专利名称：一种重组表达可溶性转录中介体复合物Med23亚基的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种重组表达可溶性转录中介 体复合物Med23亚基的方法。
背景技术：
哺乳动物转录中介体复合物(Mediator Complex)由30多个亚基组成，是介于转 录因子与RNA聚合酶II(Pol II)之间传递信息的桥梁。不同的转录因子通过与Mediator 的特定亚基相互作用从而调控基因的表达。Med23是其中一个重要亚基，因此对于Med23的 功能研究是非常重要的。然而Med23的重组表达非常困难，而从天然来源中分离蛋白不仅 规模小，获得的蛋白量也非常有限，大大限制了其研究和应用。 在以往的重组表达研究中，用一般的大肠杆菌表达系统以及昆虫病毒表达系统均 难以得到可溶性的Med23蛋白，并且通常原核表达系统获得的蛋白往往缺乏较好的空间构 象和基本的糖基化修饰，与天然蛋白相差甚远。 因此，本领域有必要进行进一步的研究，找到表达可溶性的Med23蛋白的新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶性表达转录中介体蛋白亚基Med23的方法。
本发明的另一目的在于提供可用于可溶性表达转录中介体蛋白亚基Med23的一 种重组昆虫杆状病毒。 在本发明的第一方面，提供一种表达可溶性转录中介体蛋白亚基Med23(Flag-转 录中介体蛋白亚基Med23)的方法，所述方法包括 (1)提供一重组昆虫杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所 述的重组表达盒含有(5' —3' ) :Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码 序列； (2)将(1)所述的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之 表达Flag-转录中介体蛋白亚基Med23 ;禾口 (3)分离获得可溶性Flag-转录中介体蛋白亚基Med23。
在另一优选例中，所述的重组昆虫杆状病毒如下制备 (A)将Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列(符合读框顺 序)克隆入杆粒中，获得重组的杆粒； (B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；禾口
(C)收获重组的杆状病毒。 在本发明的另一优选例中，所述的杆粒为Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid 来源于大肠杆菌DH10Bac。 在另一优选例中，在步骤(A)中，Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基 Med23编码序列在转座酶的作用下重组入Bacmid杆粒中mini-attTn7位点。更优选的，所述的转座酶由大肠杆菌DH10Bac中携带的辅助质粒(helper)所表达。 在另一优选例中，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得 (a)将Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列插入穿梭载
体(优选的为pFASTBac-HTc载体)的多克隆位点中，获得插入了 Flag蛋白的编码序列和
转录中介体蛋白亚基Med23编码序列的重组载体； (b)将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DHlOBac，获得转化的宿主细胞，所述转 化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述重组杆粒携带Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋 白亚基Med23编码序列；禾口 (c)从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。 在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的重组表达盒中，在Flag蛋白的编码序列的 5'端，还含有一 His纯化标签(优选为6XHis标签)编码序列。 在另一优选例中，在步骤(3)中，采用Ni-NTA柱纯化Flag-转录中介体蛋白亚基 Med23，获得第一纯化产物。 在另一优选例中，还包括对第一纯化产物进一步采用带有抗Flag蛋白的抗体的 琼脂糖柱纯化，获得第二纯化产物，即为纯化的Flag-转录中介体蛋白亚基Med23 (纯度高 于90% )。 在另一优选例中，所述方法还包括(4)将Flag-转录中介体蛋白亚基Med23中 Flag切割去除，获得转录中介体蛋白亚基Med23。
