一种改构的人淀粉样多肽突变体－普兰林肽(pramlintide)的制备方法

专利名称：一种改构的人淀粉样多肽突变体－普兰林肽(pramlintide)的制备方法
技术领域：
本发明提供了一种改构的人淀粉样多肽突变体一普兰林肽(pramlhitide)的 制备方法。
背景技术：
胰淀粉样多肽是一种有37个氨基酸残基构成的多肽激素，是一类包括 CGRP和降钙素相关肽家族中的成员。为应答营养刺激素如葡萄糖和精氨酸，淀 粉样多肽(Amylin)主要从胰腺0细胞合成并分泌(Moore等，Biochem Biophys Res Commim 179:1-9,1991)。具有多种生理功能，如减慢食物(包括葡萄糖)在 小肠的吸收速度，通过抑制高血糖素减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机 体调节血糖水平等。淀粉样多肽(Amylin)分子具有两个重要的易位后限制 其C端是酰胺化的，以及在2位和7位上的半胱氨酸交联形成N端环。
天然的胰淀粉样多肽溶解性差，不稳定，易于水解，而且粘稠大，易凝集， 因而不适合用于治疗。Pramlintide (普兰林肽)是经过筛选、合成出的一种稳定 的胰淀粉样多肽类似物。两者的不同在于胰淀粉样多肽^氨基酸序列中的第25、 28、 29位的氨基酸由脯氨酸代替。胰淀粉样多肽的临床前研究和普兰林肽临床 研究都表明，可以延缓葡萄糖的吸收，抑制胰高血糖素的分泌，减少肝糖生成 和释放，，同时能调节胃排空，减少胃肠道的葡萄糖，因而具有降低糖尿病患者 体内血糖波动频率和波动幅度，改善总体血糖控制，并减轻体重的作用。
目前，制备普兰林肽的主要方法均是通过氨基酸合成的方法得到。普兰林 肽为37个氨基酸，合成起来出错率高，在人体可能产生一定的副作用；而且合 成的普兰林肽价格昂贵，给长期服用的病人造成了很大的经济负担。小分子泛素样修饰蛋白(Small Ubiquitin-related Modifier, SUMO)，和泛素 (ubiquitin， Ub)在一级结构上只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生 物学功能却十分相似。SUMO广泛存在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、 信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程(参见 Johnson, E.S. 2004， Annu. Rev. Biochem., 73, 355-382.)。在脊椎动物中，有 SUMO-l、 -2、 -3三个成员，而酵母和无脊椎动物仅有一个相关基因编码的 SUMO。 SUMO修饰蛋白的生理过程如图1。简言之，SUMO俞体在泛素相似蛋 白酶Ulps (ubiquitin-like proteases)的作用下失去C端的部分氨基酸残基，暴露出 Gly-Gly序列，成为SUMO成熟肽；在ATP酶作用下，该成熟肽的C末端Gly 与活化酶El(SAEl/SAE2)的一个Cys残基通过硫酯键相连接；然后，SUMO经 El传递到结合酶E2(Ubc9)，并借助硫酯键与Ubc9活性位点上的Cys93残基相 连接；在连接酶E3的作用下，SUMO的Gly通过异肽键与靶蛋白Lys残基的 e-氨基相结合并参与相关的生理活动;最后，通过Ulps的水解作用下，SUMO 与靶蛋白分离。整个过程是一个动态迅速的反应。与泛素修饰不同，SUMO不 会导致耙蛋白降解，而是通过改变耙蛋白的稳定性和亚细胞定位等调节耙蛋白 的功能和生物活性。
除了上述的生物学活性外，SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子 伴侣，具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠， 提高可溶性等功能。此外，Ulpl可以根据SUMO的三级结构迅速水解融合蛋白， 而不象凝血酶、Xa因子及肠激酶等只能根据蛋白一级序列切割，因此能准确无 误地切除SUMO，从而获得具天然N末端的靶蛋白且不会水解目的蛋白(Butt,et al.， 2005, Protein Expression and Purification, 43, 1 -9; US 60/482817; PCT/US03/00436)。

发明内容
在本发明中，首先利用SUMO作为分子伴侣显著增加普兰林肽的表达量以及 溶解度，促进其正确折叠，通过纯化标签纯化出表达的融合蛋白(SEQIDNO: 5)。然后通过Ulpl将SUMO和标签分开，得到纯化的普兰林肽。
本发明的一个目的是提供在大肠杆菌中可溶性表达人普兰林肽的重组载 体，其中所说的表达载体包含T7启动子连接的编码带纯化标签的小分子泛素相 关修饰因子成熟肽和普兰林肽融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO: 2)。
根据本发明的表达载体，其中所说的融合蛋白包括带纯化标签的小分子 泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽，且两种蛋白是从融合蛋白的N端到C端 依次编码。
