专利名称：：大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法
技术领域：
：本发明涉及转谷氨酰胺酶基因工程，特别是涉及大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，实现转谷氨酰胺酶酶原的可溶性表达，用于大规模工业化生产转谷氨酰胺酶。
背景技术：
：转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，主要催化蛋白质和多肽进行谷氨酰胺残基的Y-酰胺基和赖氨酸的"氨基之间进行酰胺基转移反应，将蛋白质进行分子间的共价交联聚合，从而改变蛋白质本身和所附着的细胞、组织的结构与功能。该酶已在医药工业、食品工业和纺织工业等广泛利用，有"21世纪超级粘合剂"的美称，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种，显示出显著的应用前景及优势，因而引起了人们的高度重视。在日本与MTG有关的食品销售额达2000亿日元，是日本单种酶销售额最大的一种。国外在转谷氨酰胺酶特性及应用性的研究已经有很多报道，主要利用从动物器官组织中提取的酶样品进行试验。但由于动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故，酶的生产应用一直受到很大限制。日本Ando等首先报道以轮枝链霉菌属发酵法直接生产微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，将产品大批量投放市场，并获得了巨大的经济效益，吸引了国内外各方的广泛关注和极大兴趣。国内大量文献报道的是转谷氨酰胺酶应用的研究。中国食品酿造所、南京农业大学报道转谷氨酰胺酶生产菌的选育，其中中国食品酿造所进行微生物转谷氨酰胺酶生产菌的"神舟四号"飞船搭载育种。目前，主要通过两种途径来提高转谷氨酰胺酶的产量。一是通过诱变育种和培养基优化来提高生产菌的产量，如日本味之素公司就是采用茂原链霉菌发酵生产MTG，但是这种方法获得的高产菌很容易退化，生产不稳定；二是通过构建基因工程菌表达转谷氨酰胺酶，如在2005年9月第21巻第五期的《生物工程学报》发表的《茂原链霉菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达》(作者徐斌，韩之波，杨萍，刘拥军，李妍涵，韩忠朝)一文中就构建了基因工程菌成功地表达了转谷氨酰胺酶，文中报道利用PCR方法从茂原链霉菌基因组DNA扩增出微生物转谷氨酰胺酶的基因片段，而不是转谷氨酰胺酶酶原基因，并构建表达质粒pET-MTG。后者在大肠杆菌(RosettaDE3)中得到高效表达，但表达的MTG存在于包涵体中，需要经洗涤、变性和复性等过程，并以强阳离子交换层析纯化，才获得了SDS-PAGE纯的MTG，所以其过程是很繁琐，很难实现工业化生产。
发明内容本发明克服了现有技术中的不足，本发明构建一株工程菌，通过低温发酵的方法实现了可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原，然后用胰蛋白酶激活后获得成熟的转谷氨酰胺酶，简化发酵生产工艺。本发明的技术方案概述如下，包括如下步骤大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，包括如下步骤(1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增及表达载体的构建由原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR弓I物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQIDNo3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQIDNo4所示，获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过NcoI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-proMTG，并转化E.coliBL21(DE3)成为大肠杆菌(EscherichiacoliBL21/proMTG)，该菌株于2008年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM208240，该菌株能够高水平可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原。