专利名称：梅、杏及杏梅的pcr快速鉴定区分方法
技术领域：
本发明公开了梅、杏及杏梅的一次PCR快速鉴定区分方法，属于生物技术领域，利 用特异引物快速鉴定区分梅、杏及杏梅的分子水平辅助鉴别方法，用于梅、杏及杏梅在 分子水平上的明确分类及种质资源的筛选与品种鉴定。
二背景技术：
梅(，"m^附訓e)，原产中国，已有几千年的栽培历史，根据不同的用途可分为花 梅和果梅。其中，果梅则是南方果树的代表树种之一，花梅则是我国重要的花卉植物； 杏(iVi/m^ "rw/w/aca)是中国栽培历史最久的果树之一，在我国北方也有大面积的栽 培。梅、杏都为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(ArmeniacaMill.)植物.
由于梅、杏的地理分布、亲缘关系以及某些品种的开花物候期重叠现象的存在等因 素的影响，两者存在着自然杂交的现象，又或者通过人工杂交等辅助手段培育出二者的 杂交种一杏梅。有研究报道梅与杏(iV"mw flnm'w/aca)、紫杏(i^a^c^pa人东北杏 (/^a"tfe^n'cfl)、和山杏(i^6/r/ca)产生能育的F1杂种(BoonprakobU，1990)的报 道。
川上繁(1951)，吉田雅夫(1971)调查了日本果梅的所有品种，并以托叶、茸毛、 节部内瘤等实用的形态为基础，判定其杂种程度，分类如下纯梅，杏性梅，中间系， 梅性杏，纯杏(中国果树志*梅巻)。虽然在地理分布以及形态学等生理指标(如开花早 晚等)常常作为区分出梅、杏的标准，但现实中，很多中间类型与梅或者杏、甚至纯梅 与纯杏间往往很难根据植物学性状进行正确的区分。对于杏梅这个杂交种来说，无论是 在形态特征上还是生理生化水平上都介于梅、杏之间，分别具有梅、杏的特征，使梅、 杏的具体分类产生了混淆，目前尚未有一种有效的方法对三个种进行明确的鉴定分类。
AFLP (Amplified fragment length polymorphism)是扩增片段长度多态性，是基于 PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，它结合了 RFLP和PCR技术特点，具有 RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。AFLP扩增可在不同品种间形成特定 的DNA谱带指纹。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，根据这些片段 进行多态性或其它分析。本实验通过AFLP对梅与杏不同品种进行多态性分析， 并选择梅与杏不同的特异性公共片段进行回收进一步克隆测序。
通过对大量所克隆片段的序列进行分析，发现了大部分序列相同但长度有异的梅与 杏的特异性序列。杏与梅的序列区别在于中间插入了一段68bp的片段。根据所克隆的 序列设计合成特异性引物，对更大量梅、杏、杏梅品种进行PCR扩增，再通过凝胶检 测等一系列技术，发现这一对引物能够有效地在DNA分子水平上鉴定区分梅(pn/m^ wwme)、杏(apricot)及其杂交禾中(hybrid)杏梅(Armeniaca mume Sieb. var. bungo Makino), 为三者的种质资源筛选、品种鉴定提供了可靠的快速鉴定技术。
三、 发明内容技术问题本发明的目的是根据梅与杏的扩增片段长度多态性(AFLP)的公共 片段开发两种树种的特异的序列，并根据序列设计引物，达到能够在分子水平上快速鉴 定区分梅、杏及两者杂交种杏梅，不仅为三者的明确分类提供了可靠的方法，也为种质
资源的搜集与筛选提供了理论依据。本技术的优势是利用一对引物通过一种PCR反应
体系即可达到区分杏、梅以及杏梅的目的。
技术方案本发明的实施方案如下
一种用特异性引物区分梅、杏的分子标记辅助鉴别方法，其特征在于
