核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术的制作方法

专利名称：核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于一种核盘菌群体中抗药性基因频率的实时检测方法，可用于监测苯 唑类杀菌剂抗性核 盘菌群体发展动态，进行抗药性油菜菌核病的流行预測。 二、技术背褒
油菜菌核病是由核盘菌&&rotfn'a sc/mtftorum(Lib.) de Bay引起的一种世界性病害，严重影响油菜 的产紫和品质，长期以来采用苯并味唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并味唑 类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提 髙了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫窜灵等。这些杀菌 剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于 这类药剂的商度专化性，作用位点单一，加上施用频率离，使用2~3年后许多植物病原真菌群体中就 会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。近年研究证明，核盘菌对多菌灵的抗药性产 生是因为细胞中P-微管蛋白基因发生突变，使编码的蛋A质二维构象和电性分布改变，从而失去了与 药剂分子的亲和性。&魂管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原 菌产生田间抗药性的主要原因。
由亍病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例很低时(1%~5%)即可引起抗药性病害 流行，使药剂防治失败，传统的检測方法霈要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对 齒丝生长的效应鉴别抗药性，这种对药剂的敏感性測定方法通常霜要几周时间，工作量大，測定样本数量 有限，抗药性基闵频率在1%以下时难以发现。因此，传统的抗药性监拥方法只能核实药剂防治失败是否 由于抗药性造成，不能早期预醬。早期检测病原群体中抗药性生理小种航药性基闭的频率，及早实施抗 药性治理策略和实施早期预警，是抗药性治理最有效的措施。在抗药性机制研究基础上，根据基芮点突变 的原理，应用常规的核黢技术如ASO"PCR技术等检測病原真菌对多菌灵等苯并咪嗖类杀菌剂的抗药性， 则能快速、准确检測样本，但一个PCR反应体系只能检测一个菌株对多菌灵杀菌剤的敏感性，而且也只 能在整个PCR反应体系结束之后通过电泳检测获得所拥定的单个菌株对多菌灵敏感性。实时定量PCR (Real-time qu旭titotive PCR) ^则改变了病原菌对杀菌剂敏感性的检测只錄单个样本进行检翻， 它具有(1)检測的高通量，即在一个腿体系中，可以对所有待检样品对杀菌剂的敏感性翻定(2〉检 糖结果的实时性，在PCR反应进行中可以了解样品中抗药性菌株亚群体的大小(3)离效性，经典的平 皿法、常规的ASOuPCR^术測定抗药性菌株只能进行单个对杀苗剂的敏感性的M定，而这种方法则同
时对烛样品进行测定，耗时仅为6小时，可以准确了解当年的抗药性苗tiaE群体发生、发展、流行的态
势，有效的指导当年用药，(4)使在早期4^H低頻率的抗苗性基因成为可能，
作者已研究实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法检測抗多菌灵的核盘菌，包括样品的 前处理、基闵组DNA的提取、实时定量PCR扩增的过程。

发明内容
4技术问题本发明的目的在于提供核盘菌抗多菌灵菌株亚群体一种快速检測方法。现有技术针对ASO-PCR探针特异性较差，为Real-time PCR进行探针的重新设计，反应体系优化。经过优化的反应体系和反应条件后，实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)能在油菜发病期6小时内进行大量、简便的抗药性亚群体的检测，检测准确率达到95%以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。
技术方案核盘菌抗多菌灵的检测基因，其e-微管蛋白基因，长度为1685 bp,相应的编码e-微管蛋白的477个贫基酸，包含第l诉位筑基酸的抗药性突变位点Glu(GAG)—Ala(GCG).
一种核盘糖抗多苗灵的检菊方法， 一种核盘菌抗多菌灵的糊方法，共分三步，
第一步:采用常规的苯酴■氯仿■异戊醇法，分别提取已知抗药性菌林、敏感性菌抹和待测样品的核基因组DNA。
第二步运用抗药性菌抹和核盘菌菌抹的特异性检测引物和SY肌Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌抹和核盘菌菌^测的标准曲线.