在另一优选例中，所述的昆虫细胞是Hi5细胞。 在本发明的第二方面，提供一种重组昆虫杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中 含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有(5' — 3' ) :Flag蛋白的编码序列，转录中介体 蛋白亚基Med23编码序列。 在另一优选例中，在Flag蛋白的编码序列的5'端，还含有一 His纯化标签编码序 列。 在另一优选例中，所述的重组表达盒中，5'端还包含一可操作性相连的启动子；3' 端还包含以可操作性相连的终止子。 在另一优选例中，所述的杆状病毒的基因组含有Bacmid DNA，所述BacmidDNA中 含有所述重组表达盒， 在本发明的第三方面，提供所述的重组昆虫杆状病毒的用途，用于制备可溶性转 录中介体蛋白亚基Med23。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1.表达纯化鉴定Mediator复合物亚基Med23。 a) —步纯化后SDS PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。同样的样品用Med23的抗体做免 疫印迹。 b)两步纯化后银染示意图，从箭头处割胶做质谱鉴定。 图2. GST沉降检测重组蛋白的活性，用Hela细胞核抽提物(a)和一步纯化的
4His-flag-Med23 (b)分别和GST-E1A和GST-E1A (H160Y)孵育，WB检测发生沉降的Med23。
图3.重组表达的Med23-NTA亲和柱沉降可溶的GST-E1A (a)和GST-Elkl (b)。
图4.用大肠杆菌表达系统表达His-Flag-Med23的电泳鉴定，可见诱导前后均没 有Med23可溶性表达。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现采用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞来 表达转录中介体蛋白亚基Med23，并且在转录中介体蛋白亚基Med23编码序列的5'端加 上一 Flag标签编码序列，可表达获得可溶性的Med23蛋白，该蛋白保留了良好的功能活性 (也即接近于天然的Med23蛋白)。本发明第一次表达出了可溶性的Med23蛋白，有效地解 决了现有技术中难以可溶性表达Med23蛋白的技术难题。
转录中介体复合物Med23亚基 如本文所用，"转录中介体复合物(Mediator Complex)Med23亚基"，"转录中介体 蛋白亚基Med23"，"Med23蛋白"可互换使用。由于Flag是一段较短的肽，其除了有助于 Med23蛋白的可溶性表达外，对于Med23蛋白的功能活性没有影响，因此在本发明的有些部 分中，所述的Med23蛋白也指一种包含了Flag序列的融合蛋白，称为"Flag-转录中介体蛋 白亚基Med23"或"Flag-Med23"。 哺乳动物转录中介体复合物由30多个亚基组成。Med23蛋白是哺乳动物转录中介 体复合物中一种重要的亚基。Med23蛋白是介于转录因子与RNA聚合酶II(Poin)之间传 递信息的桥梁。 所述的Med23蛋白可以来源于各种哺乳动物，它们具有很高的同源性。作为本发 明的优选方式，所述的Med23蛋白是人源的Med23蛋白。 作为本发明的优选方式，所述的Med23蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号 为AAD31729. 1提供的序列基本上相同。所述的Med23基因的核苷酸序列可以与GenBank 登录号为AF105332提供的序列的序列基本上相同。
Flag标签 如本文所用，所述的"Flag标签"，"Flag-tag", "Flag蛋白"可互换使用，均是指氨 基酸序列如"DYKDDDDK"的蛋白。 本发明人在研究中意外发现，所述的Flag标签有助于Med23蛋白在病毒体系中的 可溶性表达。 此外，所述的Flag标签对于Med23蛋白的下游纯化也是非常有用的。例如可以采 用抗-Flag抗体来纯化Flag-Med23，所述的抗-Flag抗体是商业化的，易于获得。
重组昆虫杆状病毒 本发明提供了一种重组的昆虫杆状病毒，其可用于感染昆虫细胞而获得重组 Med23蛋白(Flag-Med23蛋白)。所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重 组表达盒含有(5' —3' ) :Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码序列。
作为本发明的优选方式，所述的重组表达盒中，在Flag蛋白的编码序列的5'端还 含有一His纯化标签(优选为6XHis标签)编码序列。所述的重组表达盒中，5'端还包含 一可操作性相连的启动子；3'端还包含以可操作性相连的终止子。
本发明中，所述的Med23蛋白编码序列、Flag蛋白编码序列、His标签编码序列以 及必要的启动子序列、终止子序列等均是操作性相连的。所述的"操作性相连"或"可操作 地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其 它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
作为本发明的优选方式，所述重组昆虫杆状病毒通过以下步骤制备(A)将Flag 蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒； (B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和(C)收获重组的杆 状病毒。 作为本发明的优选方式，所述的杆粒是Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来 源于大肠杆菌DH10Bac。 作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自Hi5昆虫细胞，sf9昆虫细胞， HighFive昆虫细胞；最优选的，所述昆虫细胞是Hi5昆虫细胞。 