(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原先在3638°CLB培养基中活化、培养1214h，然后以l^2^(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基中，3638t:发酵生长23h后降低培养温度到2028°C，然后加入诱导剂异丙基硫代-13-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原，诱导剂异丙基硫代-P-D-半乳糖苷的浓度为0.4mMl.OmM，诱导表达培养68h后结束培养收菌，超声波破碎细胞，离心后的上清液即为可溶性蛋白，含有转谷氨酰胺酶酶原；(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活采用胰蛋白酶作为激活剂，对表达的转谷氨酰胺酶酶原激活成为成熟的转谷氨酰胺酶，胰蛋白酶的浓度为0.1%0.2%(mg/ml)，加入体积为酶原体积的1/101/20，作用时间为1030min;(4)高密度发酵对大肠杆菌E.coliBL21/proMTG进行高密度发酵；前期菌体生长阶段的参数为温度3638t:，溶氧控制在1822%的饱和溶氧浓度，pH为6.57.5，；待OD6。。至5060时，降低温度至2028t:，加IPTG诱导表达，溶氧控制在2832%左右的饱和溶氧浓度，pH6.57.5，继续培养68h收菌；(5)蛋白纯化工艺对发酵的大肠杆菌用超声波裂解细胞后离心，上清液直接上亲和层析柱纯化蛋白，用高浓度咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白。所述的诱导剂异丙基硫代-13-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原的温度优选为2224°C。相对于现有技术本发明具有如下优点本发明将茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的基因克隆至原核表达载体pET-22b(+)，利用pET系统的高效表达，通过低温(2028t:)诱变实现了可溶性表达，省去了繁琐的包涵体变性及复性过程，简化了发酵生产工艺。大肠杆菌E.coliBL21/proMTG进行高密度发酵后，粗提酶的活性达到9.6U/mL，分离纯化后，比活力大于16U/mg，转谷氨酰胺酶产量及比活力达到直接在大肠杆菌中表达形成包涵体并经变性及复性生产该酶的水平，但工艺简单。图1为PCR方法扩增pro-MTG片段图；图2为各个诱导温度细胞破壁离心上清的SDS-PAGE电泳图，箭头所示为目的蛋白；图3为pro-MTG纯化SDS-PAGE图4为发酵罐发酵诱导08h的细胞破壁离心上清的SDS-PAGE图。具体实施条件下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于下述实施例实施例1工程菌E.coliBL21/proMTG的构建过程及在摇瓶规模下可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，包括以下步骤(l)PCR扩增转谷氨酰胺酶酶原基因茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列是从文献《MolecularCloningoftheGeneforMicrobialTransglutaminasefromStreptomycesmobaraensisandItsExpressioninStreptomyceslividans》(Biosci.Biotech.Biochem.58(1)，82-87，1994)中获得，转谷氨酰胺酶酶原基因的序列见序列表SEQIDNol，以liig茂原链霉菌基因组DNA为PCR反应模板，正向引物和反向引物分别为SEQIDNo3和SEQIDNo4所示，PCR反应条件为95。C预变性10min，94°C变性lmin，65t:退火30s，72"C延伸2.5min，共30个循环，最后在72"C延伸10min，扩增出一条与转谷氨酰胺酶酶原基因大小相符的DNA片段。如图1所示，图中1为DNAmarker;2，3，4均为PCRproduct。通过对比marker可知扩增出来的DNA片段大小与理论大小一致。表达质粒的构建获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过NcoI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-proMTG，并转化大肠杆菌BL21(DE3)成为工程菌E.coliBL21/proMTG。p)大肠杆菌发酵工艺接种上述大肠杆新鲜的单菌落于50mLLB培养基中(含有Amp100iig/ml)，37°C，200rpm活化12h，将活化的种子接种于lOOmLLB培养基中(含有Amp100g/ml)发酵生长2h，然后加诱导物IPTG在低温条件下诱导表达转谷氨酰胺酶酶原，诱导4h后离心收集细胞，超声波破碎细胞后离心，上清液用于后续蛋白纯化。