomalproteinL226RPS1940SribosomalproteinS197NCBP2Nuclearcap-bindingproteinsubunit28TRAPPC6BIsoform2ofTraffickingproteinparticlecomplexsubunit6BP07101聽9HTST1H4A;HIST1H4K;HIST1H4J;HIST1H4D;HIST1H4E;HIST1H4H;HIST1H4C;H1ST4H4;IIIST1H4I;H1ST1H4F;HIST2H4B;H1ST1H4B;HIST2H4A;HIST1H4LHistoneH410HRNRHornerin11RPS27A;UBC;UBBubiquitinandribosomalproteinS27aprecursor1RPL35A60SribosomalproteinL35a2LGALS1Galectin-13PFN2IsoformlibofProfilin-24SEP1515kDaselenoproteinisoform1precursor5ACTBActin，cytoplasmic16COX5ACytochromecoxidasesubunit5A,mitochondrialprecursor7TRIM22UncharacterizedproteinTRIM228ELL3RNApolymeraseIIelongationfactorELL39CTA-221G9.4Isoform1ofUncharacterizedproteinKIAA167110CASP1IsoformAlphaofCaspase-1precursorP07101—9121ENOlIsoformalpha-enolaseofAlpha-enolase2EEF1A2Elongationfactor1-alpha23CARKLCarbohydratekinase-likeprotein4CTBP2Isoform1ofC-terminal-bindingprotein25SNX5Sortingnexin-5不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株微小RNA差异表达的研究实验分组CNE2R组及CNE2组实验步骤MiRNA的提取胰酶消化对数生长期的CNE-2和CNE-2R细胞,用含10。/。灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液(含10%灭活胎牛血清，lxl05U/L青霉素，lxl05U/L链霉素)稀释细胞2x108cdls/L的细胞悬液，接种于IOmL的培养皿，每皿2xl06,并置37'C、5%C02和100%湿度的培养箱培养。48h后弃上清，用PBS洗2次,每皿加lmLTrizo使细胞裂解，转移至微量离心管中，室温下放置5min,加入氯仿0.2mL后剧烈振荡15s，室温下放3min,12000rpm/min、4。C离心15min;收集上层水相转移至新的离心管中,加入lmL异丙醇后置于-20'C过夜,12000rpm/min、4'C离心10min;弃上清，加入75。/。乙醇lmL,7500rpm/min4。C离心5min,室温下使乙醇自然风干,加入无核酶的水5(^L,置于55-60。C使miRNA溶解，-80。C保存。MicroRNAmicroarrayassay首先用YM-100微离心滤器将1^201提取的总腿八样本进行大小分害1〗，取2-5吗小RNAs(。00nt)用ployA聚合酶扩展3'末端形成polyA尾。然后把一个寡核苷酸标记连接到polyA尾上用于荧光染色。通过微循环泵(AtacticTechnologies)在^iParafl()TM微流体芯片上进行杂交,过夜。在^Parafl()TM微流体芯片上,每个检测探针由一个化学修饰核苷酸编码的片段互补地结合到靶microRNA或其它RNA,聚乙二醇的分隔片段促使编码片段从底物中分离出来。检测探针是由PGR(光敏试剂)化学试剂原位合成。杂交解链温度的平衡由探针的化学修饰调节完成。杂交反应在34。C下用含25。/。的甲酰胺的100^L6xSSPE缓冲液平衡。此后,用Cy3和Cy5进行荧光标记,用激光扫描器收集杂交的图像。扣除背景,用LOWESS滤器规范信号后,用专业软件分析数据，并计算两种检测信号的比值(log2)和t检验的p值，以p值<0.01定义显著差异性表达。结果基因芯片结果发现(如表5-l)与CNE-2相比较，在检测的719个microRNA中，CNE-2R中有37个mi脂A上调，29个下调。上调的miRNA包括hsa-miR-191、hsa-miR-151-5p、hsa-let-7i、hsa-miR-200c、hsa-miR-26a、hsa-let-7a、hsa-miR-15b、hsa-let-7f、hsa陽miR-21、hsa-let-7d、hsa画let-7c、hsa-miR匿365、hsa陽let-7b、hsa-miR陽768-5p、hsa-miR-132、hsa-miR-923、hsa-miR-454、hsa-miR-98、hsa-miR-638、hsa-miR隱28-5p、hsa-let-7g、hsa-let-7e、hsa-miR-205、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-26b、hsa-miR-192、hsa-miR-224、hsa-miR-149*、hsa-miR-194、hsa-miR-10a、hsa-miR-663、hsa-miR-200b、hsa-miR-374b、hsa-miR-196a和hsa-miR-483-5p;下调的miRNA包括hsa-miR-301a、hsa-miR-18a、hsa-miR-19b、hsa-miR-18b、hsa-miR-24、hsa-miR-103、hsa-miR-106b、hsa-niiR-93、hsa-miR-107、hsa-miR-99a、hsa-miR-100、hsa陽miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-128、hsa-miR-20b、hsa-miR-106a、hsa-miR-23a、hsa-miR-877、hsa-miR-23b、hsa-miR-31、hsa-miR-182、hsa-miR-99b、hsa-miR-27a、hsa陽miR-16、hsa-miR-222、hsa-miR-29a、hsa-miR-25、hsa-miR-125b、和hsa-miR-92a。