专利名称：重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物病毒基因工程技术领域。具体涉及一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸 综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株的制备，用该基因工程毒株制备的基因工程疫苗及应 用。
背景技术：
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudombiesvirus,简称PrV)感染猪、牛、羊、犬、猫、家 兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物引起的急性传染病，猪是该病毒的贮存者和传 播者(Mettenleiter等，Comp Immunol Microbiol Infect Dis.l991,14:151-163)。除猪以外的其它 动物呈散发形式，发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，均为致死性感染。该病对 猪呈爆发流行，主要导致母猪繁殖障碍和新生仔猪大量死亡。PrV —般经鼻咽部感染动物， 并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行， 一般认为病毒经神经通路到 达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染。
伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kb， G+C含量高达74n/。，整个基因组至 少编码70-100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase, TK)基因位于UL区，全长963bp， 编码320个氨基酸，催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因与是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，也 与病毒的潜伏感染有关(Kit S等,Am J Vet Res.l985,46:1359-1367; Nunberg等，J Virol. 1989, 63: 3240-3249)。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gG、 gE等。TK、 gG、 gE 和gl基因都是病毒增殖所非必需的，缺失这些基因的病毒株与野毒株一样能正常增殖，而且 不存在毒力返强的危险(Yokyama等，Virol.l991,185:55-65)。但突变病毒株仍具有很好的免疫 原性，接种动物后可产生有效的保护性免疫反应，但是不产生抗gG、 gE、 gl糖蛋白的抗体， 因此可以作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的 猪群，为最终根除该病提供有用的工具。华中农业大学在自主分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒 Ea株(陈焕春等，畜牧兽医学报，1998， 29 (2)， 151-156)的基础上，通过DNA重组技术 将主要毒力基因TK、非必需糖蛋白基因gG或gE、 gl缺失，构建了一系列的重组突变毒株 用于伪狂犬病的根除(刘正飞等，微生物学报，2002， 42 (3)， 370-374;刘正飞等，畜牧兽 医学报，2004， 35(1)， 70-73;徐晓娟等，生物工程学报，2004， 20 (4)， 532-535)。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,简称PRRSV)引起的一种新的传染病，主要以母猪发热、厌食、早产、流产、 死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。由于该病目前危害 严重，并且没有很好的防制措施而引起全球养猪业和研究者越来越多的注意。已有商品化猪繁殖与呼吸综合征减毒疫苗问世，但存在安全性问题。而灭活疫苗的免疫 效力不尽人意，同时由于猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖增强(ADE)效应(仇华吉 等，中国兽医科技，1999， 29(7)， 19-20)，使得常规疫苗难以奏效(仇华吉等，中国兽医学 报，2000， 20(1)， 100-103)，因此有必要开发新型疫苗。猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基 因编码的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，因此 是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(DeaS等，Arch Virol, 2000a， 145， 659-688)。但 单独基于天然ORF5基因构建的疫苗难以诱发较高的免疫应答(PirzadehB等，JGenVirol， 1998a， 79, 989-999 ; OstrowskiM等，JVirol， 2002， 76， 4241~4250),江云波等对ORF5 基因进行修饰，即将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和 覆盖表位间，构建的修饰型ORF5M基因具有更好的免疫原性(江云波等，中国兽医学报， 2005 (1)， 1-3)。 Balasuriya R等(Balasuriya R等，J Virol, 2000， 74， 10623-10630)在研 究与PRRSV同属的马动脉炎病毒(EAV)活病毒载体疫苗时发现，EAV的E蛋白在体外表 达时其短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运的效率很低，因此难以激发很高的抗体， 而当ORF5与ORF6基因共表达时，二者编码的蛋白形成异源二聚体，这种异源二聚体的存 在极大地促进了 E蛋白短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运，有利于诱发机体产生很 强的免疫反应。但目前PRRSV相关方面的研究尚未见报道。
