专利名称：猪精液稀释防冻剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪精液稀释防冻剂，用于抑制冷冻复苏过程对精子DNA产 生的损伤，延长猪精子超低温冷冻保存的存活时间。属于动物繁殖技术领域。
技术背景瑞典、英国、加拿大等国家，在家畜动物育种及实际繁殖生产中已经建立人工授精技术平台并且形成产业化，经济效益显著。而我国是一个养猪和消费 大国，2007年底生猪存栏量约5. 5亿头，猪肉产量约为5500万吨，随着人们生 活水平的提高，人均猪肉的消费量逐年增加，养殖规模不断增大，养猪方式逐 渐从传统的庭院饲养方式转变为工厂化、集约化和规模化。我国由于饲养等因 素，导致猪品种质量下降，如何利用优质种猪资源进行联合育种，长期保存优 质猪种质资源并利用其冻精人工输精繁殖是目前养殖业亟待解决的问题。家畜 动物牛、马冷冻精子已经成功用于繁殖生产中，但猪冻精繁殖缺乏相应技术标 准没有达到普及推广。人工授精繁殖技术包括利用稀释后的鲜精液和解冻后的 冻精输精两种方式，冷冻精液及其人工输精，将会大大提高良种公猪的利用率， 其中涉及到的关键性技术就是稀释防冻剂的研制。研究表明，冻融精子的质量 如何，例如活力、质膜完整率及顶体完整率的高低直接影响人工输精的受孕率。 猪精子与其它哺乳动物的精子类似，其在冻融过程中对低温损伤的抗性较弱，冷冻复苏后精子活力下降，质膜完整率及顶体完整率亦明显降低，人工授精的 受孕率及胎仔数均低于自然繁殖Watson"m7w i 印rad&f， 2000 ， 42: 251 260.)。 目前，猪的人工授精尤其是精液的超低温冷冻保存及利用冻精繁殖很受人们的 关注，其中防冻剂的配制、冷冻及解冻程序是亟待解决的难题。利用猪冻精繁 殖的受孕率及产仔率会大大降低，England i e; rad 5W, 1996)等将其原因归结于冷冻解冻过程中导致精子运动能力及成活率的降低。Petninkina等 (Theriogenology.2005)从理论上对动物精子冷冻保存作了进一步分析，认为在冻融过程中质膜结构发生变化引起精子的损伤，进而导致冻融精子的死亡或产 生类似凋亡现象。Fmser等(Folia Histochem Cytobiol. 2004)研究证实猪精子冻 融过程中易造成DNA的破损，可见超低温保存亦可能引起猪精子冷冻-解冻复 苏过程中DNA链断裂和变性等损伤情况发生。 发明内容本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种猪精液稀释防冻，能有效 延长延长猪精子超低温冷冻保存的存活时间，有利于维持猪精子的质膜完整性 及顶体完整性，提高猪冻精繁殖的受孕率。为实现上述目的，本发明的猪精子冷冻防冻剂采用一种表面活性剂氨基一 钠一十二垸基硫酸酯(OEP)，并使用N-乙酰基-D-葡萄糖胺，透明质酸、葡萄 糖、三羟甲基氨基甲垸、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、杀菌剂及蒸馏水等配 制而成。其中N-乙酰基-D-葡萄糖胺能促进氨基-钠-十二垸基硫酸酯的乳化功能， 增强氨基-钠-十二烷基硫酸酯及卵黄的保护作用，透明质酸、氨基-钠-十二垸基 硫酸酯能有效抑制冻融精子质膜和DNA的损伤率，提高冻融精子的质量，葡萄 糖为精子在体外代谢的能量来源，柠檬酸钠可维持稀释防冻剂环境与精子内环 境的渗透压平衡。本发明的猪精液稀释防冻剂含有如下具体成分葡萄糖3.0 4.0克，三羟甲基氨基甲烷0.20 0.50克，柠檬酸钠 0.5 0.7克，碳酸氢钠0.10 0.25克，氯化钾0.05 0.08克，透明质酸0.2 0.8mM， N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.02 0.10克，氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.2 1.2 ml，卵黄18 22ml，甘油2.0 6.0ml，青霉素钠0.05 0.08克，硫酸链霉 素0.08 0.15克，蒸馏水定容至100ml;稀释防冻剂pH值为6.8 7.4，渗透压 为310 350mOsmo/L。优选的稀释防冻剂含有如下成分葡萄糖3.70克，三羟甲基氨基甲烷0.24克，柠檬酸钠0.60克，碳酸氢钠 0.12克，氯化钾0.07克，透明质酸0.40mM， N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克， 氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.5 ml，卵黄20ml，甘油3 ml，青霉素钠0.06克，硫酸链霉素0.10克，蒸馏水定容至100 ml;稀释防冻剂pH值为7.2，渗透压为 320mOsmo/L。本发明的猪精液稀释防冻剂可按本领域的常规方法配制，按所述含量分别 加入上述成分，再加蒸馏水，配成100毫升溶液即可。