用标记引物2MMF/2MMR 左端弓I物序列AGGACTCAAGATCAGAATCATATTATAA 右端引物序列TTTAGTCCTCAACTTTGGAT
扩增不同地区的梅(包括果梅和花梅)、杏及杏梅的基因组DNA，如果能够分别扩 增出片段大小321bp的为梅，扩增出片段大小387bp的为杏，同时扩增出片段大小321bp 和387bp的为杂交种杏梅。
有益效果
本发明获得了能够快速鉴定区分梅，杏，杏梅的分子辅助鉴别方法，其优点是
(1) 技术稳定。本研究以梅，杏，杏梅的基因组DNA为鉴定材料，DNA遗传稳 定，与普通生理生化指标区分方法不同，不受年份，环境条件的影响。
(2) 操作方便，快速准确。利用一对特异性引物， 一次PCR就能够将梅，杏，杏 梅在分子水平上区分开；常规的生理生态指标的区分方法耗时长，对于杏和杏梅来说， 在形态特征和生理指标上具有极大的相似性，很难区分开；通过本发明探索出了简单， 快速，准确的区分三个种的方法，筛选出特异引物，建立PCR快速检测技术，减少了 工作量，提高了种质资源搜集的准确度。
(3) 利用该特异引物可以实现苗木的早期鉴定，即该方法可以在苗期就能明确区 分出三个种，对各树种的生产栽培及种质圃的苗木移植具有指导作用。也可以用于进行 我国杏、梅及杏梅地理分布的研究。
四
图l 2MMF/2MMR在果梅上的扩增结果
左右共IO个泳道为果梅代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为莺宿、四川 黄梅、南红、红顶、小欧、七星梅、墨梅、养老3号、福建白粉、细叶青；中间为Marker, 从下至上的四条标记片段大小分别为250bp,500bp,750bp,1000bp;箭头所示为大小321bp 的目的片段。
图2 2MMF/2MMR在花梅上的扩增结果
左右共20个泳道为花梅代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为南京红顶、 扬州墨梅、南京墨梅、佐乔红、银红朱砂、早朱砂、白牡丹、三轮玉蝶、扣瓣大红、人 面桃花、玉露宫粉、虎丘晚粉、粉皮宫粉、大宫粉、小宫粉、粉玉宫粉、香富宫粉、虎 丘宫粉、粉晕宫粉、乙女宫粉；箭头所示为大小321bp的目的片段。图3 2MMF/2MMR用于杏的扩增结果
左右共15个泳道为杏的代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为二红杏、白
玉扁、鸡蛋杏、大白杏、优l、曹杏、菜籽黄、新疆沙杏、早核甜、柿子杏、巴斗、关
爷脸、法l、早香白、绿萼山杏；中间为Marker,从下至上的四条标记片段大小分别为 250bp,500bp，750bp,1000bp;箭头所示为大小387bp的目的片段。 图4 2MMF/2MMR在杏梅上的扩增结果
左边的泳道为杏的代表品种扩增结果，品种依次为新泻大实、红荷包、龙井白杏、 东宁2号、蜜陀罗、法2、龙王帽、红金榛、李光、串枝红杏、邢台红接杏、房山红杏； 箭头所示的片段大小为387bp，右边的泳道为2MMF/2MMR在花梅和果梅上的扩增结 果，品种依次为六萼玉蝶、素白台阁、重叶梅、龙泉玉蝶、小绿萼、二绿萼、月世界、 横核、花香实、软条红梅、甲州最小、小梅；箭头所示的目的片段大小为321bp。
图5特异引物2MMF/2MMR在杏梅上的扩增结果
图为引物在杏梅上的扩增结果，品种从左至右依次为辽梅杏、武藏野、江南无所、 丰后、云南丰后、蝶羽重、送春、杨贵妃、云南杏梅、束花送春、北京丰后、高田丰后、 綦江杏梅；根据Marker的指示标记表明，杏梅扩增出了与梅片段相等和与杏片段相等， 大小各为321bp和387bp的两个目的片段。
五具体实施例方式
本发明的实施程序是
(一) 材料与方法本研究所用的梅96个品种、杏梅13个，杏52个品种。品种 名称详见表l (均为公知公用品种)。
(二) 特异引物筛选分析主要利用AFLP开发特异性PCR引物
