专利名称：针对CDK2基因siRNA重组体190的构建及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种RNAi重组质粒的构建及其在肿瘤基因治疗中 的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)技术是近几年发展起来的一种抑制耙 基因表达的新方法，它被认为从低等生物到高等生物都普遍存在的一种防御外源性核酸侵 扰的生理机制。RNAi是通过小分子双链RNA特异性互补靶向基因转录本，从而诱导基因 转录后沉默的一种技术。人工合成或细胞内转录生成的小的双链RNA(siRNA)或者发夹型 RNA (short hairpin RNA， shRNA)进入细胞后，能和与之互补的耙基因mRNA结合，从而介导 特异性的切割酶将mRNA降解，达到降低目的基因表达的目的。 目前RNAi技术已经广泛用于基因功能、信号转导通路方法以及肿瘤基因治疗的 研究领域。其在肿瘤基因治疗上与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统 的基因治疗方法相比，具有特异、高效、毒性小的特点，因此可用来对一些肿瘤进行治疗。
肿瘤的产生是丧失细胞机能调控的结果。生长信号的异常和细胞周期调控的异常 将导致细胞增殖的异常，最终产生恶性克隆。研究进展表明肿瘤共性的生物学特征是失控 性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。因此，可以说肿瘤 是细胞失控性生长所致的一类细胞周期性疾病。CDK2是细胞周期调控的核心分子，正常情 况下，CDK2在整个细胞周期中，保持非常恒定的水平，但是在细胞周期蛋白的调节下，它的 活性会发生变化。如果细胞周期蛋白持续过表达或CDK2的抑制蛋白表达下调，CDK2在细 胞周期中始终处于高活性状态，细胞周期处于失控状态，则细胞就无限增殖发生癌变。
基因上述研究，我们针对CDK2基因设计相应的序列，连接到质粒载体上，构建 siRNA重组表达质粒，将其导入肝癌细胞内，在U6启动子的作用下转录产生shRNA，通过这 些shRNA来诱导RNAi，从而特异地抑制CDK2基因的过度表达。因此，RNAi重组质粒可用于 制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
发明内容
本发明的目的在于提供针对CDK2基因RNAi重组质粒pGPU6/GFP/Neo_siRNA190 及制备方法，为肿瘤基因治疗提供新策略。 本发明的另一 目的是提供新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
本发明选定CDK2基因作用肿瘤治疗靶点，根据人肝癌细胞CDK2基因(GenBank Accession Number :NM_001798)的序列，通过网络在线工具(http://www. invitrogen. com/皿page)在线设计软件设计siRNA190 (序列为5—GGAGCTTAACCATCCTAATAT 3—)。并构 建含干扰片段的dsDNA，送生物公司合成，退火后克隆入质粒(pGPU6/GFP/Neo)，并用酶切 鉴定与DNA测序技术进行筛选鉴定重组质粒；通过脂质体法转染至肝癌细胞，在U6启动子 的作用下转录产生短发夹RNA (short hairpin RNA， shRNA)，通过这些shRNA来诱导RNAi，经实时定量PCR与Western blot检测干扰重组质粒对CDK2基因mRNA与蛋白水平的抑制 程度，为开发成为新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物提供实验依据。
图lpGPU6/GFP/Neo质粒图谱
图2pGPU6/GFP/Neo-siRNA 190测序结果
图3稳定转染后肝癌细胞的荧光表达的检测
图4实时定量PCR扩增曲线 图5Western blot检测图，其中1为pGPU6/GFP/Neo_NC组;2为pGPU6/GFP/ Neo-siRNA 190组
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实例仅用于说明本发明，而
不用于限定本发明的范围。
实施例一 干扰序列的设计根据人肝癌细胞CDK2基因(GenBank Accession Number :NM_001798)的序列，通 过网络在线工具(http:〃www. invitrogen. com/,age)在线设计软件设计siRNA 190(序 列为5—GGAGCTTAACCATCCTAATAT 3，；再设计一组无关序列作为阴性对照。
实施例二重组质粒的构建 构建Oligo单链，在正义和反义链之间链接Loop环，然后在基本结构基础上添加 Bam H I内切酶与Bbs I内切酶的酶切位点序列与转录终止序列，形成编码特异地抑制CDK2 基因表达的siRNA190的DNA片段 然后送上海生工公司人工合成后，将两条链退火连成双链。用Bam H I内切酶与 Bbs I内切酶双酶切质粒pGPU6/GFP/Neo (质粒图谱如图1)，然后将双链DNA克隆至质粒 pGPU6/GFP/Neo，转化至大肠杆菌，抽提后用酶切法鉴定转化菌，粗筛可能的阳性重组克隆 并进行DNA测序鉴定(测序图谱如图2)，具体为247位至308位(62个碱基)。