作为本发明的优选方式，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得(a) 将Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列插入穿梭载体(优选的为 pFASTBac-HTc载体)的多克隆位点中，获得插入了 Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白 亚基Med23编码序列的重组载体；(b)将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DH10Bac，获得 转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述重组杆粒携带Flag蛋白的编 码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列；和(c)从所述转化的宿主细胞中提取重组 杆粒。 作为本发明的更优选方式，所述的重组昆虫杆状病毒是通过将目的基因(包括 Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列)克隆进入pFASTBac的多克 隆位点内，然后将pFASTBac转化DH10Bac基因工程菌，在转座酶的作用下发生重组，获得 杆粒后转染昆虫细胞获得的。将这种病毒感染昆虫细胞后数小时，病毒即可进入昆虫细胞， 开始复制病毒，并且转录病毒重组区域中蛋白翻译区的核酸序列，在该段序列中含有目的 基因序列。感染约2-4天后表达具有病毒重组区域中蛋白翻译区所对应的氨基酸序列的蛋 白，该段序列中含有Med23的氨基酸序列。 更优选的，所述的蛋白翻译区核酸序列的末端还包含编码纯化标签(如Histag) 以及酶切克隆位点的序列，从而便于后续的克隆以及纯化，本领域人员均了解如何在待表 达的外源基因的两端设置纯化标记以及克隆位点，这种纯化标记以及克隆位点也可以是表 达载体自带的。 本发明的整合有Med23编码基因的重组昆虫杆状病毒可以稳定地传代，低温下可 以长期保存并具有高的滴度。利用该病毒感染昆虫细胞后2-5天可以得到高表达的Med23 蛋白(Flag-Med23蛋白)。 此外，在所述的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞并表达Med23蛋白后，还可以通 过例如密度梯度离心等方法从培养物中回收重组昆虫杆状病毒，用于下次感染。
表达和纯化可溶性Med23蛋白的方法 本发明人在研究中发现，采用大肠杆菌(如BL21)原核系统表达Med23蛋白是无 法实现的，Med23蛋白不能很好地溶解；采用真核表达系统或酵母表达系统等成本高且也 存在同样的难溶难题。在经过反复研究和优化后，终于发现将Med23编码序列的5'端加上一段Flag标签编码序列，并采用昆虫杆状病毒表达系统来表达可获得可溶性的Med23蛋白 (N端带有一 Flag标签，也称为Flag-Med23蛋白)，且表达量高，表达稳定，并且蛋白结构、 功能活性均接近于天然蛋白。 因此，本发明人提供了一种制备可溶性Med23蛋白的方法，该方法包括步骤
(1) 提供一重组昆虫杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重 组表达盒含有(5' —3') :Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码序列；
(2) 将(1)所述的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达 Flag-Med23 ;和(3)分离获得可溶性Flag-Med23。 在本发明的优选方式中，在Flag-Med23蛋白的氨基端设置有组氨酸标签(6XHis tag)，以便于蛋白的纯化。例如，可以用Ni-NTA柱进行纯化，用咪唑洗脱获得目的蛋白。如 果需要，所述的纯化标签也可以在纯化完成后从蛋白上去除，去除方法是本领域人员熟知 的，例如通过专一性的蛋白酶实现切除。对于某些应用，组氨酸标签无需切除。
在获得可溶性的Flag-Med23后，如果需要，可以采用本领域已知的方法从纯化后 的蛋白上去除Flag，例如通过专一性的蛋白酶实现切除。Flag具有内在的肠激酶识别位 点，因此可应用肠激酶来专一性切除Flag。对于某些应用，Flag无需切除。
可溶性Med23蛋白的应用 采用本发明的方法得到的Med23可溶蛋白可应用于药物的筛选，与其它蛋白相互 作用位点的鉴定，以及对Med23亚基的结构生物学分析。可结合亲和柱层析和质谱等手段 能发现新的与靶蛋白相互作用的蛋白质。 Med23和Elkl的相互作用偶联了脂肪细胞分化过程中的信号转导通路与基因表 达网络，控制了细胞的生长分化，是潜在的药物靶标。为了鉴定Med23和Elkl的相互作用 位点，可以进行NMR和Biacore实验来分析参与相互作用的残基，以及进行相互作用的动力 学分析。同时可以用来进行药物筛选。 可利用所述的重组昆虫杆状病毒结合NTA亲和柱，将ES以及Hela细胞核抽提物 过柱，跑SDS-PAGE胶分离蛋白，用LTQ仪器质谱分析已得到一些有可能与Med23发生相互 作用的蛋白数据。进一步的验证正在进行中。用该方法能得到一些潜在的可能与Med23有 相互作用的新的核蛋白，为揭示其功能打下了基础。 可利用所述的重组昆虫杆状病毒系统大量表达纯化可溶的Med23亚基，蛋白经过
超滤浓縮等步骤，在合适的条件下得到蛋白质晶体，对晶体进行x-射线衍射，从而为诠释