核盘菌群体中抗药性基因频率的髙通量实时检测技术的关键是用于实时定量PCR的引物具有特异性，设计的依据是抗药性菌株在P-微管蛋白第198为由Glu(GAG)—Ala(GCG)。
① 扩增核盘菌P-微管蛋白基因片断的特异性引物对
上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3'下游引物SclAF: 5， - TGCAGAfGGGTAATATG -3，
② 扩增核盘菌抗药性基因片段的特异性引物对
上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGACAC-3,
下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3，实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序(1)核盘酋总量检拥的标准曲线腿体系，
dH20 (灭菌蒸馏水) 9jjLSYBRa/^iwicficrag (2x) 12单SclSF(10)iM) 0'25mLSclAF(10(iM) 0.25mLROX Reference Dye (50X) 0.5|iL
DNA植板_2.0nL
总体积 25jiL
rw綠
预变性95°C 10s变性951C 5s
5退火55.8" 31s40个循环
延伸72"C 5minDissociation protocol 58*C(2)抗性核盘苗量的标准曲线反应体系，
dH20 (灭菌蒸馏水) 9jiLSYBR* i>>ie iix及21^ (2 X ) 12.5jiLRFP4(10pM) 0.25jjLRRPUOmM) 0.25jjLROX Reference Dye (50X) 0.5pL
DNA鄉_2.0uL
总体积 25nL扩坩綠
预变性951 10s
变性95" 5s退火621C 33s40个循环
1
延伸72" 5min
Dissociation protocol 58"C第三步待测样品分别运用上述两种特异性引物进行相应的扩增体系和扩增M进行实时定量PCR反应，根据已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌林和敏感性菌林的数量和抗药性菌^Mt核盘菌总量中的比例.
有Ji效果本发明核盘菌抗多菌灵亚群体的检测方法，与现有技术相比，
1.实时定JtPCR (Real-tl鹏quantitative POO旅彼了病原菌对杀飾敏感性的糊只雌行单个样本检翻，与常规的平JMtt测和AS(hrcR^^检l8相比，具有如下优点和积极效果.
(1) 检测的高通量，即在一个反应体系中，可以对所有待检样品对杀菌剂的敏感性测定
(2) 检测结果的实时性，在PCR反应进行中可以了解样品中抗药性菌株亚群体的大小
(3) 髙效性，经典的平皿法、常规的ASO-PCR等技术测定抗药性菌株只能进行单个对杀菌剂的敏感性的测定，而这种方法则同时对大量样品进行测定，耗时仅为6小时，可以准确了解当年的抗药性菌株亚群体发生、发展、流行的态势，有效的指导当年用药。
(4) 使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能，(5) 本发明是国际上首次对核盘菌抗多菌灵的检测基因的扩增引物引入人为的错配，提高对抗药性基因扩增的特异性和扩增效率，并将获得的优化引物运用到实时定量PCR (Real-time quantitativePCR),进行抗多菌灵杀菌剂的抗药性亚群体检测
2、 目前国内其他研究单位均采用菌丝生长法检测核盘菌抗药性，但该方法涉及采样、分离培养需要3d和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长。ASO-PCR技术虽然可以快速、简便地检测和监测抗药性菌株，但是每个反应只能检测一个菌株对多菌灵的敏感性。实时定量PCR则可以在一个反应体系里将全部待测样品对多菌灵抗药性水平检测出来，在PCR反应的进行中即可知道该反应的动态结果。这种方法具有髙通量、快速、节本。这对及时了解抗药性病原菌亚群体的发展动态，及时、合理地指导科学用药，有效治理抗药性，以及降低成本和减少环境污染具有现实意义，
3、 在所測定的200株核盘菌中约有38%的菌株对多菌灵具有抗药性(表3)，这个实时定量PCR瀏定结果与
传统菌落直径法测得的结果(36.9%)相吻合，
四

图1引物(RFP4、 RRP)浓度为0.2jiM时的扩增图谱
图2优化后的扩增图谱(引物RFP4、 RRP)
图3不同浓度模板的定量扩增曲线
图4不同浓度模板的定量扩增产物电泳图谱
(上图为引物RFP4、RRP,下图引物为SclSF、SclAF, 1 6引物浓度分别为1.4X 10-3ng/pL 、 1.4X l(T2ng^L、1.4X1(TVjjL、 1.4ng/nL、 14ng/^L、 140ng/nL)图5引物对SclSF、 SclAF的PCR扩增条件
图6弓l物SclSF、 SclAF的定量扩增曲线
图7核盘菌定量标准曲线
图8引物对RFP4、 RRP的PCR扩增条件
图9引物RFP4、 RRP的定量扩增曲线图IO抗性核盘菌定量标准曲线图ll引物SclSF、 SclAF扩增产物的熔解曲线图12引物RFP4、 RRP扩增产物的熔解曲线图13模板浓度过髙时(未稀释)的扩增曲线
五具体实施例方式
实維例1、适用于实时定量PCR (Raaltim quantitative PCR)特异性引物簾逸.
