专利名称：快速检测尿液中粪肠球菌的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种泌尿道感染性疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速
检测尿液中粪肠球菌(^^erococ^/aeca乃's， ￡ /aeca7^s)的荧光定量PCR (聚 合酶链式反应)试剂盒，适用于粪肠球菌定性定量检测。
背景技术：
泌尿道感染是一种常见的细菌性感染疾病。在我国的医院感染中，泌尿道感 染仅次于肺部感染，位于第2位。粪肠球菌是泌尿道感染分离率最高的革兰氏阳 性菌病原菌。粪肠球菌是重要的医院感染病原菌，多与尿路器械操作、留置导尿、 尿路结构异常有关。临床表现为尿频、尿急、尿痛、尿浑浊；严重病人有发热、 寒战、恶心、呕吐、腹痛甚至可以发展为败血症等。
粪肠球菌导致的泌尿道感染一般起病较急，应及时治疗，否则可反复发作， 迁延不愈而转为慢性感染。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR， FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM， Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology [J]. Toxicology, 2001， 163:29—38)、 病原体的定性(McGoldrick A， Lowings JP， Ibata G， et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) [J]. J. Virol. Methods,1998， 72:125—135.; Bhudevi B， Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus [J]. Vet. Microbiol.， 2001， 83:1-10.)和定量检测(Desire N， Dehee A， Schneider V， et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay [J]. J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 1303-1310. ; Martell M， Gomez J， Esteban JI， et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA [J]. J. Clin, Microbiol, 1999， 37:327-332. ; Kearns AM， Turner AJL， Eltringham GJA， et al. Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J]. J. Clin. Virol， 2002,24:131-134; Florence KP， GlauciaPB， MireilleS， et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry [J]. J. Virol. Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且己经成为当前病毒核酸定量的 主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、艾滋病、结核定量检测的试 剂盒上市。临床检测上传统的培养法具有灵敏度低、特异性差、耗时费力、存在假阴性 等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能对细菌数量进 行定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此亟待开发精确、灵敏、 快速、无污染的临床检测方法。发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测尿液 中粪肠球菌的荧光定量PCR试剂盒(简称本试剂盒)。 本发明的目的是这样实现的 一、本试剂盒的结构本试剂盒包括a)荧光定量PCR反应液，b)标准阳性模板，c)阴性质控标 准品；荧光定量PCR反应液含有引物和荧光探针，引物分为正向引物和反向引物； 正向引物为5'-TTCAGCGATTTGACGGATTG -3'; 反向引物为5'-TGTGGCAACAGGGATCAAGA -3';标准阳性模板是从粪肠球菌细菌标准菌株(ATCC29212)中提取的粪肠球细 菌基因组DNA，粪肠球菌标准菌株先用无菌TE缓冲液配制成细菌悬液，经过平板 计数法及用定量接种环确定所配制的菌液浓度为108cFU/ml，经过碱裂解提取细菌基因组DNA，再对其进行10倍的倍比稀释。 具体地说
a) 荧光定量PCR反应液
荧光定量PCR反应液是由正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq (内含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, SYBR* Green I)和无菌双蒸水组成 在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由10Mmol/L正向引物和反向的引物 各O. 5W， SYBR* Premix Ex Taq (2X)麵，无菌双蒸水8l4组成，反应液总 体积19W。其中引物为所示的核苷酸序列。
b) 标准阳性模板
标准阳性模板为从粪肠球菌标准菌株(ATCC29212)提取的细菌基因组DNA。 挑取粪肠球菌标准菌株(ATCC29212)菌落，溶于2ml的无菌TE缓冲液中配成细 菌悬液，经平板计数法以及用定量接种环确定所配制的菌液浓度为l08CFU/ml， 取200 经过碱裂解提取细菌基因组DNA，再连续10倍稀释成梯度浓度的细菌 基因组DNA溶液，分别对应于细菌浓度为10° 108CFU/ml, -20。C保存备用，以 其中的103 108CFU/ml浓度的DNA溶液做为阳性模板。
c) 阴性质控标准品
阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本试剂盒的工作原理