Med23的结构打下基础。 本发明的主要优点在于 (1)首次发现采用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞来表达Med23蛋白，并且在Med23编 码序列的5'端加上一 Flag标签编码序列，可表达获得可溶性的Med23蛋白，其接近于天然 的Med23蛋白，保留了良好的生物活性。 (2)对于利用杆状病毒感染昆虫细胞来表达Med23蛋白的工艺及其纯化工艺进行 了优化，从而可稳定且大量地获得Med23蛋白。 (3)本发明人的新发现解决了现有技术中难以可溶性表达Med23蛋白的技术难
题，第一次重组表达出可溶性Med23蛋白，为研究Med23的生物学功能奠定了基础。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1.用重组昆虫杆状病毒从昆虫细胞获得可溶的人转录中介体复合物 Med23亚基蛋白
1.重组病毒 以pcDNA3-f lag-med23基因质粒(获自UCLA， Arnold J. Berk实验 室)为模板，以上游引物5'AACTCGAGATGCCAGACTACAAGGAC 3'和下游引物 5' GGCTCGAGCTTTCACTGAGTTACTGGTA3'为引物PCR扩增获得含有flag-Med23基因序列的扩 增产物，直接插入到pMD-18T载体购(购自Takara)中，用xhol酶切该重组载体，获得含有 flag-Med23基因序列的产物。 上述获得的含有flag-Med23基因的产物经过Xhol酶切后插入载体 pFastBacHTc (Invitrogen)的XhoI位点。重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac (Invitrogen)，筛 选得到含有Med23-Bacmid DNA的阳性菌株。从阳性杆粒菌中抽提获得Med23-Bacmid DNA， 电泳验证获得所需的DNA。 将上述获得的Med23-Bacmid DNA转染贴壁培养昆虫细胞Hi5 (Tn5)(购自 Invitrogen) ， 27"C培养72小时后，获得Med23-杆状病毒(Baculovirus)。
2.可溶性6Xhis-flag-Med23(h-f-Med23)蛋白的产生 上述获得的Med23-Baculovirus感染昆虫细胞Hi5，感染后27 °C培养72小 时。离心收集细胞，用裂解缓冲液(20mM HEPES-K0H pH7. 9 ;0. 1 % Tritonx-100 ; 5mMP -巯基己醇；10mM PMSF)裂解细胞。15， 000rpm离心30分钟。取上清细胞裂解液上 Ni-NTA (Invitrogen)柱纯化，250mM咪唑洗脱，收集洗脱液，作SDS-PAGE和Western Blot 分析鉴定，结果见图la。
3. h-f-Med23蛋白的质谱鉴定 用带抗-flag M2抗体的琼脂糖树脂(Sigma-Aldrich)进一步纯化上述一步纯化 的h-f-Med23蛋白，150ng/ml FLAG肽洗脱h-f-Med23，作SDS-PAGE和银染。从胶上割取 150KD h-f-Med23蛋白，LTQ仪器质谱分析，鉴定为人转录中介体复合物Med23亚基，见图 lb。 实施例2.鉴定分析利用重组昆虫杆状病毒体外表达纯化的Med23的功能活性
Med23被报导能够分别和腺病毒E1A蛋白和细胞内源转录因子Elkl发生相互作 用。因此通过GST沉降技术(GST Pull Down)测定重组Med 23与E1A蛋白或Elkl蛋白的 相互作用情况来分析重组Med 23的功能活性。以常规方法从Hela细胞(ATCC)的细胞中 抽提的细胞核抽提物(含有Med23)作为阳性对照。 采用常规的方法，将E1A蛋白序列(参见GenBank登录号AY339865. 1)第 121aa-223aa位的编码序列连入pGEX_5x_3 (购自Amersham Pharmacia公司)的BamHl/ EcoRl位点，获得重组表达GST-E1A的表达载体(该GST-E1A获自UCLA， Arnold J. Berk实
8验室)，将所述表达载体转化大肠杆菌BL21，原核表达获得GST-EIA蛋白，IPTG诱导，常规 方法纯化表达产物获得GST-EIA蛋白。将纯化后的GST-EIA蛋白与琼脂糖珠(购自Sigma) 共孵育，GSH洗脱。获得GST-EIA珠。 将两步纯化的Med23蛋白溶液孵育GST-EIA珠，E1A CR3能够和重组Med23发生 相互作用，而H160Y这个突变破坏了相互作用所需的锌指结构，GST-E1A(H160Y)(制备方法 与前述类似)不能被重组Med23沉降，见图2b。因此，重组的可溶Med23和细胞核抽提物中 的Med23具有相同的结合E1A的活性，见图2a。 GST-Elkl构建方法人hela细胞抽取RNA，反转录得到cDNA，从人cDNA中扩增对 应于Elkl蛋白(参见Gene ID :2002 ;mRNA序列见NMJ)Ol 114123. 1))中第307aa-428aa 位序列的编码序列。连接入pGEX-4t-2 (购自AmershamPharmacia公司)中的BamHl/Notl 位点。扩增引物上游5' TATGGATCCatctcccagccgcagaagggccgga 3，;下游5' TGGGCGGC CGCtcatggcttctggggccctggggag 3'将上述构建的重组载体转化大肠杆菌BL21，原核表达 获得GST-Elkl蛋白，IPTG诱导，常规方法纯化表达产物获得GST-Elkl蛋白。将纯化后的 GST-Elkl蛋白与琼脂糖珠(购自Sigma)共孵育，GSH洗脱。获得GST-Elkl可溶蛋白。