0-微管蛋白基因l诉位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala)是导致核盘菌(S. scferoft'orwm)产生对多菌灵田间抗药性的主要原因，其相应的密码子由GAG突变为GCG,根据这一点突变设计了可以扩增出抗性核盘菌特征性条带的上游ASO特异性引物5，-TGGTCGAGAACTCTGACGC-3，，该引物不能用于实时定量PGRttM,因为在^ 产物中 二级结构由于SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料，但它不能选择特定的DNA模板，所以此法定量就要求弓l物不能形成二聚体，不产生错配。此外，
在本发明中抗药性菌株与敏感菌株相比，只在e-微管蛋白基因序列上有一个碱基发生了改变(A—C),因
此就给引物的设计增添了更大的难度。在PCR反应中，弓l物3'末端是弓l发延伸的关键，理论上3，末端错配，弓l物就不能与模板正确杂交引导序列延伸，PCR反应就不能进行。然而，在实际PCR过程中3'末端错配的引物还是会扩增出条带，造成了结果的假阳性。为了避免假阳性，对ASCWCR进行了改良(K. Hayashi，2004)。在设计引物时，设计了一系列在近3'末端加入人工错配的引物，从中进行了特异性引物的筛选。上游引物RFP1 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC(K>3，)
RFP2 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACCC-3')
RFP3 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC2t>3，)
鹏4 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACSj')
RFP5 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAA4C-3，)
RFP6 ( 5，-TGGTCGAGAACTCTGAG4C-3，)
RFP7 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAC 7C-3，)
RFP8 (5，誦TGGTCGAGAACTCTGAy4rc-3，)
RFP9 (5'-1001\:0八6^(:7070八17103,)
RFP10 (5，-TGGTCGAGAACTCTO71E403')
RFP11 (5'-TGGTCGAGAACTCTG( G4C-3，)下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGGC-3，)
筛选的反应体系
10 x buffer 5fiL
MgCl2(25mM) 5pL
dNTP U0mM) l^iL
RFP4、 RRP (10pM) 各0.8pL
DNA模板(50jig/mL) 2^L
T叫DNA聚合酶(5U/pL) 0.5pL
dH,O (灭菌蒸馏水)_补充至50uL
总体积筛选的扩增条件
预变性951C
50pL
10min
35个循环
延伸72t: 5min4
s s s
5 o o
3 4 4
9 6 7
性火伸
变退延4t:保存
先用以上弓I物分别对标准菌株JSJ2 (对多菌灵敏感菌株，釆自江苏省)和JSJ6 (抗多菌灵菌株，采自江苏)进行梯度PCR (52~641C)扩增，结果以引物对RFP4、 RRP在62TC扩增结果最好，即保证了对抗性模板DNA的特异性又有较好的扩增效率。而其它引物要么不具有对抗性模板DNA的特异性，要么就因为加入的人工错配太多无法扩增出目的片段。用筛选出的引物对RFP4、 RRP对其它十二个不同抗性表型的核盘菌菌株进行扩增，结果证明，RFP4、 RRP只能从抗性核盘菌株的基因组DNA中扩增出条带，十二个菌株中的抗性菌株检出率为100%,对敏感菌株无扩增.实旌併2. SYBR Qreen I荧光染料定釁PCR体系优化