根据本发明的表达载体，其启动子为噬菌体T7启动子。 根据本发明的表达载体，其中所说的融合蛋白中的普兰林肽的核苷酸序列
是天然来源中筛选的野生序列和人工化学合成的序列。
本发明的另一个目的是提供一种在原核宿主中以可溶性形式表达普兰林肽
的制备方法，该方法包括以下步骤
(1) 提供编码带纯化标签的小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽的 融合蛋白的核苷酸序列；本文中所述的纯化标签，包括组氨酸标签、几 丁质结合域(Chitin Binding Domain)和GST标签。
(2) 将以上的融合蛋白的核苷酸序列，连接到表达载体中，得到重组的表达 载体。
(3) 用步骤(1)的重组表达载体转化适当的大肠杆菌宿主细胞；
(4) 在适于以可溶形式表达融合蛋白的条件下培养步骤(2)中被转化的大 肠杆菌宿主细胞(5) 大肠杆菌宿主细胞内表达出小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林 肽的融合蛋白。
(6) 发酵后收集菌体并破细胞壁，离心后用上清液挂Ni柱进行纯化融合蛋 白。融合蛋白在泛素相关修饰因子蛋白酶的作用下切下普兰林肽。酶切 后的混合液载体挂Ni柱去除小分子泛素相关修饰因子成熟肽杂质。剩 下的普兰林肽通过凝胶过滤进一步纯化得到纯化的普兰林肽。
根据本发明的制备方法，其中所说的启动子是噬菌体T7启动子。 根据本发明的制备方法，其中所说的适于以可溶形式表达融合蛋白和泛素
相关修饰因子蛋白酶的条件是指37°C， lmmol/LIPTG诱导5小时。
根据本发明的制备方法，其中所说的小分子泛素相关修饰因子成熟肽是指
酿酒酵母泛素相关修饰因子(Smt3 or yeast Small Ubiquitin-related Modifier)成熟肽。
根据本发明的制备方法，其中所说的泛素相关修饰因子蛋白酶是指酿酒酵 母泛素相关修饰因子蛋白酶1 (ubiquitin-likeprotease-l,Ulpl)。
本发明涉及一种重组普兰林肽的制备方法，特别是涉及利用带纯化标签的 小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽进行融合表达。
首先根据overlapping的方法合成带有His标签的小分子泛素相关修饰因子 成熟肽和普兰林肽融合蛋白的核苷酸序列。之所以使用人工合成序列，是因为 这样可以避免氨基酸密码子偏好性的影响，从而增加融合蛋白的表达量。
作为与编码人普兰林肽的核苷酸序列融合表达的小分子泛素相关修饰因子 成熟肽基因，本发明选编码酿酒酵母小分子泛素相关修饰因子成熟肽的核苷酸 序列(SEQIDNo: 4)。酿酒酵母小分子泛素相关修饰因子是小分子泛素相关修 饰因子家族的一员，除了具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠，提高可溶性等多数小分子泛素相关修饰因子都具有的共同 功能外，更由于其在分子进化上为最原始的一种，可更适于在原核宿主中进行 表达。
作为在纯化过程中切除融合蛋白氨基端的小分子泛素相关修饰因子成熟肽 的蛋白酶，本发明选编码泛素相关修饰因子蛋白酶1的核苷酸序列。酿酒酵母
中含有两种泛素相关修饰因子蛋白酶(Ulpl和Ulp2)，研究发现，尽管两者均 能水解SUMO修饰的融合蛋白，但Ulpl的作用更重要和广泛。
使用适于在其中以高效率共表达所需蛋白质(由小分子泛素相关修饰因子 成熟肽和人普兰林肽组成的融合蛋白)的大肠杆菌株作为宿主，这样的菌株包 括但不限于大肠杆菌JM109， DH5a， PlysS， BL21， Origami (DE3)等。本发明 选的宿主是大肠杆菌菌株Origami (DE3) (Novagen co. Ltd. USA)。
按照本领域已知的技术进行基因的合成、克隆和表达载体的构建、DNA序 列分析及鉴定、宿主细胞的转化和培养以及表达产物的分离纯化等操作(参见 Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
为本发明的目的，首先利用PCR技术人工合成编码小分子泛素相关修饰因 子成熟肽和普兰林肽融合蛋白的核苷酸，列直接连接本发明选用的pET-3c表达 载体中的T7启动子下游，得到重组质粒pET-3c—SUMO—PA，其中的重组质粒 上的T7启动子与编码融合蛋白的基因构成转录单位。通过序列测定确定连接的 融合蛋白片断正确，序列见SEQIDNo3。此时得到可用于表达的重组质粒，具 体过程如图2。
按常规方法(如电转化或者化学方法)将以上重组质粒转化到适当的大肠 杆菌菌株中，使用LB培养基培养用适当抗生素筛选的转化株(参见Sambrooketal" Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