通过His亲和柱纯化的His-Flag-Med23重组蛋白来沉降GST-E1A或者GST-Elkl 融合蛋白。 结果发现在细胞外，该重组表达的Med23能与E1A的CR3结构域相互作用，而E1A 的H160Y突变形式，由于破坏了相互作用所需要的锌指结构，与Med23的相互作用大大减 弱，见图3a。同样的，重组的Med23能和体外用Erk2激酶(购自NEB)磷酸化的Elkl相互 作用，而不加Erk2处理的Elkl不能与重组的Med23发生相互作用，见图3b。这些结果证明 了重组表达的Med23具有与转录因子的结合活性。
实施例3.利用原核系统表达Med23蛋白的研究 如实施例的方法获得含有Flag-Med23的基因序列的产物，经过xhol酶切后插 入PET28(+)载体(Invitrogen)的XhoI位点。测序正确后，将重组质载体转化大肠杆菌 BL-21，加IPTG诱导，菌液用超声破碎，分别得到上清和沉淀。用抗flag的抗体检测。
检测结果如图4所示，可见上清中没有目标蛋白。诱导之后的蛋白全在沉淀里，并 且已经发生降解。用抗Med23的抗体检测后得到的结果类似。因此用大肠杆菌表达系统表 达His-Flag-Med23得不到可溶的蛋白。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
权利要求
一种表达可溶性转录中介体蛋白亚基Med23的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一重组昆虫杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒按照5’→3’含有Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码序列；(2)将(1)所述的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达Flag-转录中介体蛋白亚基Med23；和(3)分离获得可溶性Flag-转录中介体蛋白亚基Med23。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组昆虫杆状病毒如下制备(A) 将Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；(B) 将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；禾口(C) 收获重组的杆状病毒。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得(a) 将Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列插入穿梭载体的多克隆位点中，获得插入了Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列的重组载体；(b) 将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DH10Bac，获得转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述重组杆粒携带Flag蛋白的编码序列和转录中介体蛋白亚基Med23编码序列；禾口(c) 从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的重组表达盒中，在Flag蛋白的编码序列的5'端，还含有一 His纯化标签编码序列。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用Ni-NTA柱纯化Flag-转录中介体蛋白亚基Med23，获得第一纯化产物。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括对第一纯化产物进一步采用带有抗Flag蛋白的抗体的琼脂糖柱纯化，获得第二纯化产物，即为纯化的Flag-转录中介体蛋白亚基Med23。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆虫细胞是Hi5细胞。
8. —种重组昆虫杆状病毒，其特征在于，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒按照5' —3'含有Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码序列。
9. 如权利要求8所述的杆状病毒，其特征在于，在Flag蛋白的编码序列的5'端，还含有一 His纯化标签编码序列。
10. 权利要求8或9所述的重组昆虫杆状病毒的用途，其特征在于，用于制备可溶性转录中介体蛋白亚基Med23。
全文摘要
本发明涉及一种重组表达可溶性转录中介体复合物Med23亚基的方法所述方法包括(1)提供一重组昆虫杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有Flag蛋白的编码序列，转录中介体蛋白亚基Med23编码序列；(2)将(1)所述的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达Flag-转录中介体蛋白亚基Med23；和(3)分离获得可溶性Flag-转录中介体蛋白亚基Med23。本发明第一次表达出了可溶性Med23蛋白，解决了现有技术中难以可溶性表达Med23蛋白的技术难题。
文档编号C12N7/01GK101736006SQ20081020300
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月20日 优先权日2008年11月20日
发明者杨冠珍, 王纲, 黄燕 申请人:中国科学院上海生命科学研究院