专利名称：猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的PCR检测方法
技术领域：
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本发明涉及一种猪源大肠杆菌中抗链霉素基因WrB的PCR检测方法，属检测技术领域。
背景技术：
长期以来抗菌剂(包括抗生素，硫酸铜等)被作为生长促进剂添加到饲料中，在增加动物养殖效益的同时导致高频率的抗生素抗性细菌的出现，这些抗性细菌携带的抗性基因可以被转移到在人类致病菌，这是对人类健康的潜在威胁。Aarestrup等推测禁止使用抗生素作为生长促进剂添加到猪饲料中后，在养猪场抗生素抗性细菌仍然保持高发生率的原因可能是由于铜仍然被添加到猪词料中作为生长促进剂，它们选择抗生素抗性细菌并维持了它们的发生率(Aarestrup， RM., H. Hasman， L. B. Jensen, " a/. 2002. Antimicrobial resistance among enterococcifrom pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)。链霉素抗性基因^"A和^"B广泛存在与人体、动物体、和植物体的正常菌群和病原菌中(Sundin, G. W., Monks, D. E. & Bender, C. L. Distribution of thestreptomycin-resistance transposon Tn5393 among phylloplane and soil bacteria frommanaged agricultural habitats. Co" JM/cra6fo/ 41， 792-799.)，四环素抗性基因fe《B)也是一个在革兰氏阴性细菌中常见的抗性基因(Roberts, M. C. Update on acquiredtetracycline resistance genes. F￡MS A/icrc Wo/丄e" 245， 195-203.)。这三个基因常被作为抗生素抗性基因的代表来进行检测。
目前我国的猪饲养业仍然在饲料中添加抗生素和铜盐、锌盐作为生长促进剂，这必然对猪肉产品安全造成威胁。快速检测猪源大肠杆菌中是否存在抗性基因对评价猪肉产品安全具有重要意义。而常规PCR检测程序需要从细胞中提取DNA样品，耗时长，试剂消耗多，造成检测样品周期长成本高。本发明采用猪源大肠杆菌单菌落直接做DNA模板，实现了用PCR方法快速、经济地检测猪源大肠杆菌中的抗链霉素基因rf/"B。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测方法之不足，而提供一种猪源大肠杆菌中抗
链霉素基因WrB的PCR检测方法。
本发明的检测方法包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备；抗链霉素基因^"B的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；PCR
扩增产物的检测方法。
其中，用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备方法将分离到的待检测的猪源大肠杆菌菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37 。C培养18-36 h，得到单菌落。
抗链霉素基因WrB的引物序列为上游5'GACTCCTGCAATCGTCAAGG3，；下游5'GCAATGCGTCTAGGATCGAG3'; PCR扩增产物大小为560 bp。
PCR反应液组成10xPCRbuffer, 10 pM上游引物序，10pM下游引物序，(3)10 nM dNTP，用一个无菌的0.5-10 ^L移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR反应液中混匀，1.5-3.0 U Taq酶,反应体系20-50 pL。
PCR扩增反应条件94。C预变性5-10min; 94。C变性l min、 55°C退火l min、72°C延伸2min、共进行30-35个循环；72。C延伸10min，于4。C下保存。
PCR扩增产物的检测方法将扩增产物于0.8-2.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像分析结果。
本发明与现有技术相比，具有较好的特异性，能在5h内完成对猪源大肠杆菌样品是否带有抗铜基因pcoA的检测，检测方法快速、简便、且经济。本发明为评价猪肉食品安全提供了一个技术手段，有良好的运用前景。
图l为本发明方法检测健康猪源抗铜大肠杆菌菌株中抗链霉素基因WrB的电
泳图，其中M:分子量标准1:抗铜大肠杆菌菌株W2a62:抗铜大肠杆菌菌株W2a513:抗铜大肠杆菌菌株Wc44:抗铜大肠杆菌菌株Wlcl25:抗铜大肠杆菌菌株G6a746:抗铜大肠杆菌菌株G5d87:抗铜大肠杆菌菌株G5d288:抗铜大肠杆菌菌株G5d689:抗铜大肠杆菌菌株Fd3510:抗铜大肠杆菌菌株G5d83
图2为本发明方法检测健康猪源抗锌大肠杆菌菌株中抗链霉素基因WriB的电泳图，其中M:分子量标准1:抗锌大肠杆菌菌株G4c692:抗锌大肠杆菌菌株G6a693:抗锌大肠杆菌菌株EW1-14:抗锌大肠杆菌菌株EW1-55:抗锌大肠杆菌菌株EW6-46:抗锌大肠杆菌菌株EW6-57:抗锌大肠杆菌菌株EW6-68:抗锌大肠杆菌菌株EW6-79:抗锌大肠杆菌菌株EW6-1010:抗锌大肠杆菌菌株LW1-7
图3为本发明方法检测病猪源抗铜大肠杆菌菌株中抗链霉素基因^"B的电泳图，其中M:分子量标准
1:抗铜大肠杆菌菌株1347/02-32:抗铜大肠杆菌菌株0021/03-3 3:抗铜大肠杆菌菌株227/03-14:抗铜大肠杆菌菌株193/03-15:抗铜大肠杆菌菌株1339/036:抗铜大肠杆菌菌株334/04-77:抗铜大肠杆菌菌株516/04-具体实施例方式
实施例一健康猪源抗铜大肠杆菌菌株中抗链霉素基因WrB的检测根据本发明的检测方法，对从健康猪粪便中分离到的10株抗铜的大肠杆菌菌株进行检测。
1. 菌落培养物的制备
将分离到的10株抗铜的大肠杆菌菌株分别划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基
平板上，37。C培养24 h，得到单菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10xPCR buffer, 10pM上游引物序，10^iM下游引物序，10 pMdNTP，用一个无菌的0.5-10 ^L移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR反应液中混匀，1.5UTaq酶，反应体系20 pL;
b.扩增反应条件94。C预变性5min; 94。C变性l min、 55°C退火l min、 72。C延伸2min、共进行30个循环；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于0.8 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVl凝胶成像分析结果，结果见表l和图l， 10株健康猪源抗铜大肠杆菌菌株中均检测出560bp的扩增产物。
