专利名称：：一种电化学活性菌株的分离及电化学活性的检验方法
技术领域：
：本发明涉及微生物分离及检验方法。技术背景微生物燃料电池是一种利用生物质及微生物进行电能生产的新型装置，通过微生物的催化氧化作用，实现了化学能与电能的直接转化，在整个能量转换的过程中，微生物形成的阳极生物膜是产电的关键部位，也是限速环节。具有电化学活性菌株，可以迅速吸附于阳极表面，生长繁殖，使得阳极形成生物膜的时间大大縮短，更重要的是，它活性的高低将直接影响电池的输出电压及能量转化效率。在所有外部条件一致下，活性高的菌株，可以使底物在短时间内充分彻底被利用，能量转化率高，输出的功率密度也随之升高，因此，分离筛选阳极生物膜中的微生物，获得电化学活性较高的菌株，成为提高功率密度和库仑效率的有效途径之一，也是微生物燃料电池研究的重点。此外，获得高效的产电菌，将会极大地推动微生物燃料电池的机理研究，除了可以弄清微生物对有机质的催化作用及影响因素外，还能够研究探索电子在微生物细胞内外及阳极间的转移方式及传递途径。但是现有的电化学活性菌株的分离筛选方法，还存在以下几个问题1、现有电化学活性菌株的分离多采用营养肉汤培养基，培养基成分单一，不利于电化学活性菌株的生长，且获得菌株电化学活性低；2、电化学活性菌株多采用倍比稀释的分离纯化方法，所获得的微生物菌株数量少，无法直观观察到分离出菌株的形貌特性，分离纯化过程中容易染菌，获得单菌落的成功率低；3、分离出电化学活性菌株后，采用回投至灭菌反应器的方法进行电化学活性的检验，操作繁琐，筛选周期长。
发明内容本发明公开了一种电化学活性菌株的分离及检验方法，解决了电化学活性菌株分离中培养基成分单一，不利于电化学活性菌株生长，分离纯化成功率低，且很难获得高效的产电菌，电化学活性菌株检验操作繁琐，筛选周期长的问题。电化学活性菌株的分离方法按以下步骤进行一、在无菌条件下，剪下微生物燃料电池的阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于25~32°C条件下，培养24天；二、取lmL步骤一培养得到的菌液进行倍比稀释；三、取0.52mL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中，使菌液均匀分布在整个固体培养基上，然后在283rC条件下培养5~10天；四、挑取步骤三亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在2532。C条件下培养24天，得到的菌液即为电化学活性菌株；其中步骤一中的每1000mL的液体培养基含有10~20g的葡萄糖、2~4g的胰蛋白胨、24g的牛肉膏、l~1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l2g的K2HPO4、0.10.3g的MgCl2、0.1~0.25g的FeS04*7H20、3~7mL的维生素液、10~14mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液；步骤三中的每1000mL的固体培养基含有1020g的琼脂、10~20g的葡萄糖、2~4g的胰蛋白胨、2~4g的牛肉膏、l~1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l~2g的K2HP04、0.1~0.3g的MgCl2、0.1~0.25g的FeS(V7H20、3~7mL的维生素液、10~14mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。电化学活性菌株的检验方法按以下步骤进行将菌液放入进水溶液中混合，再将混合溶液放入反应器中，在-800mV+700mV电位范围内进行循环伏安扫描，扫描速度为1025mV/s，扫描2~5次，即检验了菌株的电化学活性；其中每1000mL进水液含有23g的葡萄糖、3~7mL的维生素液、1015mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液，然后在110~115°C灭菌25~35min。本发明在液体培养基中添加了维生素液和微量元素液，液体培养基组成成分丰富，与营养肉汤培养基相比，在操作方法、培养条件基本相同的情况下，本发明的液体培养基有利于电化学活性菌株生长，分离得到的菌株数量提高了40%以上，且分离得电化学菌株的最大电压达到200mV以上，分离得到的菌株电化学活性高；本发明电化学活性菌株的筛选方法中，倍比稀释后采用亨盖特滚管技术分离，获得微生物菌株数量多且菌落分散，能够直观观察到分离出菌株的形貌特性，分离纯化过程不易染菌，分离的成功率高。