一种红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法

专利名称：一种红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法
技术领域：
本发明涉及一种红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用 方法。在冻干红细胞前将冻干保护剂加入待冻干的红细胞中，然后 按照一定的冻干程序进行冻干，当复水时用复水保护剂进行复水， 通过本保护剂能够明显的提高冻干后红细胞的恢复率。
背景技术：
目前大部分血液是在4-C的冰箱中保存的，并且保存的天数也仅 在20天左右，不能满足长时间大量的保存的需要，所以一方面是无 偿献出的血由于保存时间较短而白白浪费掉，而另一方面却是当发 生重大灾害(像地震，战争)时需要大量的血液时却供给不足，因 此探索红细胞长期保存技术是缓解并解决目前日渐突出的临床用血 矛盾的方法之一。
冷冻干燥技术是在低温真空条件下进行，蛋白质及红细胞中热 敏性成分不易受到破坏损失，干燥时微生物生长、酶的活性、以水 为介质的生化反应等都受到抑制，因氧气极少，易氧化成分不易受 到破坏，生物活性基本不变。
因此冻干保存是最适合红细胞长期保存的需要，但是由于红细 胞在冻干和复水过程中都要受到外界的各种影响，所以一直以来红 细胞冻干后复水的恢复率一直不是太高，目前报道的红细胞冻干回
收率最高仅为58. 8%，因此红细胞冻干保存后的高复水率，成为一个世界性的难题，

发明内容
为了解决红细胞冻干后复水的高恢复率这个问题，本发明提出 了一种红细胞的冻干保护剂及其在红细胞冻干过程中的使用方法。 本发明采用的技术方案:
冻干前保护剂的配制
按照下列的组分和浓度配制，24mM的葡萄糖溶液、0.43mM的腺 嘌呤、33mM的NaCl、 8. 9mM的甘露醇、6.6raM的KCl、 10%~15%的高 分子羟乙基淀粉、2.5%的牛血清白蛋白、3%的柠檬酸钠水溶液。
冻干后复水保护剂溶液配置
按下面的配方141mM海藻糖、5mM抗坏血酸、38. 5mM NaCl、 0.265mM KH2P04、 1. 4mM Na2 HP04 、 11. 25%~12. 5%的葡聚糖、1.9% 的牛血清白蛋白、90mM KC1、 100mM肌苷、5mM腺嘌呤。
以上均用双蒸水作为溶剂。 红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法 (1)细胞的前处理
先将健康人新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜， 将红细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min， 反复洗涤3次，弃去上清液，得红细胞。将得到的洗涤红细胞与800mM 的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均匀，通过电脉冲的方法(电压 300V、脉宽lms、频率4~6次/min)将海藻糖载入细胞内，使其胞
内海藻糖浓度达到60mM左右，得到载入海藻糖的红细胞浓縮液备用。
(2) 红细胞的冻干处理 将得到负载海藻糖的红细胞浓縮液和冻干前的保护剂按照一定
的体积比l: 4混合，使细胞的压积为5%左右。
将带有冻干前保护剂的红细胞在4'C冰箱中预冷15分钟左右， 再按照1(TC/分钟的降温速率迅速降到-7(TC，并在此温度下保持2 小时以上使冻干物冻结。
然后，开始抽真空， 一次干燥，并使隔板温度和压力分别保持 在-45"C和1~3帕左右，时间为15小时。
最后，二次干燥，过程中设定隔板温度为15°C，压力也是1~3 帕左右，持续时间为10小时，得冻干的红细胞。
(3) 冻干的红细胞复水处理
复水时，按照复水保护剂体积和冻干前负载海藻糖的红细胞浓 縮液体积的比为2:1进行复水，复水在常温下进行，当冻干的红细 胞完全溶于复水溶液时即可。 本发明的技术效果
本发明的红细胞冻干保护剂及其在红细胞冻干过程中的使用， 通过细胞计数仪测定，恢复率可高达71.1%，与目前现有技术中报道 的红细胞冻干恢复率最高仅为58. 8%的冻干保护剂和冻干方法相比 其恢复率达到71. 1%，提高了12.3%。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但不限制本发明。
实施例
电脉冲仪美国BTX公司BCM-830脉冲仪(电穿孔仪) 红细胞的恢复率的测定方法
红细胞的恢复率为冻干后的红细胞个数与冻干之前的红细胞
个数的比值，即 i ,(。/。)-!x100。/。
及o
式中i ,为冻干处理前由红细胞计数仪测定的红细胞个数 i o为冻干复水后由红细胞计数仪测定的红细胞个数
冻干前保护剂的配制
按照下列的组分和浓度配制，24mM的葡萄糖溶液、0. 43mM的腺 嘌呤、33mM的NaCl、 8. 9mM的甘露醇、6. 6mM的KCl、 10%~15%的高 分子羟乙基淀粉、2.5%的牛血清白蛋白、3%的拧檬酸钠水溶液。 冻干后复水保护剂溶液配置
按下面的配方141mM海藻糖、5mM抗坏血酸、38. 5mM NaCl、 0. 265mM KH2P04、 1. 4mM Na2HP04、 11, 25%~12. 5%的葡聚糖、1.9% 的牛血清白蛋白、90mM KC1、 100mM肌苷、5mM腺嘌呤。