转谷氨酰胺酶酶原的氨基酸序列如SEQIDNo2所示，信号肽pelB如序列表中加粗所示，酶原前导肽如序列表中斜体所示，在前导肽后是成熟的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列。实施例2大肠杆菌E.coliBL21/proMTG诱导表达温度的优化大肠杆菌E.coliBL21/proMTG的构建见实施例1。上述工程菌的单菌落接种于50mLLB培养基中，37°C，200rpm活化12h后2%接种量接种于lOOmL发酵培养基中发酵生长2h后，加入IPTG至终浓度lmM，然后在2037t:的条件下进行诱导表达，68h后离心收集细胞，超声破碎离心取上清，上清用胰蛋白酶激活后用比色法测定转谷氨酰胺酶的活力，发现在202『C条件下均不同程度的形成可溶性表达，且在24tH秀导条件下表达量最高。各个温度诱导破壁离心上清的SDS-PAGE电泳图如图2所示，在2『C以下，均可见一条比较粗的电泳条带。实施例3大肠杆菌E.coliBL21/proMTG接种量的优化大肠杆菌E.coliBL21/proMTG的构建见实施例1。大肠杆菌E.coliBL21/proMTG的单菌落接种于50mLLB培养基中，37°C，200rpm活化12h后，分别取1、2、3、4mL活化的种子接种于lOOmL发酵培养基中发酵生长至0D6。。=0.5左右后，加入IPTG至终浓度lmM，然后置于24tH秀导表达。4h后离心收集细胞，超声破碎离心取上清，上清用胰蛋白酶激活后用比色法测定转谷氨酰胺酶的活力，发现l^2^(v/v)接种量时酶活较高。实施例4大肠杆菌E.coliBL21/proMTG加入诱导物IPTG浓度的优化大肠杆菌E.coliBL21/proMTG的构建见实施例1。上述工程菌的单菌落接种于50mLLB培养基中，37°C，200rpm活化12h后2%接种量接种于100mL发酵培养基中发酵生长2h后，分别加入IPTG至终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、l.OmM，然后分别置于24tH秀导表达。4h后离心收集细胞，超声波破碎离心取上清，上清用胰蛋白酶激活后用比色法测定转谷氨酰胺酶的活力，发现诱导物IPTG的浓度对转谷氨酰胺酶酶原的表达影响不大，发酵液中诱导物IPTG的终浓度在0.4mMl.OmM的条件下，均可高水平地表达转谷氨酰胺酶酶原。实施例5胰蛋白酶激活转谷氨酰胺酶酶原的工艺由于胰蛋白酶已实现工业化生产且生产价格不高，所以采用胰蛋白酶作为激活剂，对工程菌E.coliBL21/proMTG表达的转谷氨酰胺酶酶原激活成为成熟的转谷氨酰胺酶。分别配制不同浓度的胰蛋白酶溶液，发现当胰蛋白酶的浓度为(g/ml)0.1X0.2X(胰蛋白酶购至北京普博欣公司，2-4U/mh)，加入胰蛋白酶的体积为待激活酶原溶液体积的1/10，作用时间为1030min时，均可激活转谷氨酰胺酶酶原。实施例6HisTrap柱亲和层析纯化pro-MTG:采用GE公司AKTApurifier层析仪和lmLHisTrapFFcrude柱纯化蛋白。(l)用蒸馏水洗柱至基线平稳。(2)用bindingbuffer(50mMTris/HClbufferwith300mMNaCl，20mMimidazole,pH8.0)平衡柱子至基线平稳，流速为lmL/min。(3)上样，流速为lmL/min。(4)用bindingbuffer洗柱至基线平稳。(5)用elutionbuffer(50mMTris/HClbufferwith300mMNaCl，500mMimidazole,pH8.0)洗脱，见峰起开始收集蛋白。pro-MTG纯化SDS-PAGE图见附图3:lanel破壁离心上清；lane2流穿液；lane3Marker;lane4和lane5均为洗脱液。表1.纯化数据项BS活UZniL体积mL总,活U回收率蛋A浓度蛋Ait比,活粗提酶9.6纯化酷34.1实施例72L发酵罐高密度发酵重组大肠杆菌产酶状况2L发酵罐发酵(工作体积为1L)，接种量为20mL，菌体生长阶段条件控制在温度37t:，pH为7.0，溶氧控制在20%左右，转速和溶氧关联。发酵培养基为细菌学蛋白胨10g、酵母粉5g、12mmol/LNa2HP04、15mmol/LKH2P04、14mmol/LNaCL、40mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/L葡萄糖和12mmol/LMgS04。补料培养基为20%的葡萄糖(含有2mmol/LNa2HP04，3mmol/LKH2P04)，待菌体密度的0D6。。达到5060时，改变发酵温度至24t:，加入IPTG进行诱导表达，IPTG的终浓度为lmmol/L，溶氧控制在30%，同时不断的流加补料培养基，诱导8h后放罐，并分别在lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h及8h取样测酶活及电泳如图4所示，发现在6小时左右已达到了最高峰，酶活数据表明远高于目前国内报道的最高的可溶性表达水平(0.24U/ml)，转谷氨酰胺酶产量及比酶活达到直接在大肠杆菌中表达形成包涵体并经变性及复性生产该酶的水平，而且发酵工艺更简便。