专利名称：一种羊种布鲁氏菌重组菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种羊种布鲁氏菌重组菌及其应用。
背景技术：
布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具 有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全 球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)， 前者通过检疫扑杀患病的牛、羊、猪等动物，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫 接种并辅助扑杀措施。但现行的疫苗毒力较强、遗传背景不清楚，虽然可阻止疾病 在动物群中的传播，但无法分辩患病动物体内分离得到的菌株是疫苗株还是野生菌 株，使疫苗株简单、快速的安全性评价成为目前公众关注的焦点问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊种布鲁氏菌的重组菌。
本发明提供的羊种布鲁氏菌的重组菌，是将羊种布鲁氏菌("/7/"7h 历e7W朋w's)基因组中的冷休克蛋白的编码基因灭活后得到的重组菌。
所述羊种布鲁氏菌(5n^//ame//fe"^)可为现有的菌株，如野生株(包括标 准株和强毒株)、疫苗株。
所述冷休克蛋白可为任何羊种布鲁氏菌(5n^e//awe//fe"^)的冷休克蛋白， 如为序列1所示的冷休克蛋白。
所述冷休克蛋白的编码序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。
可通过任何现有灭活方法灭活所述羊种布鲁氏菌(5r〃ce^a历eh'fe/2sA)中 的冷休克蛋白，如缺失基因组中该蛋白的编码序列、插入外源或内源序列、同源重 组、RNA干扰等。
所述同源重组是将DMll的0匪片段导入所述羊种布鲁氏菌(5^"^ ^/&"^) 中实现的；所述DMll的DNA片段，从上游至下游依次为同源臂DM11-1和同源臂 DM11-2;所述同源臂DM11-1和同源臂DM11-2能与所述羊布鲁氏菌基因组中的冷休 克蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，灭活所述冷休克蛋白的编码 基因。
所述同源臂DM11-1和同源臂DM11-2的长度均为400-600bp。 所述同源臂DM11-1具体可为以羊种布鲁氏菌16M (5wce〃a metoe"^ 16M)标 准株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUM382 (下游引物)5， - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3，。 所述同源臂DM11-2具体可为以羊种布鲁氏菌16M (份wce〃a me" e"^ 16M)标 准菌株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段
p而M383 (上游引物)5， - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3，； pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 实验证明，所述重组菌的毒力显著低于出发菌株和现行疫苗株，而且免疫保护 效力与现有疫苗株相当。因此，该重组菌可用于开发羊种布鲁氏菌疫苗。 该布鲁氏菌疫苗，其活性成分为上述羊种布鲁氏菌的重组菌。 本发明通过对布鲁氏菌基因组中的功能基因进行筛选，发现冷休克蛋白编码基 因的灭活使羊种布鲁氏菌的毒力显著降低。本发明通过将羊种布鲁氏菌的冷休克蛋 白的编码基因灭活，得到了新的菌株，与出发菌株相比，该新菌株的毒力较小，无 需灭活就可以作为疫苗免疫动物。使用本发明的菌株免疫小鼠，通过PCR技术检测 缺失基因片段的大小鉴定出患病动物体内分离到的菌株是疫苗菌株还是野生菌株。 本发明对布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标 记疫苗，促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为DM11-1和DM11-2的PCR扩增结果 图2为DM11的PCR连接结果
图3为重组质粒pEX18AP-DM11转化DH5 a后的PCR鉴定结果
图4为重组质粒pEX18AP-DM11经Kpnl和EcoRI双酶切后产物的PCR鉴定结果
图5为重组载体pEX18AP-DM11的构建流程图
图6为羊种布鲁氏菌重组菌BDM11的PCR鉴定结果
图7为羊种布鲁氏菌重组菌BDM11接种后小鼠脾脏的重量变化曲线
图8为羊种布鲁氏菌重组菌BDMll接种后小鼠脾脏的载菌量变化曲线
图9为羊种布鲁氏菌重组菌BDM11在小鼠体内的免疫保护试验
具体实施例方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 以下实施例中所用的菌株和质粒如下
羊布鲁氏菌标准菌株16M (5^n/ce^a/z ehYe/2sA16M)、羊种布鲁氏菌疫苗菌 株M5 (购自中国兽药监察所菌种室)；pEX18AP质粒(构建方法参见文献TungT. Hoang, Gene 1998,212:77-86)。
实施例1、羊种布鲁氏菌重组菌的构建
根据布鲁氏菌基因中的冷休克蛋白基因序列(GenBank Accession Number: BMEI0498)，设计两对引物， 一对引物用于扩增同源臂DM11-1，另一对引物用于 扩增DM11-2。同源臂DM11-1和同源臂DM11-2连接后形成序列DM11，将序列丽ll 插入pEX18AP质粒，得到重组载体pEX18AP-DM11。重组载体pEX18AP-DM11与羊种 布鲁氏菌基因组发生同源重组即可得到灭活冷休克蛋白编码基因的羊布鲁氏菌重 组菌。
一、重组载体pEX18AP-DM11的构建 构建过程示意图见图5。
1、 布鲁氏菌基因组的提取
取300ul灭活的羊种布鲁氏菌标准菌株16M，加入lml TNE (每升含有l. 21g Tris，5.84g NaCl,O. 37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入 135ul TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135n 1含2% Triton X-IOO的TNE，混 匀。加30!xl新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37T:水浴孵育30min， 之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，涡旋混匀。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse浓度达到10ug/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的 基因组DNA于4'C保存备用。