本发明电化学活性菌株的检验方法采用循环伏安法检测菌株的电化学活性，检验方法简单，容易掌握，在反应装置、反应条件、进水液和菌液浓度均保持不变时，反应的强弱表征了菌株电化学活性的高低。峰电势差越大，峰面积越大，该菌的电化学活性越高，本发明的电化学活性菌株的检验方法与现有的回投至反应器的检验方法相比较，节省了时间和工作量，縮短/筛选周期。图1根据具体实施方式一滚管的菌落附着图；图2根据具体实施方式二十四分离出FLL2-2、FLL2-3和FLL2-5三株菌株的电压曲线，其中1号曲线为菌株FLL2-2的电压曲线，2号曲线为菌株FLL2-3的电压曲线，3号曲线为菌株FLL2-5的电压曲线；图3根据具体实施方式二十八分离出A2、A3和A5三株菌株的曲线图，其中-令-表示A2的电压曲线，力-表示A2的极化曲线，表示A3的电压曲线，-0-表示八3的极化曲线，-A-表示A5的电压曲线，-A-表示A5的极化曲线；图4根据具体实施方式三十一循环伏安法检验菌株FLL2-11和FLL2-12的循环伏安曲线，其中1号曲线为菌株FLL2-11的循环伏安曲线，2号曲线为菌株FLL2-12的循环伏安曲线，3号曲线为无菌进水液的循环伏安曲线；图5根据具体实施方式三十一循环伏安法检验菌株FLL2-14和FLL2-16的循环伏安曲线，其中1号曲线为菌株FLL2-16的循环伏安曲线，2号曲线为FLL2-14的循环伏安曲线，3号曲线为无菌进水液的循环伏安曲线；图6根据具体是实施方式三H^—将FLL2-11、FLL2-12、FLL2-14和FLL2-16回投反应器中检验菌株的电化学活性结果的极化曲线图，其中-令-表示FLL2-11的极化曲线图，-A-表示FLL2-12的极化曲线图，-o-表示FLL2-14的极化曲线图，-口-表示FLL2-16的极化曲线图。图7为本发明的液体培养基分离出的FLL-IO、FLL-2和FLL-13三株菌株的电压曲线，其中曲线1为菌株FLL-10的电压曲线，曲线2为菌株FLL-2的电压曲线，曲线3为菌株FLL-13的电压曲线；图8为现有的肉汤培养基分离出的FLH-IO、FLH-2和FLH-ll三株菌株的电压曲线，其中1号曲线为菌株FLH-10的电压曲线，2号曲线为菌株FLH-2的电压曲线，3号曲线为FLH-11的电压曲线；具体实施方式具体实施方式一本实施方式电化学活性菌株的分离按以下步骤进行一、在无菌条件下，剪下微生物燃料电池的阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于2532。C条件下，培养24天；二、取lmL步骤一培养得到的菌液进行倍比稀释；三、取0.5~2mL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中，使菌液均匀分布在整个固体培养基上，然后在283rC条件下培养510天；四、挑取步骤三亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在25~32°C条件下培养24天，得到的菌液即为电化学活性菌株；其中步骤一中的每1000mL的液体培养基含有10~20g的葡萄糖、24g的胰蛋白胨、2~4g的牛肉膏、l~1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l~2g的K2HP04、0.1~0.3g的MgCl2、0.1~0.25g的FeS047H20、3~7mL的维生素液、10~14mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液；步骤三中的每lOOOmL的固体培养基含有10~20g的琼脂、10~20g的葡萄糖、24g的胰蛋白胨、2~4g的牛肉膏、l~1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l2g的K2HPO4、0.10.3g的MgCl2、0.10.25g的FeS04*7H20、37mL的维生素液、1014mL微量元素液和0.05mo1、pH为7的PBS缓冲液。本实施方式分离纯菌落的滚管菌落附着图如图1所示，从图1可以看出滚管中的菌落分散，能够直观观察到菌落的大小、形态，在分离纯化过程中不易染菌，分离的成功率高。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中在无菌条件下，剪下25mmS的微生物燃料电池的阳极。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中倍比稀释的倍数为103~107倍。