2.1退火湿度为了保证检测的稳定性和可靠性，实验选用了宝生物工程(大连)有限公司的SYBR iV wix fit fag (Perfect Real Time) DRR041S试剂盒。该试剂盒中的酶、M^+、 dNTP等已经过优化，只需加入自己的模板和引物，因此，实验只对退火温度和引物浓度进行了优化。
退火mSTm值是反应特异性的重要保证，如果退火MS过低就会产生4辨异性扩增，所以选择较商的退火^a能够大大减少引物与模板之间的非特异性结合，提髙PCR反应的特异性，但太髙的退火Mfi又会,扩增效率，因此需要对其进行优化。实验中对引物RFP4、 RRP和SclSF、 SclAF的退火温度分别以62"和57TC为基础，以0.3 1C的幅度微调，结果发现引物RFP4、 RRP在退ikmS为62TC魄抓扩增效率高，JiT增信号納扩增曲线平滑，且ARn駄，而未优化前，扩增信号Jg^(扩增曲线呈锯齿状，厶Rn值小。引物SclSF、 SclAF在退火aS为55.81CBm測结果旨。
2.2引物泉dt当PCR引物浓度太低，则产物量降低，会出现假阴性，引物浓度过髙会促进引物的错误
引导非特异性产物合成,还会增加引物二聚体的形成，造成假阳性或定量误差。根据SYBR*1 iSc 3^
(PerfectReal Time)DRR041S试剂盒说明书推荐的反应体系进行扩增时，发现由于引物浓度(0.2jiM)太髙，
即使未加模板的阴性水对照(NTC)在反应进入35个循环后也会产生非特异性扩增信号,因此在0.1 0.2jiM
范围内调整引物浓度，最终确定引物最佳浓度为O.ljiM。此时扩增效率较离，且基线平整，阴性对照(NTC)
无信号检出(图1〉。
在退火温度和引物浓度优化条件下，实时定量PCR扩增图谱见图2。
实施例3 SYBR O關I荧舰料定JtPCR的灵敏
将菌株JSJ6基因组DNA的标准品梯度稀释成10个梯度140 ng^iL 、 14ng/nL、 1.4ng/i止、1.4X10.VnL、 1.4X10-2ng/nL、 1.4X 10-3ng/nL、 1.4X10"VnL、 1.4X10-ing/nL、 1.4Xl(^ng/!jL、 1.4Xl(r7ng/|jL，分别用两对引物定量扩增；得到的扩增图谱(图3)中，当模板浓度小于1.4X10—Sng/iiL以后其扩增曲线的荧光值低于域值;而产物经1.5y魂脂糖凝胶电泳检测，当模板浓度小于1.4X10-Zng/jiL后无电泳条带(图4)。由此可知，SYBR Green I荧光染料定量PCR可检测到的样本浓度最低值为1.4Xl(r3ng/jiL (每25jiL体系2.8X 10-3吸3.17X 1(^copy)，灵敏度至少是普通PCR检测方法的10 100倍。
实施併4.核盘苗总量的标准曲线
将核盘菌".scferoft'onwi)与其它常见植物病原线状真菌e-微管蛋白基因通过BLAST比较，发现氨基酸水平上同源性较髙，为95.78%~97.66%，但所含内含子数目及大小不同，根据这一差异设计了可以扩 增出抗性核盘菌特征性条带的下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGG03,和可以特异性扩增核盘 菌(S.wfeTOrion卵〉片断的引物对SclSF(S，- CTCAAATCTCCGAAAGTT -3，)、 SclAF(5，- TGCAGACGGG TAATATG -3，)'
反应体系:
扩增条件:
dH20 (灭菌蒸馏水) 9jiL SYBR②/V i ir fic Tog (2 X ) 12.5pL SclSF(lO一) 0.25^L SclAF(lOpM) 0.25fiL ROX Reference Dye (50 X ) 0.5iiL DNA樓板_2攀
总体积
预变性951C
25pL
10s
