专利名称：：一种高产绿僵菌素菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物农药
技术领域：
，具体涉及一种高产绿僵菌菌株及其应用。
背景技术：
：绿僵菌素是金龟子绿僵菌(MetoW^/"mfl"^o/^'"e)等昆虫病原真菌产生的环縮肽类抗生素。绿僵菌素具有显著的杀虫效果，并且具有不同于现有杀虫剂的全新的作用机理，主要作用于昆虫的血淋巴免疫系统，使之丧失免疫防御能力。绿僵菌素易降解、无残留，毒性低。开发利用绿僵菌素具有重要经济意义。然而，一般真菌菌株的绿僵菌素产量非常低，生产绿僵菌素的成本十分昂贵。在欧洲，Loutelierefa/.(1996)报道金龟子绿僵菌的Ma23菌株绿僵菌素E的产量较高。台湾的Hsiaoefa/.(2001)培育的金龟子绿僵菌M^^;//"《？()61菌株有较高的绿僵菌素8产量。但是，绿僵菌素A的高产菌株尚未见报道。
发明内容本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供--种高产绿僵菌素菌株，尤其是绿僵菌素A高产的绿僵菌菌株。本发明的另一个目的是提供所述高产绿僵菌菌株的应用。本发明的目的通过下述技术方案来实现.-本发明提供了一种高产绿僵菌素且稳定性好的金龟子绿僵菌金龟子变禾中(Metor/z/z/wwa/^o/^/aevar.aw/so//〖ae)菌株MaQlO，本发明所述的菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2008年10月27日，保藏号CCTCCM208173;具体内容是Metor/2/zf,am'so;/faevar.aw'sop/ZaeMaQ10。本发明通过采集土壤或天然感染绿僵病的昆虫、分离纯化菌株、生物学特性及生产性状比较和菌株确定等步骤，反复筛选，得到一株绿僵菌素高产的金龟子绿僵菌金龟子变种菌株，编号为MaQ10，所述菌株分类地位真菌门(Eumycota)、有丝分裂孢子真菌类(MitosporicfUngi)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)、绿僵菌属(Afetor/zzi/wm)。未发现有性世代。所述菌株菌落培养特征在马铃薯琼脂培养基(PDA)上菌落初期白色茸状，28"C下培养一周，菌落直径达到3.6cm，产孢时由里向外长出成丛的墨绿色分生孢子堆，呈壳状。在萨氏培养基(SDAY)上菌落初期白色茸状，28。C下培养一周，菌落直径为3.3011，产孢时由里向外长绿色分生孢子堆，呈壳状。见附图l。菌株形态特征菌丝具分枝分隔，直径1.52.2,。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生体。瓶梗型产孢细胞，大小幅度为2.12.9X7.17.5p，从瓶梗顶端产生向基成熟的分生子链，分生孢子单细胞，长椭圆形至卵圆状，两端钝圆形，一端稍细，孢子大小为1.92.9X4.65.7^m。分生孢子有时亦单生于菌丝分枝孢梗末端。见附图2。本发明同时提供了所述高产绿僵菌菌株在生产制备绿僵菌素方面的应用。绿僵菌素产量比较了与另外74个菌株(或分离株)的绿僵菌素产量水平，MaQ10菌株最高，其绿僵菌素A(DA)的产量为106.78士9.41(ig/mL，绿僵菌素B(DB)的为29.52±2.63吗/mL，平均为17.73±1.12吗/mL和4.00士0.41吗/mL。菌株产量稳定性随着传代数的增加，MaQlO菌株从1至10代，DA和DB两种毒素的产量没有显著性(p<0.05)降低，但至15代则显著性下降。说明该菌株的在第10代前绿僵菌素生产能力具有较好的稳定性。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果本发明提供了一种新的绿僵菌菌株，其绿僵菌素A和绿僵菌素B的产量很高，菌株产量稳定，尤其是第10代前绿僵菌素生产能力具有很好的稳定性。本发明可以为绿僵菌素的实际生产提高产量、降低生产成本。图1MaQlO菌株在PDA平板培养基上的菌落图2MaQlO菌株在SDAY平板培养基上的菌落图3MaQlO菌株的寄主感染状图4MaQlO菌株的分生孢子与产孢结构具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步详细阐述本发明。下述实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株的发明思想，实施方式不一一在实施例中追述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。