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一的每1000mL的液体培养基中含有15g的葡萄糖、3g的胰蛋白胨、3g的牛肉膏、1.2g的酵母、5g的NaCl、1.5g的K2HP04、0.2g的MgCl2、0.15g的FeS04*7H20、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一的液体培养基中的维生素液中叶酸的浓度为0.00002g/L、维生素H的浓度为0.00002g/L、维生素B6的浓度为0.0001g/L、维生素B12的浓度为0.000001g/L、维生素的浓度为0.00005g/L、核黄素的浓度为0.00005g/L、硫辛酸的浓度为0.00005g/L和P-氨基苯酸的浓度为0.00005g/L;微量元素液中Na2W04'2H20的浓度为0.00025g/L、NiCl2'6H20的浓度为0.00025g/L、H3B04的浓度为0.0001g/L、KAl(SO4)2'10H2O的浓度为O.OOOlg/L、CuS04'5H20的浓度为0.0001g/L、CoCl2*2H20的浓度为0.0001g/L、CaCl2'2H20的浓度为0.0001g/L、Fe2(S04)3-7H20的浓度为0.0001g/L、ZnCl2的浓度为0.0013g/L、MgS04'7H20的浓度为0.03g/L、MnS04'H20的浓度为0.005g/L和NaCl的浓度为0.01g/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一的每lOOOmL的液体培养基含有0.52g的半胱氨酸、10~20g的葡萄糖、2~4g的胰蛋白胨、2-4g的牛肉膏、l-1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l~2g的K2HP04、0.10.3g的MgCl2、0.1~0.25g的FeS(V7H20、37mL的维生素液、1014mL微量元素液、0.01~0.1ml的刃天青和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一不同的是每lOOOmL步骤一中的液体培养基中含有20~50mmol的氧化铁、20~50mmol柠檬酸铁或者20~50mmol的延胡索酸。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式的液体培养基中投加电子受体有利于分离出高效的产电菌，分离得到的电化学活性菌株的电压均在200mV以上，其中有部分电化学活性菌株的电压在300mV以上。具体实施方式八本实施方式电化学活性菌株的检验按以下步骤进行将菌液放入进水溶液中混合，在-800mV~+700mV电位范围内进行循环伏安扫描，扫描速度为10~25mV/s的反应器中，扫描25次，即检验了菌株的电化学活性；其中每lOOOmL进水液含有2~3g的葡萄糖、3~7mL的维生素液、10~15mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液，然后在110~115°C灭菌25~35min。本实施方式中的反应器是一个圆形玻璃器皿，上口用橡胶塞塞紧，塞子上装有工作电极、参比电极和辅助电极三个电极，其中工作电极为玻碳电极，辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极；将混合溶液装入反应器中，曝氮气30min，而后将反应器的三个电极分别用导线与电化学工作站的三个接线柱相连，然后在-800mV~+700mV电位范围内进行循环伏安扫描，扫描速度为10~25mV/s、扫描次数为2~5次。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式八不同的是每1000mL进水液含有2.5g的葡萄糖、5mL的维生素液、12.5mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一不同是步骤一中在无菌条件下，剪下3mn^的微生物燃料电池的阳极。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一不同是步骤一中在无菌条件下，剪下4mr^的微生物燃料电池的阳极。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式一不同是步骤一在无菌条件下，剪下微生物燃料电池的阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于29。C条件下，培养4天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十三:本实施方式与具体实施方式一不同是步骤一在无菌条件下，剪下微生物燃料电池的阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于30。