2、 PCR扩增上游片段DM11-1 (539bp)和下游片段DM11-2 (499bp) 扩增上游片段的引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUM382 (下游引物)5， - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3'。 上游引物中加入EcoRI酶切位点，下游引物中加入HindIII酶切位点。 扩增下游片段的引物如下
pWUM383 (上游弓l物)5' - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3';
pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3' 上游引物中加入HindIII酶切位点，下游引物中加入Kpnl酶切位点。
以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两对引物对进行降落PCR。降落 PCR反应的具体条件是先94'C预变性3min;然后94"C变性45s;退火温度从65 。C至50'C每降rC运行2个循环，每个循环72。C延伸lmin;最后72。C延伸10 min。 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图1。其中，1: DM11-1的PCR扩增产物， 2: DM11-2的PCR扩增产物，3: DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片 段。
3、 DM11片段的获得
通过PCR扩增将上游片段DM11-1和下游片段DM11-2连接，得到片段即为DM11 片段。PCR扩增所用的引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUM384 (下游引物)5， -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， PCR扩增体系
DM11-l片断1ul
DMll-2片断1ul
dNTP (2.5 mM)1ul
Taq酶2ul
lOXTaq buffer5ul
pWUM381 (20pmol/ul)1ul
pWUM384 (20pmol/u 1)1ul
双蒸水补足至50 ul38 ul扩增产物进行电泳检测，见图2。结果表明，成功获得了将DM11-1和DM11-2 连接的DM11片段。
4、 pEX18AP-DM11质粒的构建
提取含有AMP抗性基因、SacB基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经 EcoRI和Kpnl双酶切后的pEX18AP质粒与步骤3得到的DM11片段连接。将得到的 重组质粒命名为pEX18AP-DMl 1 。
用pEX18AP-DMll转化到DH5a大肠杆菌，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌 株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 结果见图3。图3中，1:阳性菌株的PCR产物，2、 DNA分子量标准。 然后提取质粒并进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4。图4 中，1、 DNA分子量标准；2、重组质粒pEX18AP-DM11双酶切产物的PCR结果。 将得到的含有重组质粒菌株增殖，保存在-8(TC备用。 二、灭活冷休克蛋白编码基因的布鲁氏重组菌株获得
在含有20mlTSB液体培养基的离心管中接种羊布鲁氏菌16M标准菌株20 ul， 37r培养24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1.5ml离心管 中，继续离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液和 3ul质粒(pEX18AP-DM11)加入lram的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中，调 整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。査询电击参数为2. 22KV。电击后， 向电极杯中加入lml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10rain，置于37 r摇床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB+Amp (100ug/ul) 。 5-8天后 长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37'C增殖48h，再将该 菌液稀释10-IOO倍后，取100ul涂布于含有5%蔗糖的TSA平板培养基。经过3-5 天后长出单菌落，将此菌落进行PCR鉴定，阳性菌株即为灭活冷休克蛋白编码基因 的羊种布鲁氏菌的重组菌，将其命名为羊布鲁氏菌重组菌BDMll。 PCR鉴定用的引物如下
pWUM381 (上游弓l物)5' -GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3' pWUM384 (下游引物)5， -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3，。 羊种布鲁氏菌重组菌株BDMll的PCR鉴定见图6。图6中，1、 DNA分子量标准； 2、羊种布鲁氏菌标准菌株16M的PCR产物；3、重组菌BDMll的PCR产物。
结果表明，获得了通过双交换灭活冷休克蛋白编码基因的羊种布鲁氏菌BDM11 。 实施例2、灭活冷休克蛋白的布鲁氏菌重组菌的鉴定
试验动物4-6周龄SPF级BALB/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有 限公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。
一、毒力鉴定
将小鼠随机分为三组，每组30只。具体接种方案如下
第一组(试验组)接种实施例l制备的羊种布鲁氏菌重组菌BDMll，每只小
鼠腹腔接种剂量O. lml，内含107细菌。
第二组(对照组l):接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M，每只小鼠腹腔接种剂 量O. lml，内含107细菌。
第三组(对照组2):接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接种剂量 0. lml，内含107细菌。
分别于接种后第l、 2、 3、 4、 5和10周从每组小鼠中选5只，进行脾脏大小、 脾脏载菌量检测评价。
