专利名称：猪源大肠杆菌中抗铜基因pcoA的PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及一种猪源大肠杆菌中抗铜基因/^M的PCR检测方法，属检测技术 领域。
背景技术：
长期以来抗菌剂(包括抗生素，硫酸铜)被作为生长促进剂添加到饲料中， 在增加动物养殖效益的同时导致高频率的抗生素抗性细菌的出现，这些抗性细菌 携带的抗性基因可以被转移到在人类致病菌，这是对人类健康的潜在威胁。
Aarestrup等推测禁止使用抗生素作为生长促进剂添加到猪词料中后，在养猪场 抗生素抗性细菌仍然保持高发生率的原因可能是由于铜仍然被添加到猪饲料中 作为生长促进剂,它们选择抗生素抗性细菌并维持了它们的发生率(Aarestr叩， F. M., H. Has腿n， L B. Jensen, 2002. Antimicrobial resistance among
enterococci from pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)。国外已经报道从养猪场分离到抗铜的肠球菌
(f/ terococciAS/aecJ-咖)带有抗铜基因tcrB(Aarestrup, F. M. ， H. Hasman, L. B. Jensen, " <3_Z. 2002. Antimicrobial resistance among enterococci from pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)，和抗铜的大肠杆菌(￡ coh')带有抗铜基因/ coABCDRSE (Silver, S. ， Lee， B. T. 0. ， Brown, N. L ef (1993). Bacterial plasmid resistance to copper, cadmium and zinc. In C7 e/w'5^r.K Copper朋t/ Z/V c 7>\z'ac/s, pp. 38_53. Edited by A. J". Welch. London: The Royal Socirty of Chemistry.), 这些抗铜基因都位于接合质粒上。Hasman & Aarestrup进一歩对分离到的抗铜 肠球菌(￡ /sew'"/z7)进行研究发现抗铜基因fc/fi、抗糖肽类抗生素的基因簇 raM和抗大环内酯类抗生素的基因e/Y7fi位于同一个接合质粒上(Hasman， H. ， and F. M. Aarestrup. 2002. fc_rB， a gene conferring transferable copperresistance in teroc 9CCi/s /aeci魔 occurrence, transferability, and linkage to macrolide and glycopeptide resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46:1410-1416.)。
目前我国的猪饲养业仍然在饲料中添加抗生素和铜盐、锌盐作为生长促进 剂，这必然对猪肉产品安全造成威胁。快速检测猪源大肠杆菌中是否存在抗性基 因对评价猪肉产品安全具有重要意义。而常规PCR检测程序需要从细胞中提取DNA 样品，耗时长，试剂消耗多，造成检测样品周期长成本高。本发明采用猪源大肠 杆菌单菌落直接做DNA模板，实现了用PCR方法快速、经济地检测大肠杆菌中的 抗铜基因; coC。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测方法之不足，而提供一种能快速检测猪源大
肠杆菌中抗铜基因pcoA的方法。
本发明的检测方法包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备； 抗铜基因PCOA的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；PCR扩增产物的 检测方法。其中
用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备方法将分离到的待检测
的猪源大肠杆菌菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在37 OC温度下培 养18-36 h后得到单菌落。
抗铜基因pcoA的引物序列为上游5， CGTCTCGACGAACTTTCCTG 3，； 下游5'GGACTTCACGAAACATTCCC3，； PCR扩增产物大小为1750 bp。
PCR反应液组成(1)10x PCR buffer, (2)10 ,上游引物序，10 ^M下游引物 序，(3)10 MM dNTP, (4)用一个无菌的0. 5-10nL移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA 模板)放入PCR反应液中混匀，(5)1.5-3.0 U Taq酶，(6)反应体系20-50叱。
PCR扩增反应条件94。C预变性5-10 min; 94。C变性1.75 min、 55°C退火 1.5min、 72°C延伸2 min、共进行30-35个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保 存。
PCR扩增产物的检测方法将扩增产物于O. 8-2. 0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像分析结果。
本发明与现有技术相比，具有较好的特异性，能在5h内完成对猪源大肠杆 菌样品是否带有抗铜基因pcoA的检测，检测方法快速、简便、且经济。本发明为 评价猪肉食品安全提供了一个技术手段，有良好的运用前景。
图l为本发明方法检测实验室保存的标准抗铜菌株中抗铜基因pcoA的电泳 图，其中
M:分子量标准
1:标准抗铜菌株DHl(pRJ100) 2:标准抗铜菌株HWS2(pRJ100) 3:标准抗铜菌株AN194N(pRJ100) 4:标准抗铜菌株W3110(pRJ100) 5:标准铜敏感菌株DH1 6:标准铜敏感菌株HWS2 7:标准铜敏感菌株AN194N 8:标准铜敏感菌株W3110 6:标准抗铜菌株LR100
图2为本发明方法检测分离到的健康猪源大肠杆菌菌株中抗铜基因pcoA的 电泳图，其中
M:分子量标准
1:阳性对照株LRIOO 2:阴性对照株DH1 3:抗铜菌株W2a6 4:抗铜菌株G6a74 5:抗铜菌株Fd35 6:抗铜菌株G5d8具体实施例方式实施实例一实验室保存的标准抗铜菌株中抗铜基因PCOA的检测 根据本发明的检测方法，对实验室保存的5株标准抗铜菌株和4株标准铜敏感 菌株进行检测。
1. 菌落培养物的制备
将实验室保存的5株标准抗铜菌株和4株标准铜敏感菌株分别划线接种在牛 肉膏蛋白胨培养基平板上，37。C培养24 h，得到单菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10x PCR buffer, 10幽上游引物序，10幽下游引物序，10 , dNTP，用一个无菌的0.5-10 ^移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR 反应液中混匀，1.5 U Taq酶，反应体系20叱；