C条件下，培养3天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式一不同是步骤二中倍比稀释的倍数为103倍。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式一不同是步骤二中倍比稀释的倍数为106倍。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十六本实施方式与具体实施方式一不同是步骤二中倍比稀释做3个平行的倍比稀释。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十七:本实施方式与具体实施方式一不同是步骤三中取lmL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十八:本实施方式与具体实施方式一不同是步骤三中取2mL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十九本实施方式与具体实施方式一不同是步骤三中亨盖特滚管在29'C条件下培养8天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十本实施方式与具体实施方式一不同是步骤三中亨盖特滚管在3(TC条件下培养7天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十一本实施方式与具体实施方式一不同是步骤四中挑取亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在29。C条件下培养4天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十二本实施方式与具体实施方式一不同是步骤四中挑取亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在30°C条件下培养3天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十三本实施方式与具体实施方式一不同是液体培养基按比例由lg的半胱氨酸、15g的葡萄糖、3g的胰蛋白胨、3g的牛肉膏、1.2g的酵母、5g的NaCl、L5g的K2HP04、0.2g的MgCl2、0.15g的FeS04*7H20、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液、lOOOmL的pH为7的PBS缓冲液和0.05ml的刃天青制成，且步骤一、二、三和四均在已灭菌的厌氧操作箱中进行。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十四本实施方式与具体实施方式一不同是每1000mL步骤一中的液体培养基中含有35mmo1的氧化铁。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式分离得到FLL2-2、FLL2-3和FLL2-5三株菌株，对这三株菌株的电化学活性进行检验，检验结果如图2所示，1号曲线为菌株FLL2-2的电压曲线，最高电压345mV;2号曲线为菌株FLL2-3的电压曲线，最高电压247mV;3号曲线为菌株FLL2-5的电压曲线，最高电压250mV。在操作方法、培养条件基本相同的情况下进行对比实验，其中第一组向每1000mL本发明的液体培养基中投加35mmo1的氧化铁，即在液体培养基中投加电子受体；第二组是在本发明的液体培养基中不投加电子受体；这两组的对比实验结果如表1所示，从表1中可以看出投加电子受体的液体培养基分离出23株菌株，电压均在200mV以上，其中一株菌株的最高电压达到了328mV，从菌株产电能的角度看，投加电子受体后，功率密度提高了3.5倍，即菌株的产电能力提高了3.5倍。因此，投加电子受体后，分离出的菌株的电化学活性获得了极大的提高，分离得到高效的电化学活性菌株。表l投加电子受体前后对比<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>具体实施方式二十五本实施方式与具体实施方式一不同是每1000mL步骤一中的液体培养基中含有35mmd柠檬酸铁。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十六本实施方式与具体实施方式一不同是每1000mL步骤一中的液体培养基中含有35mmo1的延胡索酸。