配制成的稀释防冻剂pH值 为6.8 7.4，渗透压为310 350mOsmo/L，可为猪精子体外存活提供最佳基质 条件。本发明利用透射电镜技术，荧光染色剂与流式细胞术(FCM)相结合技术， 从微观质膜结构状态及凋亡变化角度，对不同稀释防冻剂作用下猪冻融精子质 膜完整性及凋亡状况进行系统分析，准确、客观评价冻融精子的受精潜能，对 加入不同稀释防冻剂的猪精子超低温冷冻后的DNA损伤进行检测，最终筛选出 猪精液超低温冷冻保存的高效复合型稀释防冻剂。本发明的猪精液稀释防冻剂中所含的N-乙酰基-D-葡萄糖胺成分，能够有效 促进氨基-钠-十二垸基硫酸酯的乳化功能，增强氨基-钠-十二烷基硫酸酯及卵黄 的保护作用；其中的透明质酸、氨基-钠-十二垸基硫酸酯成分，能有效抑制冻融 精子质膜和DNA的损伤率，显著提高冻融精子的质量；其中的葡萄糖成分为精 子在体外代谢的能量来源，柠檬酸钠可维持稀释防冻剂环境与精子内环境的渗 透压平衡。本发明使用由氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP) 、 N-乙酰基-D-葡萄糖胺等 多种成分组成的防冻剂，对猪精子进行细管冻精试验，并用冻融精子进行人工 授精，研究该防冻剂对猪冷冻精子存活时间及冻融精子质量的影响，结果表明 由氨基-钠-十二垸基硫酸酯(OEP) 、 N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多种成分组成的 防冻剂，能有效抑制冷冻复苏过程对精子DNA产生的损伤，有效延长猪精子超 低温冷冻保存的存活时间，提高猪冻融精子的活力、质膜完整性及顶体完整性， 提高猪冻精人工输精的受孕率，表现出了良好的精子保护作用和防冻效果。本发明的猪精液防冻剂配制简单，取材容易，成本价格低廉，易于推广，适 用于猪细管冻精人工输精繁殖以及猪精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输 后输精，可明显提高猪精子的生存指数，保持其授精活力。
具体实施方式
实施例1先称取0.05gN-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸馏水中，使其完全溶解。 再称取3.70g葡萄糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入0.24g三 羟甲基氨基甲烷、0.60g柠檬酸钠、0.12g碳酸氢钠、氯化钾0.07克、Q.4mM透 明质酸，按上述顺序逐一加入，先加入的试剂完全溶解后再加入后一种使其完 全溶解。把两种制剂相混合，加入0.5 ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯、20ml卵黄及3ml 甘油，然后加入0.06克青霉素钠及0.10克硫酸链霉素，最后蒸馏水定容至100ml, 定容后pH值为7.2，渗透压为320mOsmo/L，放入5。C冰箱保存。所有制备过程 均在无菌条件下进行。该配方对猪精液超低温冷冻保存效果极佳。使用时按l: 3比例与猪精液相 混合，同时要保持稀释防冻剂的温度与待稀释精液温度相同。使用按实施例1方法制备的防冻剂，应用于猪精液超低温冷冻时，测定冻 融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完 整率及顶体完整率(Annexin-FICT-PI、 CTC-Hoechst 33258-PI荧光染料流式细胞 计数仪检测)，单细胞凝胶电泳检测冻融精子DNA的损伤。结果表明猪冻融 精子DNA损伤率为3.85%， 22。C条件下冻融精子的存活时间为68小时、保存4 小时后冻融精子活力为0.43、精子质膜完整率平均为48%，顶体完整率为49%; 利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母猪受孕率为85.6%。 实施例2先称取0.10gN-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸馏水中，使其完全溶解。 再称取3.98g葡萄糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入0.46g三 羟甲基氨基甲垸、0.58g柠檬酸钠、0.14g碳酸氢钠、氯化钾0.08克、0.8mM透明质酸，按上述顺序逐一加入，先加入的试剂完全溶解后再加入后一种使其溶 解。然后把两种制剂相混合，加入1.2 ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯、22ml卵黄 及4ml甘油，然后加入0.08克青霉素钠及0.15克硫酸链霉素，最后蒸熘水定容 至100ml，定容后pH值为7.4，渗透压为345mOsmo/L，放入5。C冰箱保存。