表l
健康猪源大肠杆菌菌株 铜抗性 抗链霉素基因WrB
W2a6 ^ ^
W2a51 + +
Wlc4 + +
Wlcl2 + +
G6a74 + +
G5d8 + +
G5d28 + +
G5d68 + +
Fd35 + +
G5d83 + +
6注表中所列菌株为云南大学生命科学学院微生物实验室分离和保存。
实施例二健康猪源抗锌大肠杆菌菌株中抗链霉素基因WrA的检测根据本发明的检测方法，对从健康猪粪便中分离到的10株抗锌的大肠杆菌菌
株进行检测。
1. 菌落培养物的制备
将分离到的10株抗锌的大肠杆菌菌株分别划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37。C培养18h，得到单菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10xPCR buffer, 10pM上游引物序，10pM下游引物序，10 pMdNTP，用一个无菌的0.5-10 nL移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR反应液中混匀，2.0UTaq酶，反应体系40inL;
b.扩增反应条件94。C预变性8min; 94。C变性l min、 55°C退火l min、 72°C延伸2min、共进行33个循环；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于l.O g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVl凝胶成像分析结果，结
果见表2和图2， 10株健康猪源抗锌大肠杆菌菌株中均检测出560bp的扩增产物。表2
健康猪源大肠杆菌菌株锌抗性抗链霉素基因^HB
G4c69++
G6a69++
EW1-1++
EW1-5++
EW6-4+
EW6-5++
EW6陽6++
EW6-7++
EW6-10++
LW1-7
注表中所列菌株为云南大学生命科学学院微生物实验室分离和保存。
实施实例三病猪源抗铜大肠杆菌菌株中抗链霉素基因^"A的检测
根据本发明的检测方法，对从赤痢猪粪便中分离到的7株抗铜大肠杆菌菌株进行检测。
1. 菌落培养物的制备
将分离到的7株抗铜大肠杆菌菌株分别划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37。C培养36h，得到单菌落。
2. PCR扩增反应
反应体系10xPCRbuffer, 10pM上游引物序，10^M下游引物序，10 pMdNTP，用一个无菌的0.5-10 pL移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR反应液中混匀，3.0UTaq酶，反应体系50
b.扩增反应条件94。C预变性10 min; 94。C变性l min、 55°C退火l min、 72°C延伸2min、共进行35个循环；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 产物检测
将扩增产物于2.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UVl凝胶成像分析结果，结
果见表3和图3， 7株病猪源抗铜大肠杆菌菌株中均检测出560bp的扩增产物。表3
大肠杆菌菌株铜抗性O-type/serotype抗链霉素基因WHB
1347/02-3+045+
0021/03-3+0139+
227/03-10149:K88， K99+
193/03-1+0149+
1339/03+CM41:K85ab+
334/04-7+CM57:K82+
516/04-2+08: K87, K88+
注表中所列分离自赤痢猪粪便中，保存在云南大学生命科学学院微生物实验室。
权利要求
1、一种用PCR检测猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的方法，其特征在于反复该包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备；抗链霉素基因strB的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；及PCR扩增产物的检测方法。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备为将分离到的待检测的猪源大肠杆菌菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在37 。C培养18-36 h后得到单菌落。
3、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗链霉素基因st/B的引物序列为上游5'GACTCCTGCAATCGTCAAGG3';下游5' GCAATGCGTCTAGGATCGAG 3 ，。
4、 如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的PCR反应液组成为10x PCR buffer,10幽上游引物序，10幽下游引物序，10刚dNTP，用一个无菌的0. 5-10叱移液枪头挑取一个单菌落作为DNA模板放入PCR反应液中混匀，1.5-3.0 U Taq酶，反应体系20-50 ^L。
5、 如权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增反应条件包括94。C预变性5-10min; 94。C变性lmin、 55°C退火1 min、 72°C延伸2 min、共进行30-35个循环；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于将扩增产物于0.8-2.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像分析结果。
全文摘要
本发明涉及一种猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的PCR检测方法，属检测技术领域。本发明的方法包括用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备；抗链霉素基因strB的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；PCR扩增产物的检测方法。本发明不需要提取DNA，直接用猪源大肠杆菌培养物进行PCR扩增反应检测抗链霉素基因strB。本发明具有较好的特异性、可快速、经济地检测猪源大肠杆菌中的抗链霉素基因strB。本发明具有较好的特异性、可快速、经济地检测猪源大肠杆菌中的抗链霉素基因strB。
文档编号C12Q1/68GK101560551SQ200810233790
公开日2009年10月21日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者春 侯, 放 孙, 张智辉, 窦秋燕, 贡娇娜 申请人:云南大学