猪圆环病毒II型(PCV 2)是新发现的一种重要病原微生物，可引起断奶后仔猪多系统衰竭 综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合症(PDNS)、 PCV2相关繁殖障碍、先天性震颤(CT)等疾 病。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50°%，给我 国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在 细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、 廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前的试验性疫苗诱发的免疫原性均不 够理想，使得对于PCV2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。
与本发明相关的一些专利申请，例如伪狂犬病的专利申请，有华中农业大学提出的申请 号为ZL 03156706.1专利(一种伪狂犬病TK7gE7gl—基因缺失标志活疫苗及制备方法)，该专 利公开了一种基因缺失突变株是在人工构建的伪狂犬病TK7gE7LacZ+突变株中缺失LacZ基 因，获得的一株没有外源基因插入的伪狂犬病毒三基因缺失的突变株TK7gE7gr，该专利只 涉及该毒株制备伪狂犬病基因标记疫苗在防制伪狂犬病单一疾病上的应用。
与本发明相关的另一些专利申请，例如猪繁殖与呼吸综合征的专利申请见于下列文献 华中农业大学提出的专利号为ZL 200410000238.0(—种猪繁殖与呼吸综合征的"自杀性"DNA 疫苗)和专利号为ZL 200410009838.3 (—种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及应 用)的专利申请，上述两项专利申请只涉及对猪繁殖与呼吸综合征的单一疾病的防制。
与本发明密切相关的一篇专利申请是华中农业大学提出的申请号为200510012147.3专 利申请(一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用)。这项专利申请只涉 及对非变异猪繁殖与呼吸综合征病毒的防制，对变异猪繁殖与呼吸综合征病毒的防制效果则 不太理想。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，研制一种免疫原性更好和安全性更强的重组猪 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒(rPRV-PRRSV-PCV2)基因工程毒株。
本发明的第二个目的是利用重组的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒 基因工程毒株制备猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗。
本发明的第三个目的是制备的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因 工程疫苗的应用。
本发明通过以下技术方案实现
申请人制备了一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒毒株 (i^ew^raW^ v/nw ) EOOl，于2008年8月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号CCTCCNO: V200808。
本发明的基本构建方法是将华中农业大学动物病毒室从患"高热症"的病猪体内分离 到的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株即Nsp2基因部分缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (j90/r/"e resp/n^0 7 ^sy"t^o附e v/rws ，艮卩PRRSV)毒株(i亥^VuH3毒
株已于2008年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏号是CCTCC NO:V200810)的主要免疫原性基因ORF5基因和猪圆环病毒2型 (PCV-2)主要免疫原性基因ORF2基因的修饰型(ORF2m) (Fan H等，Immunogenicity of porcine circovirus type 2 capsid protein targeting to different subcellular compartments. Mol Immunol, 2008, 45:653-660.)，分别以完整的独立表达盒的形式(包含人巨细胞病毒CMV强 启动子和polyA信号，即CMV-ORF5-polyA和CMV-ORF2m-polyA)通过同源重组方法将其 插入到能够同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株的GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒 rPRV-GP5國M疫苗株 (Jiang等,Immunogenicity and protective efficacy of recombinant pseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vaccine, 2007, 25:547-560)的基因组gG基因位点中，构建重组 猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株。 本发明的主要优点是
1、 本发明通过同源重组的方法使伪狂犬病毒的gG基因插入失活，从而使得重组病毒株 不能表达伪狂犬病毒的gG和gE蛋白，与目前市场上普遍采用的伪狂犬病毒gG或gE鉴别 诊断方法相互配合，为伪狂犬病的净化奠定基础。
2、 本发明针对目前国内主要流行的PRRSV变异株，将其主要免疫原性基因ORF5引入 表达PRRSV经典毒株GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒中，从而达到可以同时预防PRRSV 经典毒株和国内当前流行的变异毒株的目的。