其中检测量的绝对值在2000以上且两者相差在2倍以上的miRNA有hsa-miR-200b、hsa-miR-224、hsa-miR-26b、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-205、hsa-let-7e、hsa-let-7g、hsa-miR-19b、hsa國miR-24、hsa-miR-103、hsa-miR-106b和hsa-miR-93，检测量的绝对值在1300以上但在2000以下且两者相差在2倍以上的miRNA有hsa-miR-374b和hsa-miR-l8a。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>权利要求1.一种人鼻咽癌辐射耐受细胞株的建立，其特征在于选用爬坡式大剂量X线诱导照射，建立同起源和同遗传背景的辐射耐受NPC细胞株CNE2R，按以下步骤进行(1)射线选用X线；(2)剂量采用X线剂量分别为200Gy、400Gy、600Gy作爬坡式大剂量X线诱导；(3)亲代细胞培养人鼻咽癌细胞株CNE2细胞生长于含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养；(4)人鼻咽癌辐射耐受细胞株诱导取处于对数生长期CNE2细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以1.0×104/cm2细胞种植培养瓶，种植完毕用封口膜封好培养瓶口，采用北京医用X线机厂生产的深部X线机，照射条件为电压210kV、电流12mA，滤过板为0.25Cu、照射野大小为10cm×15cm，焦皮距为40cm，剂量率为101.38cGy/min，半价层为0.52Cu进行照射，照射后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每24h换液一次，待细胞状态稳定后再进行第二次冲击，如此反复作用，200Gy、400Gy、600Gy各冲击照射3次，共9次，历时1年建成人鼻咽癌辐射耐受细胞株CNE2R。2.—种人鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于一种人鼻咽癌辐射耐受细胞机制初探所用的菌株是由权利要求1所述的方法建立、培养的CNE2R细胞株，对CNE2R细胞株进行机制初探。3.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于:所述的CNE2R细胞株生长速度较原细胞株CNE2慢，且在进入指数增长期之前的潜伏期更长，CNE2R细胞的倍增时间是21.7h,其倍增时间较敏感细胞延长；CNE2R细胞2Gy照射下的存活分数(SF2)为0.574，其存活分数较敏感细胞延长；CNE2R处于S期的细胞比例(26.3%)要高于敏感细胞，而CNE2R处于G2期的细胞比例(8.4。/。)则明显少于敏感细胞细胞处于G2期的细胞。4.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于所述的CNE2R细胞株的正常染色体数目为52，较CNE2细胞的正常染色体数目多。5.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于所述的CNE2R细胞株的STR基因座D8S1179的表达与敏感细胞有质的差异，CNE2R的STR基因座D13S317和TH01的表达与敏感细胞有量的差异。6.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于所述的CNE2R细胞株与敏感细胞相比，两个细胞株中共同表达差异的基因共有855个，其中共同表达变化上调的基因有538个，共同表达变化下调的基因有317个。7.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探，其特征在于所述的CNE2R细胞株与敏感细胞相比，蛋白质组差异表达存在差异的点有16个，其中上调10个，下调6个。8.如权利要求2所述的一种鼻咽癌辐射耐受细胞株机制初探,其特征在于所述的CNE2R细胞株与敏感细胞相比，719个microRNA中差异表达存的有66个，其中上调37个，下调29个。全文摘要本发明涉及一种人鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE2R的建立，选择人鼻咽癌细胞株CNE2作为亲代细胞，选择X射线的终剂量为600Gy作为大剂量冲击用量，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立CNE2R细胞，其生长速度较原细胞株CNE2慢，且在进入指数增长期之前的潜伏期更长，CNE2的倍增时间是21.7h，CNE2R的倍增时间是20.5h，其倍增时间较CNE2延长；CNE2和CNE2R的放射生物学参数α值分别为0.138和0.065(p＜0.01)，放射生物学参数β值分别为0.169和0.141(p＜0.01)，2Gy存活分数SF2值为0.359和0.574(p＜0.01)，CNE2R的放射抗拒性增加。文档编号C12N5/08GK101407791SQ20081019918公开日2009年4月15日申请日期2008年10月16日优先权日2008年10月16日发明者杨惠玲申请人:中山大学