脾脏重量随时间的变化见图7。其中，野生株表示接种羊种布鲁氏菌标准菌株 16M的实验结果，Vac M5表示接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5的实验结果，BDM11 表示接种实施例1制备的羊种布鲁氏菌重组菌BDM11的实验结果。结果表明，羊种 布鲁氏菌重组菌BDMll接种后，小鼠的脾脏与对照组1和2相比在感染早期肿大显 著，但后期迅速下降。脾脏载菌量随时间的变化见图8。结果表明，羊种布鲁氏菌 重组菌BDM11接种后，小鼠的脾脏载菌量与接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M (对照 组l)或接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5 (对照组2)的小鼠相比有显著降低，表明 该羊种布鲁氏菌重组菌BDMll的毒力极低。
血清学检测结果表明，接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M、接种羊种布鲁氏菌疫 苗菌株M5或接种羊种布鲁氏菌重组菌BDM11的小鼠血清通过布鲁氏菌虎红平板凝 集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200801)检测时，均能够在2分钟内 出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号 200603)检测到的抗体效价达到1:100以上。
二、疫苗效力评价
将上述健康小鼠随机分为三组，每组5只。三组小鼠分别注射羊种布鲁氏菌重 组菌株BDMll、羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5和PBS，具体如下
第一组(试验组)接种实施例l制备的羊种布鲁氏菌重组菌株BDMll，每只 小鼠腹腔接种剂量O. lml，内含107细菌。
第二组(疫苗对照组)接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接种剂 量O. lml，内含107细菌。
第三组(空白对照组)接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠 腹腔接种剂量O. lml。
上述三组小鼠接种8周后，用羊种布鲁氏菌标准株16M进行攻毒保护试验，攻
毒后两周剖杀小鼠并采血，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。 实验设三次重复，脾脏的平均载菌量变化结果如图9所示。图中，对照组表示空白
对照组的实验结果，M5表示疫苗对照组的实验结果，BDM11表示接种实施例l制备 的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDMll的实验结果。小鼠体内攻毒结果表明，冷休克蛋 白编码基因缺失的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDMll的毒力较小，无需灭活就可以作 为疫苗免疫动物，且免疫保护效力与现行疫苗菌株M5相当。
<160〉 2
<210〉 1
<211〉 83
<212〉 PRT 〈213>人工序列
〈400〉 1
Met Lys Arg Arg Arg Gin Gly Lys Gly Thr Asp Pro Met Ala Gin Thr 15 10 15
Gly Gin Val Lys Phe Phe Asn Thr Glu Lys Gly Phe Gly Phe lie Lys 20 25 30
Pro Asp Asp Gly Gly Ala Asp lie Phe Val His lie Ser Ala Val Gin 35 40 45
Ala Ser Gly Leu Pro Gly Leu Ala Asp Asn Gin Lys Val Ser Tyr Glu 50 55 60
Thr Glu Pro Asp Arg Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala Val Asn lie Thr 65 70 75 80
lie Thr Gly
<210〉 2
<211〉 252
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<400> 2
atgaagcggc ggcgccaagg aaaaggaacg gatcccatgg cacagaccgg acaggtcaaa 60
ttcttcaaca ccgaaaaagg tttcggtttc atcaagcccg atgatggcgg cgcggacatc 120
ttcgtgcata tttctgcagt tcaggcttct ggcctgccag gccttgctga caatcagaag 180
gtttcctatg aaacggaacc agatcgtcgt ggaaaaggcc ccaaggccgt gaacatcacc 240
altaccggct ga 25权利要求
1、羊种布鲁氏菌的重组菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的编码基因灭活得到的菌株。
2、 如权利要求l所述的重组菌，其特征在于所述冷休克蛋白是由序列表中 的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3、 如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于所述灭活是通过同源重组 实现的。
4、 如权利要求3所述的重组菌，其特征在于所述同源重组是将DNA片段DM11 导入所述羊种布鲁氏菌(^Y/ce72s/77eh'fe/ w^)实现的；所述DNA片段DM11从上 游至下游依次为同源臂DM11-1和同源臂DM11-2;所述同源臂DM11-1和同源臂 DM11-2能与所述羊种布鲁氏菌基因组中的冷休克蛋白编码基因的上游序列和下游 序列发生同源重组，灭活所述冷休克蛋白的编码基因。
5、 如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述同源臂DM11-l和同源臂 DM11-2的长度均为400-600bp。
6、 权利要求1至5中任一所述重组菌在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
7、 一种布鲁氏菌疫苗，其活性成分为权利要求1至5中任一所述的羊种布鲁 氏菌重组菌。
全文摘要
本发明公开了一种羊种布鲁氏菌的重组菌。本发明提供的羊种布鲁氏菌的重组疫苗菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的编码基因灭活得到的菌株。与出发菌株相比，本发明得到的菌株的毒力比现行疫苗M5小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。使用本发明的菌株免疫小鼠，通过PCR方法可以鉴定出患病动物体内分离到的菌株是疫苗菌株还是野生菌株。本发明对布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
文档编号C12N1/21GK101386832SQ200810224819
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者婕 任, 刘文娟, 刘文晓, 吴清民, 张兴林, 张春燕, 娜 李, 羽 杨, 牛建蕊, 真 王 申请人:中国农业大学