变性95X: 退火55.8TC 40个循环
延伸72" Dissociation protocol
5s 31s
5min 581C
根据灵敏度实验中确定的检测限，将菌株JSJ6基因组DNA的标准品梯度稀释成6个梯度:140ng/pL 、 14ng/jiL、 L4ng/pL、 1.4X10"ng/jiL、 1.4X 10-2ng/ML、 1.4X 10-3ng/(iL,用引物SclSF、 SclAF扩增，得到 的扩增图谱中，可见到的荧光值增加时对应的循环数与用于定量的标准品的浓度梯度成负相关性(图6), 得到的标准曲线(图7)为Y="3.41X+27. 30 R2=0.999 (Y:Ct,X:模板质量对数)
实施倒5.抗性核盘h的标准曲线
反应体系:
dH20 (灭菌蒸馏水) 9jiL SYBR* /VBwir ￡r rag (2 X ) 12.5(iL RFP4 ( IOjjM ) 0,25jiL RRP(l(H)M) 0.25pL ROX Reference Dye (50X) 0单 DNA樓板_2攀
总体积
10扩增条件(两步法，图8)
预变性95"C 10s
变性95TC 5s 退火621C 33s 40个循环
延伸72XJ 5min
Dissociation protocol 58X1 用引物RFP4、RRP扩增菌株JSJ6基因组DNA6个浓度梯度的标准品，得到的扩增图谱中，可见到的 荧光值增加时对应的循环数与用于定量的标准品的浓度梯度成负相关性(图9)，得到的标准曲线(图IO) 为Y=~3.45X+25.60 R2=0. 998 (Y: Ct, X:模板质量对数)
实施例6.定悬POH的格解曲线
从熔解曲线分析定量PCR体系反应产生的扩增产物可知弓|物SclSF、 SclAF扩增得到的产物的熔解 温度(Tm)为83,8TC (图11);引物RFP4、 RRP扩增得到的产物的熔解温度为85.21C (图12):波峰髙 低与模板浓度成正相关性基线平稳，只有一个熔解峰，证明无引物二聚体产生和非特异性扩增，产物特 异性好，
实施例7 2004^Ql苏省通州市油mJ:的核盘菌对多菌灵抗蓊性的快速m
将采集回来的每株油菜茎杆中的菌核精确称取15.00mg, —起混匀(共200个菌株)，提取(李红霞， 陆悦健，周明国，王晓峰.油菜菌核病菌P-微管蛋白基因与多菌灵抗药性相关突变的研究.中国油料作物学 报,2003,25(2):56-60.)基因组DNA，用紫外分光光度计检查浓度，并将其稀释致140ng/nL~1.4Xl(T3ng/nL 之间(此时结果的线性关系最好，当模板浓度太大时，SYBR Green I会在反应初始阶段就与模板结合，造 成基线上翘，荧光背景过髙，如图13)加样检测，以抗性菌株JSJ14提取的基因组作为阳性对照，敏感菌 株HM3提取的基因组作为阴性对照，检测结果见表l、 2。
从以上结果可以得出，在所测定的200株核盘菌中约有38%的菌株对多菌灵具有抗药性(表3),这一
结果与传统菌落直径法测得的结果(36.9%)和普通ASOPCR检测的结果(39%)相吻合。 实施例8 2005 ^tl苏省句容市油菜茵核病病组^J^多菌灵抗苗性Sff体的^K)iftlN
将2005年采集回来的病组织，随机选择100个，在每个病组织的病健交界处用取样器取0.2mm直径 的样品，混合，加石英沙研磨，提取DNA，用紫外分光光度计检査浓度，并将其稀释致140ng/fiL 1.4X 1(^ng/^L之间，加样检测，以抗性菌株JSJ14提取的基因组作为阳性对照，敏感菌株HM3提取的基因组 作为阴性对照，病原菌总量(8.40±0.59) ng,抗药性亚群体总量为(2.69±0.34) ng,抗药性病原菌亚群 体占(32.02±0.07)%;采用常规的方法，将病原菌从所測定的病组织上分离、培养、PSA平皿测定病原菌 对多菌灵的敏感性水平，经测定抗药性菌株占总体的比例为31%。采用Real-time quantitative PCR方法测 定的准确率为96.7%.