3、 本发明针对当前猪圆环病毒2型(PCV2)对养猪业的危害及缺乏安全有效疫苗的现 状，将PCV2的主要保护性抗原基因ORF2修饰后(ORF2m)引入重组病毒中，从而达到同时预防猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒感染的目的。
为深入评价用该重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株 制备的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒疫苗在防制猪伪狂犬病、猪繁殖 与呼吸综合征、猪圆环病毒感染中的应用，用制备的疫苗在试验动物(Balb/C小鼠)进行了 免疫效果的评价。
更详细的发明方案见《具体实施方式
》所述。
图1:是本发明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒构建的流程图。 图2:是本发明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒图谱。
图中CMVi.e.为人巨细胞病毒立即早期启动子，polyA为牛生长激素转录终止信号，gG、 gD和PK为来自伪狂犬病病毒基因组的同源臂序列。 图3:是本发明pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒鉴定结果。
图中M为DNAmarker (DL 15000) ， 1为pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut/Sa11。 图4:是本发明的重组PrV病毒rPRV-PRRSV-PCV2构建流程。
图5:是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经PCR扩增截去前41个氨基酸的ORF2基因 的鉴定电泳图。
图中1-20:重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21: PK-15细胞对照22: H20对照 23:质 粒pgG-CMVt-ORF2m-ORF5mu对照；M: DL2000 DNA分子量对照。
图6:是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经PCR扩增包含ORF5mut基因的片段的鉴 定电泳图。
图中1-20:重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21: PK-15细胞对照；22: H20对照23: 质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut对照；M: DL2000 DNA分子量对照。 图7:是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2的Southern-blotting分析结果。
1: Sal I酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因组；
2: Sal I酶切rPRV-GP5-M亲本株的基因组；
3: Sphl+Notl双酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因组；
4: Sphl+Notl双酶切rPRV-GP5-M亲本株的基因组。 图8:是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经RT-PCR检测截去前41个氨基酸的ORF2 基因mRNA的电泳图。
图中M是M: DL2000 DNA分子量对照1:重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2; 2:重组病毒 rPRV-PCV2; 3:重组病毒rPRV-GP5-M; 4:质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut对照；5: H20 对照
图9:是本发明的重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2免疫小鼠后产生的特异性针对PCV2的 ELISA抗体。
具体实施例方式
实施例l以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。
1、 引物设计(用于基因克隆和分子检测)
根据分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株WuH3 (保藏号为CCTCC NO:V200810)的ORF5基因序列设计引物Porf5F和Porf5R，扩增片段大小约为603bp,并且 其两端分别设计EcoR I、 EcoRV酶切位点。同时根据GenBank上猪圆环病毒n型PCV2豫 A株(曹胜波，猪II型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析，病毒学报，2002， 18 (2): 137-141) ORF2的基因序列设计引物Porf2F和Porf2R，扩增片段大小约为580bp (截 去ORF2基因的前41个氨基酸)，另外还设计了一对引物P5、 P6用于扩增串联的两个表达盒 CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA之间的ORF5mut-polyA-CMV片段，约2.0 kb， 用于对重组病毒中插入的ORF5mut进行鉴定。上述引物均由上海生工生物工程技术有限公司 合成。设计的引物序列如下
Porf5F: 5'—GTAGAATTCATGTGGGGGAAATGCTTG—3'
Porf5R: 5'—AGTGATATCCTAGAGACGACCCCATTG--3'
Porf2F: 5'-CATGGTACCAATGGCATCTTCAACACCCGC—3'
Porf2R: 5'—TATGCGGCCGCCTTAGGGTTAAGTGGGGG —3'
P5: 5'—AACGCCAGCAACAACAACAGC -3'
P6: 5'隱-GCGGGTGTTGAAGATGCCATT隱-3'
2、 pgG-CMV-ORF2m-ORF5m转移质粒的构建(见附图1、 2、 3所示)