所 有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对猪精液超低温冷冻保存效果f及佳。使用时按l: 3比例与猪精液相 混合，同时要保持稀释防冻剂的温度与待稀释精液温度相同。使用按实施例2方法制备的防冻剂，应用于猪精液超低温冷冻时，测定冷 冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(Annexin-FICT-PI、 CTC-Hoechst 33258-PI荧光染 ^f流式细胞计数仪检测)，冻融精子的似凋亡率(Annexin-PI荧光染^4流式细 胞计数仪检测)。结果表明猪冻融精子似早期凋亡比例为6.2%， 22。C条件下 冻融精子的存活时间为65小时、保存4小时后冻融精子活力为0.41、精子质膜 完整率平均为45%，顶体完整率为48%;利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人 工输精繁殖母猪受孕率为83.8%。 实施例3先称取0.02gN-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸馏水中，使其完全溶解。 再称取3.0g葡萄糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入0.20g三羟 甲基氨基甲垸、0.5g柠檬酸钠、0.10g碳酸氢钠、氯化钾0.05克、0.2mM透明质 酸，按上述顺序逐一加入，先加入的试剂完全溶解后再加入后一种使其溶解。然后把两种制剂相混合，加入0.2 ml氨基-钠-十二垸基硫酸酯、18ml卵黄 及2ml甘油，然后加入0.05克青霉素钠及0.08克硫酸链霉素，最后蒸馏水定容 至100ml，定容后pH值为6.8，渗透压为310mOsmo/L，放入5。C冰箱保存。所 有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对猪精液超低温冷冻保存效果极佳。使用时按l: 3比例与猪精液相混合，同时要保持稀释防冻剂的温度与待稀释精液温度相同。使用按实施例3方法制备的防冻剂，利用该稀释防冻剂进行猪精液稀释后 制作细管冻精，猪冻融精子活力、质膜完整率、顶体完整率分别为62.4%、 66.8%、 69.5%。利用冻精人工输精繁殖母猪受孕率达到85.9%，接近利用鲜精稀释后输 精的母猪受孕率(活力及顶体完整率的检测方法同上)。
权利要求
1、一种猪精液稀释防冻剂，其特征在于含有如下成分葡萄糖3. 0～4.0克，三羟甲基氨基甲烷0.20～0.50克，柠檬酸钠0.5～0.7克，碳酸氢钠0.10～0.25克，氯化钾0.05～0.08克，透明质酸0.2～0.8mM，N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.02～0.10克，氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.2～1.2ml，卵黄18～22ml，甘油2.0～6.0ml，青霉素钠0.05～0.08克，硫酸链霉素0.08～0.15克，蒸馏水定容至100ml；该防冻剂pH值为6.8～7.4，渗透压为310～350mOsmo/L。
2、 根据权利要求1的猪精液稀释防冻剂，其特征在于含有如下成分葡萄糖3.70克，三羟甲基氨基甲垸0.24克，柠檬酸钠0.60克，碳酸氢钠 0.12克，氯化钾0.07克，透明质酸0.40mM， N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克， 氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.5 ml，卵黄20 ml，甘油3 ml，青霉素钠0.06克，硫 酸链霉素0.10克，蒸馏水定容至100 ml;该防冻剂pH值为7.2，渗透压为 320mOsmo/L。
全文摘要
本发明涉及一种猪精液稀释防冻剂，属于动物繁殖技术领域。防冻剂由N-乙酰基-D-葡萄糖胺，透明质酸、氨基-钠-十二烷基硫酸酯、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、杀菌剂及蒸馏水等配制而成。其中N-乙酰基-D-葡萄糖胺能促进氨基-钠-十二烷基硫酸酯的乳化功能，增强氨基-钠-十二烷基硫酸酯及卵黄的保护作用，透明质酸、氨基-钠-十二烷基硫酸酯能有效抑制冻融精子质膜和DNA的损伤率，提高冻融精子的质量，葡萄糖为精子在体外代谢的能量来源，柠檬酸钠可维持稀释防冻剂环境与精子内环境的渗透压平衡。本发明能有效延长猪精子超低温冷冻保存的存活时间，提高猪冻融精子的活力、质膜完整性及顶体完整性。
文档编号C12N5/06GK101392236SQ200810202319
公开日2009年3月25日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者李新红, 王亮亮 申请人:上海交通大学