发酵过程中，首先将筛选出的单克隆重组转化子接种到含氨节青霉素的新 鲜LB培养基中(含100pg/ml氨苄青霉素)中，37°C、 250rpm振荡过夜培养。 然后，取100 u 1细菌培养液接种于50ml新鲜LB培养基中(含lOOpg/ml氨节 青霉素)，至OD6。q到0.6-丄0时，加入终浓度为lmmol/1的IPTG并置于37°c， 250rpm培养5小时。
发酵完成后，离心或用膜过滤的方法收集菌体并且通过超声波破碎细胞。 离心后上清液通过Ni纯化融合蛋白，纯化方法参见Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989。纯化的融合蛋白利用泛素相关修饰因子蛋白酶1切除融合蛋 白的SUMO标签。酶切反应液通过二次通过Ni纯化的方法纯化。收集二次过柱 的流穿液，将流穿液通过凝胶过滤收集得到纯化的普兰林肽。
纯化过程中，普兰林肽通过小分子SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，纯 度检测则通过HPLC来完成。
将本发明方法制备的普兰林肽加入赋形剂甘露醇，作为药物、食品的原料 或者是直接作为药物。


图1sum0修饰蛋白的生理过程；
图2重组质粒的构建过程。
具体实施例方式
为了清楚起见，以下对后附序列表中各个序列作简要说明
SEQIDNO: 1:合成的普兰林肽核苷酸序列(5， -3'，共111个碱基) SEQIDNO: 2:编码带组氨酸标签的小分子泛素相关修饰因子成熟肽、普兰林肽的融合蛋白的核苷酸序列(5' -3'，共444个碱基)
SEQIDNO: 3:重组质粒的测序序列(5' -3'，共657个碱基) SEQIDNO: 4:编码小分子泛素相关修饰因子成熟肽的核苷酸序列(N端
-C端，共294个碱基)
SEQIDNO: 5:带组氨酸标签的泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽的融合蛋 白(N端-C端，共143氨基酸)
SEQIDNO: 6:测序用T7 promoter引物序列(5' -3，，共19个碱基) SEQIDNO: 7:测序用T7 terminator引物序列(5， -3，，共19个碱基)
实施例1:带组氨酸标签的小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽基因 的人工合成
基因合成参见分子克隆，由上海英骏生物技术公司通过overlapping的方法 合成，合成序列见SEQIDN02
实施例2.:重组载体pET-SUMO-PA的构建.
实施例1中合成的DNA序列，用限制性内切酶NdeI (CATATG)和BamHI (GGATCC)进行双酶切。(酶切条件是3(TC，酶切3小时)。酶切后通过琼脂 糖凝胶回收酶切大片段。载体pET-3c同样也用限制性内切酶NdeI和BamHI进 行双酶切，酶切蕰度3(TC，时间3小时，酶切后通过琼脂糖凝胶回收酶切的大 片段。将两次回收的片段在T4DNA连接酶的缓冲液中16。C连接过夜。将连接 产物通过CaCl2法至感受态细胞DH5a中。转化后一天转化平板上长出转化子。 通过菌落PCR (使用载体的T7 promoter primer和T7 terminator primer引物)验 证得到重组子，进一步用酶切的方法验证重组子的正确性，最后通过用T7的通 用引物测序确认重组子没有突变(测序结果见SEQIDN03)。重组子抽提的质 粒为pET-SUMO-PA。
实施例3:重组表达载体pET-SUMO-PA转化大肠杆菌得到重组基因工程菌
株将该重组质粒利用电转或者化学方法如CaCl2转化到大肠杆菌Origami (DE3)中，利用氨苄青霉素抗性LB固体平板(lOg/1蛋白胨，5g/l酵母提取 物，10g/l氯化钠，20g/l琼脂粉，100网/ml氨苄青霉素)筛选出重组子。 实施例4:融合蛋白的发酵
发酵过程中，首先将筛选出的单克隆重组转化子接种到含氨苄青霉素的新 鲜LB培养基中(含100pg/ml氨苄青霉素)中，37°C、 250rpm振荡过夜培养。 然后，取100 P 1细菌培养液接种于50ml新鲜LB培养基中(含lOOpg/ml氨苄 青霉素，但不含1%葡萄糖)，至OD6oo到0.6-1.0时，加入终浓度为lmmo1/1的 IPTG并置于37°C ， 250rpm培养5小时。 实施例5:融合蛋白的分离
发酵结束后，12000rpm离心收集菌体，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液 (pH8.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30分钟，收
集上清。
实施例5:普兰林肽的纯化
将以上收集的上清过Ni柱，具体方法参见QiagenNi-NTA的操作指南。 等同实施方案本发明可以体现为其他具体的但不偏离其精神或基本特征 的形式，因此认为前述实施方案是在所有方面说明而不是限制本文所描述的发 明。因此，本发明的范围包括在权利说明书等同目的和范围内的所用修改。. 序列表 〈110>广东暨大基因药物工程研究中心有限公司
广州暨南大学医药生物技术研究开发中心
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<160> 7