11实旌例9 ^t检測田间^的孢^:药性3EffiM^i!率
将2005年采集回来的孢子，随机分离100个孢子，培养、PSA平皿测定病原菌对多菌灵的敏感性水 平，经测定抗药性菌株占总体的比例为52%。提取所采集孢子的DNA,用紫外分光光度计检查浓度，并 将其稀释致140ng/pL 1.4Xl(T3ng/^iL之间，加样检测，以抗性菌株JSJ 14提取的基因组作为阳性对照， 敏感菌株HM3提取的基因组作为阴舰照，病原菌总量(9.80±0.67) ng/jjL，抗药性亚群体总量为(5.21 ±0.51)ng/nL，抗药性病原菌亚群体占53.16%,采用Real-time quantitative PCR方法测定的准确率97.7%。
表l核盘菌总数(引物SclSF、 SclAF)的定量结果
SampleCtStdDevCtQ yStdDevQtyMean Qty
JSJ1425.174.23
JSJ1424.910.185.050.564.42
JSJ1423.263邻
HM326.421.82
HM323.810,322.740.492.37
HM325.912.36
sample23.939.抑
sample24.030,109.140.669.80
sample23.8310.46
表2抗性核盘菌(引物RFP4、 RRP)的定fi结果SampleCtStdDevCtQtyStdDevQlyMean Qty
JSJ1423.384.41
JSJ1423.190.215.000.614.40
JSJ1423.613,78
HM3UndetUndeL
HM3Und汰/Und汰//
HM3UndetUndeL
Sample23.663.65
sample24.190.462.571.083.65
sample23.274.73
表3抗性核盘菌占群体总数的量 Table3 Quantification of MB&resJstant&sderotforMn ingoups
SampleAmount of ￡w/ewA'omm 土SE(ng)Amount ofMBG^csistuntFaoentafMBGicsislaitSw&roCiorumiSE (%〉 (95% CL)
JSJ144.42±0.564.40±O6199.41 士0.05 (柳> 51)
HM32.37±0.49Undetected/
smaple9.80 ±0.663.65±1诉36.83 士0诉G6j6S37.01)
权利要求
1、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)群体中抗药性基因频率的实时检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术检测核盘菌群体中存在的对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性基因频率。一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，共分三步第一步采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。第二步运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序(1)核盘菌总量检测的标准曲线反应体系dH2O(灭菌蒸馏水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLSclSF(10μM) 0.25μLSclAF(10μM) 0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板 2.0μI</u>总体积 25μL扩增条件预变性95℃ 10s ↓变性95℃ 5s退火55. 8℃ 31s40个循环 ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃(2)抗性核盘菌量的标准曲线反应体系dH2O(灭菌蒸馏水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLRFP4(10μM) 0.25μLRRP(10μM)0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板2.0μL</u>总体积 25μL扩增条件预变性95℃ 10s ↓变性95℃ 5s退火62℃ 33s40个循环 ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃第三步待测样品分别运用上述两种特异性引物进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在核盘菌总量中的比例。
2、根据权利要求l，核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术其特征在于用 于实时定量PCR的引物具有特异性。设计的依据是抗药性菌株在(3-微管蛋白第198为由 Glu(GAG)—Ala(GCG)。① 扩增核盘菌p-微管蛋白基因片断的特异性引物对上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3， 下游引物SclAF: 5， - TGCAGACGGGTAATATG -3，② 扩增核盘菌抗药性基因片段的特异性引物对上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGAC,3， 下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3'
全文摘要
本发明属于核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)群体中抗药性基因频率的实时检测方法，可用于引起油菜等作物菌核病的核盘菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂抗药性监测和流行预警。该检测方法共分3个主要步骤，第一步分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA；第二步运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物，进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线；第三步待测样品分别运用上述两种特异性引物进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在核盘菌总量中的比例。采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术可以高通量、快速、准确定量测出田间抗药性核盘菌的数量及其在病原群体中的比例，具有高通量的特点。比常规的生物测定和普通的PCR检测抗药性菌株省时、节本、快速。直接从田间采集回来的菌核、病斑和孢子中提取基因组DNA到实时定量-PCR整个检测过程只需6h，检测准确率达96％以上。
文档编号C12Q1/68GK101475982SQ20081023508
公开日2009年7月8日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者周明国, 王建新, 陈长军 申请人:南京农业大学