实施例1通过采集广州市一种感病鳃金龟(五xo/oW/^sp.)上虫尸(如附图3所示)、采用常规通用技术分离纯化菌株、进行生物学特性及生产性状比较和菌株确定等步骤，经过反复筛选，得到一株绿僵菌素高产的金龟子绿僵菌金龟子变种菌株，编号为MaQlO。孢子悬浮液配制从斜面上挑取孢子，接入已经灭菌的0.05%的吐温-80溶液中，用血球计数板测量孢子浓度，并调整到1(^孢子/mL。种子培养将2mL孢子悬浮液接种于98mL种子培养基中，在180r/min和26'C条件下摇瓶培养3d即成种子液。种子培养基成分0.5%蛋白胨的Czapek-Dox:蛋白胨5g，NaN033g，K2HP041g，MgS047H200.5g,KC10.5g，FeS047H200.01g，蔗糖30g，琼脂15-20g，水1000mL。发酵培养将10mL种子液接种于90mL发酵培养基中，在240r/min和26匸条件下摇瓶培养10天。发酵培养基成分麦芽糖25.5g，蛋白胨7.5g，(3-丙氨酸0.2g，葡萄糖5g，水1000mL，pH8.0。绿僵菌素分离纯化将上述发酵物离心或过滤，得发酵液，通过萃取、浓縮、层析和结晶等常规技术分离纯化绿僵菌素；或者参照申请号为200610132318.0的专利申请中公开的分离纯化方法。绿僵菌素产量本申请人采用相同的方法从不同的寄主或栖境获得另外74个菌株或分离株，比较本发明所述菌株与所述的74个菌株或分离株的绿僵菌素产量水平，结果见表l，由表l可见MaQ10菌株最高。本发明所述MaQ10菌株绿僵菌素A(DA)的产量为106.78士9.41jig/mL，绿僵菌素B(DB)的为29.52±2.63^g/mL，平均为17,73±1,12吗/mL和4.00±0.41pg/mL，绿僵菌素产量水平较高。菌株产量稳定性随着传代数的增加，MaQ10菌株从1至10代，DA和DB两种毒素的产量没有显著性(p<0.05)降低，但至15代则显著性下降，见表2。说明该菌株的在第10代前绿僵菌素生产能力具有较好的稳定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5107.02士5.31a29.72±1.17a1099.84±4.15ab22.11土2.03ab1590.21士3.69b18.26士1.12b注同列数据中标记了不同字母的平均数具有显著性差异(P<0.05，MDRT法)权利要求1、一种高产绿僵菌素菌株，所述菌株分类地位是无性世代属于真菌门、有丝分裂孢子真菌类、丝孢纲、丝孢目、丝孢科、绿僵菌属；所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2008年10月27日，保藏号CCTCCM208173。2、一种权利要求1所述高产绿僵菌素菌株的应用，其特征在于应用于制备绿僵菌素。3、根据权利要求2所述高产绿僵菌素菌株的应用，其特征在于所述菌株第110代的应用。4、根据权利要求2或3所述高产绿僵菌素菌株的应用，其特征在于所述制备绿僵菌素包括以下步骤(1)孢子悬浮液配制从斜面上挑取孢子，接入已经灭菌的0.05%的吐温-80溶液中，用血球计数板测量孢子浓度，并调整到107孢子/mL;(2)种子培养将孢子悬浮液接种于种子培养基中，摇瓶培养得种子液；(3)发酵培养将种子液接种于发酵培养基中，摇瓶培养；(4)绿僵菌素分离纯化。5、根据权利要求4所述高产绿僵菌素菌株的应用，其特征在于步骤(2)所述种子培养基成分为0.5%蛋白胨的Czapek-Dox:蛋白胨5g、NaN033g、K2HP041g、MgS。47H200.5g、KC10.5g、FeSO4*7H2O0.01g、蔗糖30g、琼脂15-20g和水1000mL。6、根据权利要求4所述高产绿僵菌素菌株的应用，其特征在于步骤(3)所述发酵培养基成分为麦芽糖25.5g、蛋白胨7.5g、p-丙氨酸(X2g、葡萄糖5g和水1000mL;所述发酵培养基pH为8.0。全文摘要本发明公开了一种高产绿僵菌素菌株及其应用。所述菌株MaQ10分类地位无性世代属于真菌门、有丝分裂孢子真菌类、丝孢纲、丝孢目、丝孢科、绿僵菌属；所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2008年10月27日，保藏号CCTCCM208173。本发明所述绿僵菌菌株，其绿僵菌素A和绿僵菌素B的产量很高，菌株产量稳定，尤其是第10代前绿僵菌素生产能力具有很好的稳定性。本发明可以为绿僵菌素的实际生产提高产量、降低生产成本提供技术依据。文档编号C12N1/14GK101560473SQ20081021940公开日2009年10月21日申请日期2008年11月25日优先权日2008年11月25日发明者任顺祥,胡琼波申请人:华南农业大学