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式二十七本实施方式与具体实施方式六不同是具体实施方式六不同的是每1000mL步骤一中液体培养基中含有20~50mmol的氧化铁、20~50mmol拧檬酸铁或者20~50mmol的延胡索酸，且步骤一、二、三和四均在已灭菌的厌氧操作箱中进行。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。本实施方式分离得到的是电化学活性的厌氧菌株，厌氧液体培养基中加入电子受体，有利于电化学活性的厌氧菌株的生长，得到的电化学活性的厌氧菌株的最大电压均在200mV以上。具体实施方式二十八本实施方式与具体实施方式六不同是每1000mL步骤一中的液体培养基中含有35mmol的氧化铁，且步骤一、二、三和四均在已灭菌的厌氧操作箱中进行。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。本实施方式分离得到A2、A3、A5三株具有电化学活性的厌氧菌株，对这三株菌株的电化学活性进行检验，检验结果如图3所示，其中-令-表示A2的电压曲线，-^-表示A2的极化曲线，表示A3的电压曲线，.o-表示A3的极化曲线，-A-表示A5的电压曲线，-血-表示A5的极化曲线；从图3可以看出A2的最大功率密度为160.7mW/m2，外电阻为800Q;A3的最大功率密度为154.6mW/m2，外电阻为1000Q;A5最大功率密度为165.1mW/m2，外电阻为400Q。电化学活性高的菌株产生的功率密度越大，相对应的微生物燃料电池的内阻越低，体系的库伦效率越高，本发明的方法可在厌氧条件下分离并得到高效厌氧电化学活性菌株。具体实施方式二十九本实施方式与具体实施方式八不同的是电化学活性检验在厌氧操作箱中进行。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式检验的是电化学活性厌氧菌株。具体实施方式三十本实施方式电化学活性菌株的分离方法按照以下步骤进行一、在无菌条件下，剪下3mr^的微生物燃料电池阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于30。C条件下，培养3天；二、取lmL步骤一培养得到的菌液进行倍比稀释；三、取lmL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中，使菌液均匀分布在整个固体培养基上，然后在3(TC条件下培养7天；四、挑取步骤三亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在30°C条件下培养3天，即为电化学活性菌株；其中步骤一中的每1000mL的液体培养基中含有15g的葡萄糖、3g的胰蛋白胨、3g的牛肉膏、1.2g的酵母、5g的NaCl、1.5g的K2HP04、0.2g的MgCl2、0.15g的FeS04*7H20、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液；步骤三中的固体培养基是每1000mL步骤一中的液体培养基中含有10~20g的琼脂。具体实施方式三十一本实施方式电化学活性菌株的检验方法按照以下步骤进行将待检验的菌液稀释到相同浓度，然后将菌液放入进水溶液中混合，再将混合溶液放入电势范围为-800mV~+700mV、扫描速度为10~25mV/s的反应器中，扫描3次，即检验了菌株的电化学活性；其中每1000mL进水液含有2.5g的葡萄糖、5mL的维生素液、12.5mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液，然后在115。C灭菌30min。本实施检验的样品是FLL2-U、FLL2-12、FLL2-14和FLL2-16四株菌，这四株菌的菌液浓度用分光光度法测量，在600nm的波长下，以未加菌液的培养液作为空白液，测量培养后的菌液吸光度，换算出菌液的浓度，然后将这四株菌的菌液稀释到相同浓度。图4和图5为本实施方式检验菌株的循环伏安曲线，其中图4为循环伏安法检验菌株FLL2-11和FLL2-12的循环伏安曲线，1号曲线为菌株FLL2-11的循环伏安曲线，2号曲线为菌株FLL2-12的循环伏安曲线，3号曲线为无菌进水液的循环伏安曲线；其中图5为循环伏安法检验菌株FLL2-14和FLL2-16的循环伏安曲线，1号曲线为菌株FLL2-16的循环伏安曲线，2号曲线为FLL2-14的循环伏安曲线，3号曲线为无菌进水液的循环伏安曲线；从图4和图5中可知，这四株菌株的曲线都在I-OA附近出现了氧化还原峰，且峰电流相近，其中作为空白的无菌进水液的峰面积最小，其他纯菌峰面积均比相同条件下无菌迸水液大，说明这些菌均具有一定的氧化还原特性，这种氧化还原特性按从大到小排列为FLL2-11>FLL2-12>FLL2-14〉FLL2-16，即其电化学活性排序为FLL2-11>FLL2-12>FLL2-14>FLL2國16。