以提取的Nsp2基因部分缺失的PRRSV毒株WuH3 (保藏号是CCTCC NO:V200810)的 RNA (提取病毒RNA方法参见江云波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文， 2007年，中国知网)为模板，Porf5F/Porf5R为引物对ORF5基因进行RT-PCR扩增，ORF5 基因的扩增条件为5(TC反转录30min， 95.0'C预变性5min后进入循环，循环参数为95.0°C lmin， 56.0°C lmin， 72.0°C lmin， 35个循环后72.0'C延伸10min。反应结束后获得大小约为 603bp的ORF5基因片段(ORF5mut)。
将获得的ORF5mut基因克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上构建质粒 pMD18-ORF5mut测序，测序结果证实构建正确后以EcoRI和EcoRV酶切pMD18-ORF5mut， 回收603bp大小的ORF5mut基因片段，插到华中农业大学动物病毒室构建的真核表达载体 pCMVPA(江云波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文，2007年，中国知网) 中的EcoR I和Sma I酶切位点，得到pCMVPA-ORF5mut质粒。用Bgl II和BamH I酶切质粒 pCMVPA-ORF5mut，回收约2.0kb的片段插入通用转移载体pgG-Uni (方六荣等，伪狂犬病 病毒gG基因缺失通用转移载体的构建，华中农业大学学报，2001， 20 (4): 306-309)中， 构建转移质粒pgG-CMV-ORF5mut。用BglII禾Q Xhol I酶切质粒pCDNA-ORF2m (樊慧英， 猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究，博士论文，2007年，中国知网)回收1.7kb左右的片 段将其插入pCI-neo(购自Promega公司)的BglII和Xhol I位点之间，构建质粒pCI-ORF2m; 然后将pCI-ORF2m用BglII禾Q Smal酶切回收约1.58kb的CMV-ORF2m基因片段插入 pgG-CMV-ORF5mut的BamH I和Stu I位点构建质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut，其构建流程如图1所示，pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒图谱如图2所示，其酶切鉴定如图3所 示。
3、 重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的构建
在PK-15细胞上增殖rPRV-GP5-M亲本株，提取病毒基因组DNA(提取方法参照王柳等， 人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备，生物技术，1994， 4 (4): 33-35)。 应用脂质体介导转染技术(方法参照周复春等，伪狂犬病病毒鄂八株60-/1^^^+突变株的构 建，畜牧兽医学报，2001， 32 (2)， 129-133)将其与pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移载体 共转染PK-15细胞，通过同源重组交换将CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA两个 独立的完整表达盒导入到rPRV-GP5-M基因组的gG基因位点(图4)，待产生细胞病变后收 毒。将病毒液接种于PK-15细胞，用含1%低熔点琼脂糖的DMEM (美国GIBCO公司产品) 维持液覆盖，于37。C5。/。C02的条件下培养，当出现细胞病变时，用0.01%的中性红染色lh， 由于病变细胞不能着色，而正常细胞被染成红色，从而出现圆点状空斑，挑取单个空斑接种 PK-15细胞扩大培养，通过PCR扩增ORF5mut和ORF2m基因的鉴定阳性重组病毒(PCR结 果见图5和图6)，如此进行三次纯化，直到阳性率为100%，从而确定病毒液中只含有重组 伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2，而没有亲本毒株的污染。其构建流程如图4。
4、 重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的鉴定及其生物学特性 重组伪狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本发明已按专利程序送交中国典型培养物保
藏中心保藏的生物材料样品，即E001)的mRNA水平检测
以重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的mRNA (提取病毒RNA方法参见江云 波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文，2007年，中国知网)为模板扩增插 入的外源基因，结果表明rPRV-PRRSV-PCV2病毒株可以扩增到插入的目的基因，而亲本株 rPRV-GP5-M则检测不到，说明目的基因已经插入到了亲本株基因组gG基因位点中。
重组伪狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本发明已按专利程序送交中国典型培养物保 藏中心保藏的生物材料样品，即E001) Southern-blotting鉴定
主要方法如下提取重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(即E001，保藏编号CCTCCNO: V200808)的基因组DNA (参考文献王柳等，人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探 针的制备，生物技术，1994， 4 (4)， 33-35)分别用Sal I和Sphl+Notl酶切后，在0.8%的琼 脂糖凝胶上30伏电泳6小时后，按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著， 《分子克隆实验指南》第二版.金冬雁等译校，科学出版社，1998)进行Southern-blotting鉴 定。将酶切后电泳的重组毒株的基因组DNA转移到硝酸纤维素膜上，8(TC烤膜后备用。PCR 扩增截去前41个氨基酸的ORF2基因的DNA片段，按DNA回收试剂盒(购自上海生工生 物工程技术有限公司)操作说明书回收目的DNA后，用地高辛标记(具体方法按Roch公司 的地高辛标记试剂盒说明书操作)，作为DNA探针，置于-2(TC保存备用。最后将DNA探针 与备用的硝酸纤维素膜杂交，结果如图7所示。试验结果表明，Sal I和Sphl+Notl酶切的 rPRV-PRRSV-PCV2病毒株基因组DNA泳道有明显的特异性杂交带，大小与预期相符，而