〈170〉 Patentln version 3.5
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<211〉 111
〈212〉 DNA
〈213〉人类
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aaatgt^caccgcgacctgcgcgacccagcgcctggcgaactttctggtgcattcttct60
aacaactttg gtccgattctgccgccgacc犯cgtgggctctaacacctat111
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〈213〉人工序列
〈400〉 2
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〈210> 3 〈211> 657 <212> DNA <213>大肠杆菌<formula>formula see original document page 12</formula>Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
35 40 Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
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lie Glu Ala His Arg Glu Gin lie
Ser Glu lie Phe Phe Lys lie Lys 45
Met Glu
Phe Leu
Leu Asp 90
Gly Gly
Ala Phe 60 Tyr Asp 75
Met Glu
Ala Gly Asp
Lys Arg Gin lie Arg
Asn
lie 80 lie
Asp 95
Lys Cys Asn Thr Ala Thr
100 105 110
Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn
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ccgctgagca ataactagc
140
19
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权利要求
1. 一种改构的人淀粉样多肽突变体—普兰林肽(pramlintide)的制备方法，该方法包括以下步骤(1)提供编码小分子泛素相关修饰因子成熟肽、普兰林肽融合蛋白的核苷酸序列，该融合基因的5’末端带有6个组氨酸的编码序列，(2)将步骤(2)中核苷酸序列连接到合适原核表达载体pET-3c(Novagen co.Ltd.USA)中，(3)用步骤(3)的重组表达载体转化适当的大肠杆菌宿主细胞，(4)在适于以可溶形式表达融合蛋白的条件下培养步骤(4)中被转化的大肠杆菌宿主细胞，(5)大肠杆菌宿主细胞内分别表达出小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽的融合蛋白(SEQ ID No4)，(6)收集发酵细胞并破碎细胞，按步骤5得到纯化的普兰林肽。
2. 按照权利要求1所述的一种改构的人淀粉样多肽突变体一普兰林肽 (pramlintide)的制备方法，其特征是普兰林肽序列根据大肠杆菌偏爱性密码子合成的普兰林肽序列(SEQIDNo: 1)。
3. 按照权利要求2所述的普兰林肽序列，其特征是在5'端融合带有纯化标签的 小分子泛素相关修饰因子成熟肽序列(SEQIDNo: 2),形成融合蛋白的表 达序列。
4. 按照权利要求3所述的序列的表达载体，其特征是其启动子为噬菌体T7启 动子，启动子后接融合蛋白的编码序列。
5. 按照权利要求4所述的融合蛋白为带纯化标签的小分子泛素相关修饰因子成 熟肽和普兰林肽蛋白，其特征是从融合蛋白的N端到C端依次编码。
全文摘要
本发明提供了一种改构的人淀粉样多肽突变体-普兰林肽(pramlintide)的制备方法。本制备方法利用氨基端带有6个组氨酸标记小分子泛素相关修饰因子成熟肽(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)和普兰林肽基因的进行融合表达。另外，本发明中普兰林肽基因是根据大肠杆菌偏爱性密码子为依据的合成基因，重组菌在发酵表达过程后，通过过Ni²⁺柱进行纯化，纯化的蛋白通过蛋白酶剪切后再次Ni²⁺柱过收集流穿液的峰得到纯化的普兰林肽。
文档编号C12N15/62GK101413009SQ20081021853
公开日2009年4月22日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者刘洁生, 吴道贫, 曲红艳, 李江峰, 实 柯, 胡宏伟, 苏志坚, 黄亚东 申请人:广东暨大基因药物工程研究中心有限公司;广州暨南大学医药生物技术研究开发中心