表2.发酵罐08h发酵的酶活数据<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在国内，还未有关于大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶的报道。在2005年9月第21巻第五期的《生物工程学报》发表的《茂原链霉菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达》(作者徐斌，韩之波，杨萍，刘拥军，李妍涵，韩忠朝)一文中构建了基因工程菌成功地表达了转谷氨酰胺酶，但是表达的MTG存在于包涵体中，需要经洗涤、变性和复性等过程，并以强阳离子交换层析纯化，才获得了SDS-PAGE纯的MTG，所以其过程是很繁琐，很难实现工业化生产。因此，现在市场上的转谷氨酰胺酶有两种途径生产。一是通过茂原链霉菌发酵生产，但是茂原链霉菌发酵有以下几个缺点酶活产量不高，生产周期长且生产不稳定。二是通过将转谷氨酰胺酶酶原克隆到谷氨酸棒状杆菌中表达生产，日本味之素公司就是采用此方法生产。大肠杆菌做为宿主生产蛋白已有多年的历史，且工艺成熟和低成本。本发明在表达质粒的选择，酶切位点的选择，宿主的选择及培养条件的优化等多方面综合考虑，成功地实现了大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶，经过2L高密度发酵实验，单位体积发酵液的酶活高达9.6U/ml，单位细胞干重的酶活高达470U/gDCW，是一种高效的产酶方法。本发明的重组蛋白的C端有6个组氨酸标记，可以利用N产亲和层析一步纯化蛋白，从而简化了纯化步骤，且回收率高达90%左右。序列表SEQIDNo1:1ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG61ATGGCCATGGACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCCTACGCCGAAACCTACCGCCTC121ACGGCGGATGACGTCGCGAACATCAACGCGCTCAACGAAAGCGCTCCGGCCGCTTCGAGC181GCCGGCCCGTCGTTCCGGGCCCCCGACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCCGAGCCG241CTCGACAGGATGCCCGACCCGTACCGTCCCTCGTACGGCAGGGCCGAGACGGTCGTCAAC301AACTACATACGCAAGTGGCAGCAGGTCTACAGCCACCGCGACGGCAGGAAGCAGCAGATG361ACCGAGGAGCAGCGGGAGTGGCTGTCCTACGGCTGCGTCGGTGTCACCTGGGTCAATTCG421GGTCAGTACCCGACGAACAGACTGGCCTTCGCGTCCTTCGACGAGGACAGGTTCAAGAAC481GAGCTGAAGAACGGCAGGCCCCGGTCCGGCGAGACGCGGGCGGAGTTCGAGGGCCGCGTC541GCGAAGGAGAGCTTCGACGAGGAGAAGGGCTTCCAGCGGGCGCGTGAGGTGGCGTCCGTC601ATGAACAGGGCCCTGGAGAACGCCCACGACGAGAGCGCTTACCTCGACAACCTCAAGAAG661GAACTGGCGAACGGCAACGACGCCCTGCGCAACGAGGACGCCCGTTCCCCGTTCTACTCG721GCGCTGCGGAACACGCCGTCCTTCAAGGAGCGGAACGGAGGCAATCACGACCCGTCCAGG781ATGAAGGCCGTCATCTACTCGAAGCACTTCTGGAGCGGCCAGGACCGGTCGAGTTCGGCC841GACAAGAGGAAGTACGGCGACCCGGACGCCTTCCGCCCCGCCCCGGGCACCGGCCTGGTC901GACATGTCGAGGGACAGGAACATTCCGCGCAGCCCCACCAGCCCCGGTGAGGGATTCGTC961AATTTCGACTACGGCTGGTTCGGCGCCCAGACGGAAGCGGACGCCGACAAGACCGTCTGG1021ACCCACGGAAATCACTATCACGCGCCCAATGGCAGCCTGGGTGCCATGCATGTCTACGAG1081AGCAAGTTCCGCAACTGGTCCGAGGGTTACTCGGACTTCGACCGCGGAGCCTATGTGATC1141ACCTTCATCCCCAAGAGCTGGAACACCGCCCCCGACAAGGTAAAGCAGGGCTGGCCGCTC1201GAGCACCACCACCACCACCACTGA序列表SEQIDNo2:ESAPAASSAGPSFRAP信号肽pelB酶原前导肽的氨基酸序列MTEEOREWLSYGCVG成熟酶的氨基酸序列EKGFORAREVASVMGNHDPSRMKAVIYSKFDYGWFGAOTEADAWNTAPDKVKOGWPLEHHHHHH-序列表SEQIDNo3:5'-CATGCCATGGACAATGGCGCGGGGGAAG-3'序列表SEQIDNo4:5'-CCGCTCGAGCGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'权利要求一种大肠杆菌E.coliBL21/proMTG，其特征在于该菌株保藏号为CCTCCM208240。2.大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，其特征包括如下步骤(1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增及表达载体的构建由原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQIDNo3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQIDNo4所示，获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过NcoI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-proMTG，并转化E.coliBL21(DE3)成为权利要求1所述的大肠杆菌；(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原先在3638t:LB培养基中活化、培养1214h，然后以l^2^(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基中，3638t:发酵生长23h后降低培养温度到2028°C，然后加入诱导剂异丙基硫代-13-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原，诱导剂异丙基硫代-P-D-半乳糖苷的浓度为0.4mMl.OmM，诱导表达培养68h后结束培养收菌，超声波破碎细胞，离心后的上清液即为可溶性蛋白，含有转谷氨酰胺酶酶原；(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活采用胰蛋白酶作为激活剂，对表达的转谷氨酰胺酶酶原激活成为成熟的转谷氨酰胺酶，胰蛋白酶的浓度为0.1%0.2%(mg/ml)，加入体积为酶原体积的1/101/20，作用时间为1030min;(4)高密度发酵对大肠杆菌E.coliBL21/proMTG进行高密度发酵；前期菌体生长阶段的参数为温度3638t:，溶氧控制在1822%的饱和溶氧浓度，pH为6.57.5，；待OD6。。至5060时，降低温度至2028t:，加IPTG诱导表达，溶氧控制在2832%左右的饱和溶氧浓度，pH6.57.5，继续培养68h收菌；(5)蛋白纯化工艺对发酵的大肠杆菌用超声波裂解细胞后离心，上清液直接上亲和层析柱纯化蛋白，用高浓度咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，其特征所述的诱导剂异丙基硫代-P-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原的温度为2224°C。全文摘要本发明公开了大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，该方法包括如下几个步骤(1)根据茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b-proMTG，转化为大肠杆菌E.coliBL21/proMTG，该菌株保藏号为CCTCCM208240；(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原；(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活；(4)高密度发酵；(5)蛋白纯化工艺。本发明方法的转谷氨酰胺酶产量及比活力达到直接在大肠杆菌中表达形成包涵体并经变性及复性生产该酶的水平，而且发酵生产工艺更简单。文档编号C12N9/10GK101691560SQ200810220160公开日2010年4月7日申请日期2008年12月19日优先权日2008年12月19日发明者崔翠,杨慧林,潘力,苗小康申请人:华南理工大学