rPRV-GP5-M病毒株基因组DNA泳道则没有，证实CMV-ORF5-PolyA和CMV-ORF2m-PolyA表达盒已正确插入到了亲本株基因组gG基因位点中。
本发明构建的重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2在细胞上的增殖特点与其亲本株 rPRV-GP5-M没有明显差异。在PK-15细胞上的增殖滴度可以达到l(T75 TCID5()/mL以上，在 PK-15细胞上传20代，其增殖滴度没有明显的变化，并均可稳定的扩增出插入的外源基因。
5、 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗的制备
将鉴定构建正确、增殖滴度高、遗传稳定，并具有良好生物学活性的重组病毒 rPRV-PRRSV-PCV2种毒按1/10的体积比接种鸡胚成纤维细胞，收集增殖滴度达 1068TCID5()/mL以上的病毒液，按病毒液明胶为7 : 1的体积比加入明胶作保护剂，充分混 匀后按2.5mL/瓶分装于灭菌冻干瓶中，置冷冻干燥机中冻干，压盖后置4'C保存备用。
6、 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗的安全性评价
将50只伪狂犬病毒抗体阴性的健康Balb/C小鼠随机分为五组，其中一组接种106TCID5(3 的rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗，另外两组分别接种同样剂量的亲本株 rPRV-GP5-M和重组伪狂犬病毒-猪圆环病毒2型rPRV-PCV2 (Ju等，Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fiision protein of porcine circovirus type 2. Vet Micro. 2005， 109:179-190.)作为本发明中的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2的对照。 一组接 种同样剂量的PRV野毒鄂A强毒株(华中农业大学分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒Ea株或称 为鄂A株，两者为同一毒株(见陈焕春等，畜牧兽医学报，1998， 29 (2)， 151-156)作为病 毒毒性对照，余下一组作为不免疫空白对照组，观察14天。结果接种本发明中的三价重组基 因工程疫苗和对照组的小白鼠精神食欲均正常，无异常表现；而接种强毒(PRV野毒鄂A株) 的小白鼠，从接种后72小时开始死亡，至U144小时全部死亡，表明该重组三价基因工程疫苗 对小白鼠是安全的(表l)。
表1本发明的rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗对Balb/C小鼠的安全性
试验组别动物数(只)死亡数(只)平均死亡时间(小时)
空白对照1000
rPRV-PRRSV-PCV21000
rPRV陽GP5-M1000
rPRV陽PCV21000
PrV鄂A株(又称Ea株)1010111.3±32.7
将rPRV-PRRSV-PCV2重组基因工程疫苗按107()TCID5o的病毒量接种25日龄的仔猪，部 分出现轻度的发热反应，两天后恢复正常，在此期间仔猪的精神食欲正常，未见异常变化， 可以检测到伪狂犬病毒中和抗体。PRV野毒鄂A株(来源同上)接种的仔猪，第二天全部呈 现发热反应，持续一周，并有一头死亡，解剖发现具有典型的伪狂犬病病理变化，而空白对 照组既没有体温升高，也没有异常临床表现。按107QTCID5Q的病毒量接种rPRV-PRRSV-PCV2疫苗的妊娠母猪和未接种疫苗的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎
等。结果简明该疫苗对仔猪和妊娠母猪均是安全的。
7、 rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗的免疫效力检测
1) 小鼠的免疫程序
将重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2制成的冻干活疫苗经颈部肌肉注射6-8周龄Balb/c小鼠， 每组6只，每只接种剂量为105TCID5o，共免疫2次，间隔3周；同时设亲本株rPRV-GP5-M、 重组病毒rPRV-PCV2对照，并设置一组不免疫阴性对照(negative control)。所有免疫小鼠于 首免后3周通过尾静脉采血，6周眼睚放血，分离血清后分别进行特异性针对PRV的ELISA 抗体禾口中和抗体检观lj (方法参照Jiang等，Immunogenicity and protective efficacy of recombinant pseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vaccine, 2007, 25:547-560.)，针对PRRSV的中和抗体水平检测 (方法参照方六荣等，表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5的重组伪狂犬病毒TK-/ 80-/0 5+的构建及其生物学特性初步探讨，病毒学报，2004， 20 (3): 249-254)，以及针对 猪圆环病毒的ELISA抗体水平检测(方法参照Ju等，Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2. Vet Micro. 2005, 109:179-190)。
2) 伪狂犬病毒抗体水平检测
重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)首免后3周可以检测到特异性针对PRV 的ELISA抗体和中和抗体，并于二免后3周达到最高，其抗体滴度达到1:20480，而中和抗 体达到32.6±17.6，和亲本株rPRV-GP5-M免疫组所表现出的趋势和实际值均无显著性差异(表 2)，表明重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)可以较好地诱导特异性针对PRV 的免疫应答。
表2重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对PRV的抗体水平