本实验DNA的提取采用美国QIANGEN科技公司的DNeasy Plant Mini and Maxi Kit试剂盒。
根据梅与杏扩增片段长度多态性(AFLP)得出的200-900bp的公共片段用来开发 两种树种的特异性引物。其中一对引物可以在不同品种的梅和杏中能扩增出大小不同的 片段。根据这对引物对随机选取的更多个品种的梅和杏进行验证获得了同样的结果。
弓I物设计是禾U用软4牛Primer 3 (http:〃www.embnet.sk/cgi-bin/primer3_www.cgi)。所
合成的特异引物为
2MMF: AGGACTCAAGATCAGAATCATATTATAA
2MMR: TTTAGTCCTCAACTTTGGAT
根据特异引物对梅、杏的DNA进行PCR扩增，(EppendorfAG扩增仪)PCR反应 体系为20ul，其中10XBuffer2.0ul， 25mMMgCl2 1.6 u 1， 2mMdNTP1.2 u 1， 10 y M引物对0.8ul， 5单位/ulrTaq酶0.2iU，模板DNA20ng，力卩ddH20至20 u 1;
PCR反应程序为94。C2min预变性后，接着94'C变性30s， 5rC退火30s， 72°C 延伸60s， 38个循环；PCR产物于1.4%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束 后在UVP成像系统上自动成像，发现杏、梅均能扩增出大小不等的片段，将这些片段进行回收克隆测序，结果为所有梅的片段大小为321bp (图l、图2)，所有杏的片段大 小为387bp (图3)，说明这对引物能将杏，梅区分开。
以同样的方法对梅、杏的杂交种杏梅的DNA进行扩增，经电泳分离后，发现同时 扩增出了大小321和387bp的两个片段(图4、图5)，从而获得了区分梅，杏，杏梅三 个种的特异性引物。
(三)结果与分析
本研究表明通过AFLP分子标记可以开发植物的特异性PCR引物用于植物的快速 区分，而我们在梅、杏中获得2MMF/2MMR引物的结果更使对梅、杏、杏梅进行鉴定 区分的效率更为快速。通过这一对引物进行PCR反映就可根据是否分别相应地扩增出 大小为321bp， 387bp， 321 bp和387 bp的目的片段来快速区分梅、杏、杏梅三者，即 扩增出片段大小321bp的为梅，扩增出片段大小387bp的为杏，扩增出片段大小321和 387bp的为杏梅杂交种。这是国内首次有关通过一对引物的PCR就可以鉴别李属植物 的报道。实验以DNA为鉴定材料，体现出不受年份，环境条件的影响，技术稳定以及 结果科学可靠的效果。
本发明建立了利用分子水平辅助鉴定梅、杏、杏梅的技术体系。筛选出了特异引物 2MMF/2MMR，并建立了一个PCR的快速检测技术，这种鉴定方法与起常规的生理生 化鉴定方法相比，准确，快速，减少了工作量，明确了三者的分类，提高了种质资源筛 选以及苗木纯度鉴定的准确度。
表l实验所用品种名称及类型
编号 杏 果梅 花梅 杏梅
1
2
3
45
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
綦江杏梅 ，田丰后 云南杏梅
杨贵妃 送春
蝶羽重 云南丰后 丰后
武藏野 江南无所 束花送春 北京丰后
辽梅杏
沧早甜1号 草坯杏 绿萼山杏
号
房山红杏 邢台红接杏 串枝红杏
李光 红金榛 龙王帽
红粉粉粉粉粉纷纷粉粉粉每粉粉雜 粉蝶阁
京宫宫宫宫宫，^宫晚宫"宫宫那粉宫玉厶口
旨，r I ￡ I ￡ t ^皮丘露的口萼别淡妆萼白
，粉虎Hi杉粉多诗 分」、
南女晕丘富玉
早乙粉虎香粉
云
素
界多实
贺e.梅梅它梅
梅
s核躬红最梅城w英别别花钟后萼宿黄红顶
世誇香^W卜S力E田5早^丰绿莺川南红
月f花
条州小古
软甲 白
i节高
魁杏达杏2河杏名红s
寒红巴荷黄安黄无寨农
豫早大子韶北山美北新