将本实施方式检验的FLL2-11、FLL2-12、FLL2-14和FLL2-16四株菌株回投反应器中，验证其产电性是否与电压曲线的结果一致。反应器验证菌株的电化学活性结果如图6所示，其中-令-表示FLL2-11的极化曲线图，-A-表示FLL2-12的极化曲线图，-o-表示FLL2-14的极化曲线图，-口-表示FLL2-16的极化曲线图，从图6可以看出，其中FLL2-11的功率密度为229mW/m2、FLL2-12的功率密度为156mW/m2、FLL2-14的功率密度为153mW/m2、FLL2-16的功率密度为63mW/m2，按最高的功率密度从大到小排序为FLL2-11>FLL2-12>FLL2-14>FLL2-16，其电化学活性排序与图4和图5结果相同。因此，可通过循环伏安法测量出纯菌的氧化还原曲线，通过峰面积的大小初步判断出其产电能力的相对高低，即峰面积越大，峰电位越高，产电性能越好，该菌的电化学活性越高，采用循环伏安法方法检验电化学活性菌株操作简单，节省了时间和工作量，縮短了筛选周期。在操作方法、培养条件基本相同的情况下进行对比实验，其中第一组按本发明的液体培养基，即每1000mL的液体培养基中含有15g的葡萄糖、3g的胰蛋白胨、3g的牛肉膏、1.2g的酵母、5g的NaCl、1.5g的K2HP04、0.2g的MgCl2、0.15g的FeS(V7H2O、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液和0.05mo1、pH为7的PBS缓冲液。第二组按现有的营养肉汤培养基，即每lOOOmL营养肉汤培养基中含有5g的牛肉膏、5g的胰蛋白脾、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。对比试验结果如表1所示，从表1中可看出根据本发明的液体培养基进行分离筛选，共分出26株菌株，其中在200250mV有三株菌株，根据本发明的液体培养基分离筛选的FLL-IO、FLL-2和FLL-13三株菌株的电压曲线如图7所示，从图7可以看出这三株菌株的电压在均在200mV以上，其中曲线1为菌株FLL-10的电压曲线，最大电压213mV;曲线2为菌株FLL-2的电压曲线，最大电压225mV;曲线3为菌株FLL-13的电压曲线，最大电压212mV;从表1中可看出，采用现有的营养肉汤培养基进行分离筛选，共分离得到18株纯菌，其中在200-250mV没有菌株，在100~200mV有三株菌株，其中采用营养肉汤培养基分离得到的FLH-IO、FLH-2和FLH-ll这三株菌株的电压曲线如图8所示，从图8可以看出这三株菌株电压值在100200mV之间，其中1号曲线为菌株FLH-10的电压曲线，最大电压126mV;2号曲线为菌株FLH-2的电压曲线，最大电压105mV;3号曲线为菌株FLH-ll的电压曲线，最大电压128mV。综上所述，本发明的液体培养基，与营养肉汤培养基相比具有营养丰富的特点，适于电化学活性菌株生长，筛选出具有电化学活性的微生物菌株数量多，且分离得到的菌株电化学活性高。表2培养基对比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于电化学活性菌株的分离按以下步骤进行一、在无菌条件下，剪下微生物燃料电池的阳极，然后投入含灭菌的液体培养基的瓶中，密封置于25～32℃条件下，培养2～4天；二、取1mL步骤一培养得到的菌液进行倍比稀释；三、取0.5～2mL的倍比稀释液注入亨盖特滚管中，使菌液均匀分布在整个固体培养基上，然后在28～31℃条件下培养5～10天；四、挑取步骤三亨盖特滚管中的单菌落接种于液体培养基中，在25～32℃条件下培养2～4天，得到的菌液即为电化学活性菌株；其中步骤一中的每1000mL的液体培养基含有10～20g的葡萄糖、2～4g的胰蛋白胨、2～4g的牛肉膏、1～1.5g的酵母、3～6g的NaCl、1～2g的K2HPO4、0.1～0.3g的MgCl2、0.1～0.25g的FeSO4·7H2O、3～7mL的维生素液、10～14mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液；步骤三中的每1000mL的固体培养基含有10～20g的琼脂、10～20g的葡萄糖、2～4g的胰蛋白胨、2～4g的牛肉膏、1～1.5g的酵母、3～6g的NaCl、1～2g的K2HPO4、0.1～0.3g的MgCl2、0.1～0.25g的FeSO4·7H2O、3～7mL的维生素液、10～14mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。