检测方法3W6W
rPRV-GP5-MSNa EIJSAb28.3±18.4 2048035.6±17.5 20480
rPRV-PCV2SNa ELISAb26.8±19.4 2048032.6±16.5 20480
rPRV-PRRSV-PCV2SN ELISA27.4±24.3 2048032.6±17.6 20480
Neg controlSN ELISA——
说明a:SN指中和抗体；
b: PRV的ELISA抗体效价是指针对PRV全病毒粒子的ELISA抗体滴度。3)猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体检测
采用文献(Pirzadeh B等，J Gen Virol， Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus, 1998， 79: 989-999)报道 的PRRSV中和抗体检测方法，检测血清中特异性针对PRRSV的中和抗体水平。结果表明， 重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)免疫组在首免后3周可以检测到特异性针对 变异和非变异PRRSV的中和抗体(>=1:4)，并随着免疫时间的延长而上升，于首免后6周 达到最高。重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)诱发的特异性针对非变异PRRSV 的中和抗体与亲本株(rPRV-GP5-M)免疫组相比差异不显著(P〉0.05, t-test)，而亲本株 (rPRV-GP5-M)免疫组诱发的针对变异PRRSV的中和抗体水平却很低。表明本发明中的重 组三价基因工程疫苗不紧能够较好地诱发免疫小鼠产生特异性针对非变异PRRSV的中和抗 体也能诱发免疫小鼠产生特异性针对变异PRRSV的中和抗体。重组病毒rPRV-PCV2和空白 对照组在整个实验过程中都未检测到特异性针对变异和非变异PRRSV的中和抗体，试验结 果如表3、表4。
表3重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对^&^^尸JCiWK的中和抗体水平
VaccineTime after primary vaccination<l:8a1:81:161:32
rPRV-PRRSV-PCV23W5b100
6W1131
rPRV-GP5m-M3W6000
6W2031
Neg control3W6000
6W6000
rPRV-PCV23W6000
6W6000
a中和抗体效价.b达到一定中和抗体效价的免疫小鼠数量.
表4重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对^^W JWK的中和抗体水平VaccineTime after primary<l:8a1:81:161:32
vaccination
3W4b200
rPRV-PRRSV-PCV2
6W1140
3W6000
rPRV-GP5m-M
6W2400
Neg control3W6000
6W6000
rPRV-PCV23W6000
6W6000
a中和抗体效价.b达到一定中和抗体效价的免疫小鼠数量
3)猪圆环病毒抗体检测
釆用文献(樊慧英，猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究，博士论文，2007年，中国知
网)报道的抗PCV2的ELISA抗体检测方法，检测血清中特异性针对PCV2的ELISA抗体水平。结果表明，重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)和重组病毒rPRV-PCV2两 个免疫组在首免后3周可以检测到特异性针对PCV2的ELISA抗体，并趋于上升，两组之间 差异不显著(PX).05,t-test)，表明本发明中的重组三价基因工程疫苗能够较好地诱发免疫小 鼠产生特异性针对PCV2的ELISA抗体。亲本株rPRV-GP5-M和空白对照组在整个实验过程 中都都未检测到PCV2特异性抗体(0D630nmO.4),试验结果如图9所示。
权利要求
1、一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株(Pseudorabies virus)E001，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNOV200808。
2、 包含权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒毒株的 基因工程疫苗。
3、 权利要求1所述的一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工 程毒株在制备伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病基因工程疫苗上的应用。
全文摘要
本发明属于动物病毒基因工程技术领域，具体涉及重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株构建、疫苗制备及应用。获得一株重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株E001，缺失了伪狂犬病毒主要毒力基因TK、糖蛋白基因gG、gE和gI，不表达伪狂犬病毒的功能性糖蛋白gG和gE/gI；能同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株的GP5m/M蛋白抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒国内变异株GP5蛋白及猪圆环病毒的ORF2蛋白。该毒株可刺激猪产生抗伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒攻击的保护性免疫反应，有效防止伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的感染。还公开了三价基因工程疫苗的制备与应用。
文档编号C12N7/01GK101457215SQ20081022785
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月1日 优先权日2008年12月1日
发明者徐凤琴, 方六荣, 江云波, 肖少波, 陈焕春 申请人:华中农业大学