卬注以上品种均为公知公用品种，
杏品种参见《中国果树志*杏巻》，张加延张钊主编中国林业出版社出版 果梅品种参见《中国果树志*梅巻》，褚孟嫄主编，中国林业出版社出版
花梅品种参见《中国梅花》，陈俊愉主编，中国海南出版社出版；中国名花丛书《梅花》，张行 言，包满珠，王其超编著，上海科学技术出版社出版
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
重叶梅 龙泉玉蝶 小绿萼
二绿萼
云南绿萼 大轮绿萼 绿萼台阁
变绿萼 云锦朱砂 白须朱砂 人面桃花 扣瓣大红 三轮玉蝶
白牡丹
早米砂 银红朱砂
佐乔红
扬州墨梅 南京红顶 粉红朱砂 乔妆玉蝶 ，州玉蝶 云南红梅 早黄香
玉蝶游龙梅
梅
2
肝
别梅梅梅梅g梅青高
丌花红红红.f'眼里旨
I- I 3L hL p、一 M 、E -41 1B
梅
1^7
种梅青
山青叶
刚红早中迟W龙叶有J卫小细
白罗
香陀
紹早蜜、y关e柿早亂針賊菜谁曰
斗
杏核l認黄
子甜
杏
录
铜
梅郎梅
盅五老
梅
/，
蒂梅
肝皮
中
禾
酒腾养g大双
I杉.K者BBr每禾
拔M $菊黄柏-.宝
场W I 41JK I米
蜂
窝
优
包
荷
红叶东墨
大广
大
实
泻
杏杏扁杏杏沙接榛杏￡达杏杏红黄头
白蛋玉红和蜜窝顶卢f八椒香金角偏
红船大鸡白二平青头平葫^红辣蜜沙牛大
房
香香枝枝枝枝
4k、 4k、 UK 6j Bj 6.1
袁P\垂垂垂31
瓣瓣雪碧碧红
复复残单双骨SEQUENCE LISTING
<110>南京农业大学
<120>梅、杏及杏梅的PCR快速鉴定区分方法
<130> 说明书
<140> 00
<141> 2008-11-17
<160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213>合成
<220>
<221>标记引物2MMF/2MMR左端引物序列
<222> (1)..(28) <223>
<400> 1
aggactcaga atcagaatca aattaaaa 28
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213>合成
<220>
<221> 标记引物2MMF/2MMR右端引物序列
<222> (1)..(19) <223>
<400> 2
tttttcctca catttggat 19
权利要求
1、梅、杏及杏梅的PCR鉴定区分方法，其特征在于用标记引物2MMF/2MMR，左端引物序列AGGACTCAAGATCAGAATCATATTATAA右端引物序列TTTAGTCCTCAACTTTGGAT扩增不同地区的梅，杏或杏梅杂交种基因组DNA，能够扩增出片段大小321bp的为梅，大小387bp的为杏，同时扩增出片段大小321bp和387bp的为杂交种杏梅。
全文摘要
本发明涉及用一对特异引物快速鉴定区分梅，杏及杏梅的分子水平辅助鉴别方法，属于生物技术领域，用于梅，杏及杏梅的明确分类、苗木早期鉴定及种质资源的遗传评价。用引物2MMF/2MMR扩增梅、杏及杏梅的基因组DNA，通过分析能否扩增出321或/与387bp的片段，则能根据梅特异性片段(321bp)和杏特异性片段(387bp)的存在判断出是否为梅或杏以及杏梅。本发明获得了能够快速鉴定区分梅，杏，杏梅的分子辅助鉴别方法，技术稳定，操作方便，快速准确。利用该特异引物可以实现苗木的早期鉴定，即该方法可以在苗期就能明确区分出三个种，对各树种的生产栽培及种质圃的苗木纯度分析以及遗传资源筛选具有指导作用。
文档编号C12Q1/68GK101457257SQ200810234569
公开日2009年6月17日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者上官凌飞, 房经贵, 李晓颖, 镇 章 申请人:南京农业大学