b.扩增反应条件9fC预变性5 min; 94。C变性1.75 min、 55°C退火 1.5min、 72°C延伸2 min、共进行30个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于0.8 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像分析结果，结 果见表l和图l， 5株标准抗铜菌株分别检测出1750 bp的扩增产物，而4株标准铜 敏感菌株未检测出扩增产物。
表l
标准大肠杆菌菌株 铜抗性 抗铜基因pcoA
LR100
DH1 (pRJ赠 HWS2 (pRJ100) AN194N (pRJ100) W3110 (pRJ100) DH1 HWS2 AN194N W3110
注标准大肠杆菌菌株保存在云南大学生命科学学院微生物实验室。实施实例二健康猪源大肠杆菌菌株中抗铜基因PCOA的检测
根据本发明的检测方法，对从健康猪粪便中分离到的4株抗铜的大肠杆菌菌 株进行检测。
1. 菌落培养物的制备
将从健康猪粪便中分离到的4株抗铜的大肠杆菌菌株与实验室保存的阳性/ 阴性株菌株分别划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37。C培养18h，得到单 菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10x PCR buffer, 10幽上游引物序，10刚下游引物序，10 , dNTP，用一个无菌的0.5-10叱移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR 反应液中混匀，2. 0 U Taq酶，反应体系40叱；
b.扩增反应条件94。C预变性8min; 94。C变性1.75 min、 55°C退火 L5min、 72°C延伸2 min、共进行33个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于l.O g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像分析结果，结 果见表2和图2， 4株抗铜的大肠杆菌菌株和阳性对照菌株分别检测出1750 bp的 扩增产物，而阴性菌株未检测出扩增产物。
表2
大肠杆菌菌株铜抗性抗铜基因pcoA
LR100+
DH1
W2a6+
G6a74++
Fd35++
G5d83++
注W2a6、 G6a74、 Fd35和G5d83分离自健康猪粪便中，保存在云南大学生命科学 学院微生物实验室。
实施实例三病猪源大肠杆菌菌株中抗铜基因/x^A的检测 根据本发明的检测方法，对从赤痢猪粪便中分离到的7株抗铜的大肠杆菌菌 株进行检测。
1.菌落培养物的制备将从赤痢猪粪便中分离到的7株抗铜的大肠杆菌菌株与实验室保存的阳性/ 阴性株菌株分别划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37。C培养36h，得到单 菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10x PCR buffer, 10幽上游引物序，10幽下游引物序，10 , dNTP，用一个无菌的0.5-10叱移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR 反应液中混匀，3. 0 U Taq酶，反应体系50叱；
b.扩增反应条件94。C预变性10 min; 94。C变性l. 75 min、 55°C退火 1.5min、 72°C延伸2 min、共进行35个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于2.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像分析结果，结 果见表3， 7株抗铜的大肠杆菌菌株和阳性对照菌株分别检测出1750 bp的扩增产
物，而阴性菌株未检测出扩增产物。 表3
大肠杆菌菌株铜抗性0-type/serotype抗铜基因pcM
LR100+
DH1—
1347/02-3+045
0021/03-3+0139+
227/03-1+0149彌，K99
193/03-1+0149+
1339/03+0141: K85ab+
334/04-7+0157: K82+
516/04-2+08: K87， K88+
注1347/02-3、 0021/03-3、 227/03-1、 193/03-1、 1339/03、 334/04-7和 516/04-2分离自赤痢猪粪便中，保存在云南大学生命科学学院微生物实验室。
权利要求
1、一种用PCR检测猪源大肠杆菌中抗铜基因pcoA的方法，其特征在于该方法包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备、抗铜基因pcoA的引物序列、PCR反应液组成、PCR扩增反应条件、及PCR扩增产物的检测方法。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用于PCR检测的猪源大肠 杆菌单菌落培养物的制备为将分离到的待检测的猪源大肠杆菌菌株划线接种在 牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在37 。C温度下培养18-36 h后得到单菌落。
3、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的抗铜基因/^oA的引物序列 为上游5， CGTCTCGACGAACTTTCCTG 3';下游5， GGACTTCACGAAACATTCCC 3，；。
4、 如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的PCR反应液组成 为10x PCR buffer, IO幽上游引物序，IOMM下游引物序，10 MM dNTP，用 一个无菌的0. 5-10叱移液枪头挑取一个单菌落作为DNA模板放入PCR反应液中 混匀，1.5-3.0 U Taq酶，反应体系20-50叱。
5、 如权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增反 应条件包括94。C预变性5-10min; 94°C变性1. 75 min、 55°C退火1. 5min、 72°C延伸2 min、共进行30-35个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于将扩增产物于0. 8-2. 0 g/L的琼 脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像分析结果。
全文摘要
本发明涉及一种用PCR检测猪源大肠杆菌中抗铜基因pcoA的方法，属检测技术领域。本发明的方法包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备；抗铜基因pcoA的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；及PCR扩增产物的检测方法。本发明不需要提取DNA，直接用猪源大肠杆菌培养物进行PCR扩增反应检测抗铜基因pcoA。本发明具有较好的特异性、可快速、经济地检测猪源大肠杆菌中的抗铜基因pcoA。
文档编号C12Q1/68GK101445833SQ20081023378
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者春 侯, 放 孙, 张智辉, 窦秋燕, 贡娇娜 申请人:云南大学