以上均用双蒸水作为溶剂。 红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法
(1)细胞的前处理
先将健康人新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜， 将红细胞用等渗pH=7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min，
反复洗涤3次，弃去上清液，得红细胞。将得到的洗涤红细胞与800rnM 的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均匀，通过电脉冲的方法(电压 300V、脉宽lms、频率4 6次/min)将海藻糖载入细胞内，使其胞 内海藻糖浓度达到60mM左右，载入海藻糖的红细胞浓縮液备用。
(2) 红细胞的冻干处理 将得到负载海藻糖的红细胞浓縮液和冻干前的保护剂按照一定
的体积比l: 4混合，使细胞的压积为5%左右。
将带有冻干前保护剂的红细胞在4t:冰箱中预冷15分钟左右， 再按照lCTC/分钟的降温速率迅速降到-70°C，并在此温度下保持2 小时以上使冻干物冻结。
然后，开始抽真空， 一次干燥，并使隔板温度和压力分别保持 在-45"C和1~3帕左右，时间为15小时。
最后，二次干燥，过程中设定隔板温度为15°C，压力也是1 3 帕左右，持续时间为10小时，得冻干的红细胞。
(3) 冻干的红细胞复水处理
复水时，按照复水保护剂体积和冻干前负载海藻糖的红细胞浓 縮液体积的比为2:1进行复水。复水在常温下进行，当冻干的红细 胞完全溶于复水溶液时即可。
通过细胞计数仪最终测定，红细胞的恢复率为71. 1%。
权利要求
1.一种红细胞的冻干保护剂，包括冻干前保护剂及冻干后的复水保护剂，其特征在于冻干前保护剂有下列成分组成24mM的葡萄糖溶液、0.43mM的腺嘌呤、33mM的NaCl、8.9mM的甘露醇、6.6mM的KCl、10％～15％的高分子羟乙基淀粉、2.5％的牛血清白蛋白、3％的柠檬酸钠；冻干后的复水保护剂有下列组分组成141mM海藻糖、5mM抗坏血酸、38.5mM NaCl、0.265mM 、1.4mM、11.25％～12.5％的葡聚糖、1.9％的牛血清白蛋白、90mM KCl、100mM肌苷、5mM腺嘌呤；以上所用的溶剂均为双蒸水。
2、如权利要求l所述的一种红细胞的冻干保护剂，其特征在于所述的冻干保 护剂在红细胞的冻干过程中使用方法如下 (1)细胞的前处理将血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，将红细胞用等 渗pH二7. 4的磷酸盐缓冲溶液以2500r/min离心5min，反复洗涤3次， 弃去上清液，得红细胞；将得到的洗涤红细胞与800mM的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合 均匀，通过电脉冲的方法将海藻糖载入细胞内，使其胞内海藻糖浓度 达到60mM左右，得载入海藻糖的红细胞浓縮液； (2)红细胞的冻干处理将得到负载海藻糖的红细胞浓縮液和冻干前的保护剂按照一定的体积比l: 4混合，使细胞的压积为5%左右；将经冻干前保护剂处理的红细胞在4-C冰箱中预冷15分钟左右，再 按照1(TC/分钟的降温速率迅速降到-7(TC，并在此温度下保持2小时以 上使冻干物冻结；开始抽真空， 一次干燥，并使隔板温度和压力分别保持在-45-C和 1~3帕左右，时间为15小时；再二次干燥，过程中设定隔板温度为15°C，压力1~3帕左右，持续时间为10小时，得冻干的红细胞； (3)冻干的红细胞复水处理将复水保护剂体积和冻干前负载海藻糖的红细胞浓縮液体积的 比为2:1进行复水。
3、如权利要求2所述的一种红细胞的冻干保护剂，其特征在于所述的冻干保 护剂在红细胞的冻干过程中使用方法中，细胞的前处理中电脉冲参数为电 压 300V、脉宽lms、频率4 6次/min。
全文摘要
本发明涉及一种人体红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法，冻干前保护液配方葡萄糖溶液、腺嘌呤、NaCl、甘露醇、KCl、高分子羟乙基淀粉、牛血清白蛋白、柠檬酸钠；冻干后的复水保护剂配方海藻糖、抗坏血酸、NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡聚糖、牛血清白蛋白、KCl、肌苷、腺嘌呤，将冻干前保护液与红细胞悬浊液按体积比4∶1混合，经冷冻干燥得到冻干的红细胞，再将其用复水保护剂进行复水。本发明的红细胞冻干保护剂及其在红细胞冻干过程中的使用后，通过细胞计数仪测定，恢复率可高达71.1％，与目前现有技术中报道的最高仅为58.8％的冻干保护剂和冻干方法相比其恢复率提高了12.3％。
文档编号C12N5/08GK101368172SQ20081020077
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者刘宝林, 刘建峰, 周国燕, 周新丽, 今 张, 玉 张, 陈唯静 申请人:上海理工大学