实施例三转染肝癌细胞株SMMC7721 本实验采用阳离子脂质体试剂(Invitrogen公司Lipofectamine 2000转染试剂
盒)转染肝癌细胞株。经多次转染条件的摸索，找到最佳的条件。转染后24h、48h后荧光
倒置显微镜拍片观察，视野内有较强的绿色荧光(稳定转染后肝癌细胞的荧光表达的检测
如图3)，即证明有绿色荧光蛋白的表达。随机选择5个细胞区视野(200X)，计数绿色荧光
细胞数及总细胞数，按下面公式计算绿色荧光细胞发生率(即转染效率) 绿色荧光细胞发生率=(绿色荧光细胞数/总细胞数)X 100% 转染S匪C7721后48h测得转染效率达90%以上。 实施例四定量PCR检测重组质粒对CDK2基因mRNA水平的影响 取肝癌细胞正常培养，分别转染重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190与pGPU6/
GFP/Neo-NC (阴性对照)48h待细胞汇合率达到80-90 %时，总RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC处理的ddH20中。所用引物根据CDK2mRNA和GAPDH mRNA全基因序列，应 用Primer Premier 5. 0软件进行引物设计，送上海生工合成。逆转录反应得到模板cDNA， 进行Real-time PCR反应，采用相对定量法，分析转染siRNA表达载体后的S匪C7721肝癌 细胞内CDK2基因相对于GAPDH内参基因的表达变化(实时定量PCR扩增曲线如图4) 。 PCR 扩增后，设定阈值线(threshold)为0. 2，采集对应的CT值(Thresholdcycle)，然后按照 2—A ACT法对数据进行分析处理，所得数据对内参基因GAPDH进行均一化处理，然后得到样品 组相对于阴性对照组的基因表达变化。结果发现，重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190可以 显著抑制肝癌细胞CDK2基因mRNA表达，抑制效率为72% 。
实施例五Western blot检测重组质粒对CDK2基因蛋白表达的抑制
取肝癌细胞正常培养，分别转染重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190与pGPU6/ GFP/Neo-NC(阴性对照)48h待细胞汇合率达到80-90 %时，用蛋白提取液分别处理各组 细胞，收集总蛋白；蛋白定量后SDS-PAGE电泳、转膜；免疫抗体反应；最后化学增强发光法 (ECL)显带；以P-actin为内参照(Westernblot检测如图5)。使用扫描仪扫描图像，条 带的灰度分析采用Gel-ProAnalyzer软件处理，以目的基因产物灰度值与P -actin产物灰 度值之比作为蛋白相对表达量。结果发现，重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190对肝癌细胞 CDK2蛋白表达有抑制作用，抑制效率为91. 6% 。
权利要求
一种以CDK2为靶基因的siRNA190，其特征在于，其碱基序列为5`GGAGCTTAACCATCCTAATAT 3`。
2. 根据权利要求1所述siRNA，其特征在于，其制备为构建重组质粒pGPU6/GFP/ Neo-siRNA190体内转录生成。
3. 根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所用质粒包括含III型RNA聚合酶与真 核U6启动子的载体pGPU6/GFP/Neo ;编码特异地抑制CDK2基因表达的siRNA190的DNA片 段。
4. 根据权利要求3所述的编码特异地抑制CDK2基因表达的siRNA190的DNA片段，其 特征在于，其碱基序列为
5. 根据权利要求2所述重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190，其特征在于，其能显著抑 制肝癌细胞中CDK2基因的表达，可用于制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
全文摘要
本发明公开了一种针对CDK2基因的RNAi重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190的构建及其抑制肝癌细胞增殖的作用。利用RNAi技术原理，设计出以CDK2为靶基因的siRNA190，设计合成了能转录出shRNA的模板DNA，并将其定向克隆到真核表达载体pGPU6/GFP/Neo，并用酶切鉴定与DNA测序技术进行筛选，成功构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA190。该重组质粒能显著抑制肝癌细胞中CDK2基因的表达，用于制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
文档编号C12N15/11GK101775394SQ20081020971
公开日2010年7月14日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者于水澜, 于英君, 冯克俭, 宋高臣, 李和伟, 李娜, 李志强, 李玲, 申梅淑, 赵阳 申请人:宋高臣;于英君;李玲