2、根据权利要求l所述的一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于步骤一中在无菌条件下剪下2~5mm2的微生物燃料电池的阳极。3、根据权利要求1或者2所述的一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于步骤二中倍比稀释的倍数为103~107倍。4、根据权利要求3所述的一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于步骤一的每lOOOmL的液体培养基中含有15g的葡^糖、3g的胰蛋白胨、3g的牛肉膏、1.2g的酵母、5g的NaCl、1.5g的K2HP04、0.2g的MgCl2、0.15g的FeS047H20、5mL的维生素液、12.5mL微量元素液和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。5、根据权利要求3所述的一种电化学活性菌株的分离方法，特征在于步骤一的液体培养基中的维生素液中叶酸的浓度为0.00002g/L、维生素H的浓度为0.00002g/L、维生素B6的浓度为'O.OOOlgZL、维生素B12的浓度为O.OOOOOlgZL、维生素B,的浓度为0.00005g/L、核黄素的浓度为0.00005g/L、硫辛酸的浓度为0.00005g/L和P-氨基苯酸的浓度为0.00005g/L;微量元素液中Na2W04'2H20的浓度为0.00025g/L、NiCl2'6H2O的浓度为0.00025g/L、H3BO4的浓度为0.0001g/L、KAl(SO4)2'10H2O的浓度为O.OOOlg/L、CuS04.5H20的浓度为0.0001g/L、CoCl2'2H20的浓度为0.0001g/L、CaCl2'2H20的浓度为0.0001g/L、Fe2(S04V7H20的浓度为0.0001g/L、ZnCl2的浓度为0.0013g/L、MgS04'7H20的浓度为0.03g/L、MnS04'H20的浓度为0.005g/L和NaCl的浓度为0.01g/L。6、根据权利要求3所述的一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于步骤一的每lOOOmL的液体培养基含有0.5~2g的半胱氨酸、10~20g的葡萄糖、2~4g的胰蛋白胨、2~4g的牛肉膏、l~1.5g的酵母、3~6g的NaCl、l~2g的K2HP04、0.1~0.3g的MgCl2、0.1~0.25g的FeS04*7H20、3~7mL的维生素液、10~14mL微量元素液、0.01~0.1ml的刃天青和0.05mol、pH为7的PBS缓冲液。7、根据权利要求3所述的一种电化学活性菌株的分离方法，其特征在于每lOOOmL步骤一中的液体培养基中含有20~50mmol的氧化铁、20~50mmol柠檬酸铁或者20~50mmol的延胡索酸。8、一种电化学活性菌株的检验方法，其特征在于电化学活性菌株的检验按以下步骤进行将菌液放入进水溶液中混合，再将混合溶液放入反应器中，在-800mV~+700mV电位范围内进行循环伏安扫描，扫描速度为10~25mV/s，扫描25次，即检验了菌株的电化学活性；其中每1000mL进水液含有2~3g的葡萄糖、37mL的维生素液、1015mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液，然后在U0115。C灭菌2535min。9、根据权利要求8所述的一种电化学活性菌株的检验方法，其特征在于每1000mL进水液含有2.5g的葡萄糖、5mL的维生素液、12.5mL的微量元素液和0.2mol、pH为7的PBS缓冲液。全文摘要一种电化学活性菌株的分离及电化学活性的检验方法，它涉及微生物分离及检验方法。它解决了电化学活性菌株的分离培养基营养成份单一，不利于电化学活性菌株的生长，分离得到的菌株电化学活性低，成功率低，菌株电化学活性的检验操作繁琐，筛选周期长的问题。本发明的分离方法一、富集培养；二、倍比稀释；三、亨盖特滚管分离；四、电化学活性菌株的纯化；本发明采用循环伏安法检验菌株的电化学活性。本发明的液体培养基营养丰富，利于电化学活性菌株的生长，分离得到的菌株数量多且电化学活性高；采用亨盖特滚管技术，菌落分散，菌株的大小、形态观察非常直观，分离成功率高；采用循环伏安法检在验电化学活性菌株的方法操作简单，缩短了筛选周期。文档编号C12Q1/04GK101407763SQ20081020956公开日2009年4月15日申请日期2008年11月28日优先权日2008年11月28日发明者于艳玲,何伟华,冯玉杰,刘尧兰,贺李申请人:哈尔滨工业大学