在本发明提供的快速定量检测粪肠球菌荧光定量PCR试剂盒中，有一种荧光 染料SYBR Green I (包含于试剂SYBR PremixEx Taq中，后者为市售商品试剂)， 这是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增 强，在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，染料分子特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信 号，因此其荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
对粪肠球菌的定量可通过与标准品的循环域值(Ct， Threshold Cycle)相比 较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值 与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大， 起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样 品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
5在本发明提供的检测粪肠球菌荧光定量PCR试剂盒中，针对粪肠球菌检测中 的特殊性，对不同的耙片段进行反应体系，如引物浓度、退火温度等的优化，并 将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于粪肠球菌 定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测粪肠球菌荧光定量PCR方法， 并研制出检测粪肠球菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体 系中检出1000CFU/ml，可以满足快速诊断粪肠球菌的要求。二、本试剂盒的使用方法本试剂盒的使用方法包括下列步骤a) 将标准阳性模板从-2(TC冰箱取出，平衡至室温待用；b) 取无菌收集的中段尿液lml于EP管，400 g离心5min，取上清600 P 1 转至另一EP管，5000 g离心15min，弃去400 u 1上清液，余下200 ul用于提 取细菌组DNA;c) 对200 u 1尿沉渣加入等体积的含2%SDS的100腿ol/LNaOH进行100。C金 属浴10分钟以裂解细菌，获取游离DNA用于荧光定量PCR反应；d) 分别取等量的a)步中的标准阳性模板和b)步中的尿液标本中的细菌组 DNA加入到荧光定量PCR反应液(内含正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq 和无菌双蒸水)中，用荧光定量PCR仪进行检测；e) 通过比较待测样品和标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数 进行定量。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果1、 定量准确；2、 检测速度快，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；3、 特异性好，灵敏度高；4、 步骤简单，可重复性高；5、 可同时进行高通量的样品检测。在本发明中提供的快速定量检测尿液中荧光定量PCR试剂盒不仅可对尿液 中粪肠球菌菌进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法的诊断方法。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实 验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992， 分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验 指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。 实施例l:本试剂盒的组成与配制
a、 荧光定量PCR反应液正向引物和反向引物各0.5 W (1O她ol/L)， SYBR PremixEx Taq (内含TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+， SYBR* Green I) 10W (2X)，无菌双蒸水8Pl。
b、 标准阳性模板为从粪肠球菌标准菌株(ATCC29212)提取的细菌基因组 DNA，对应的细菌浓度为10° 108CFU/ml。
c、 阴性质控标准品为无菌双蒸水。 实施实例2:用本试剂盒检测尿液中粪肠球菌
a、 取无菌收集中段尿液l ml于EP管，400 g离心5 min，取上清600 ul 转至另一EP管，5000 g离心15min，弃去400 u 1上清液，对余下200 " 1溶液 对200 P 1尿沉渣加入等体积的含2%SDS的lOOmraol/LNaOH进行IO(TC金属浴10 min，以裂解细菌获取游离DNA， 4°C， 7000g离心5min，取1 u 1上清液用于荧 光定量PCR反应。
b、 将阳性标准模板(试剂b)解冻，回复室温。
c、 分别取荧光定量PCR反应液(试剂a)各19ul，取第a)步所得DNA、第 b)步的阳性标准模板和无菌双蒸水(阴性对照)各lPl，分别加入不同的PCR 反应管，在荧光定量检测仪上同步做PCR检测。扩增条件为94'C预变性10s; 然后94'C 5 s， 60°C 45 s共40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的 第二步结束时进行，检测波长为520nm。反应结束后对产物做瑢链曲线分析，条 件如下94 °C 0 s， 20 °C/s; 65 °C 15 s， 20 °C/s; 20 °C 0 s， 0. 1 °C/s。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为标准阳性
模板108CFU/ml、 107CFU/ml、 106CFU/ml、 105CFU/ml、 104CFU/ml、 103CFU/ml、 的Ct值分别为16.85、 19.77、 23.58、 27.77、 33.29、 >36，阴性对照为0;熔 链曲线分析显示Tm=79. 98°C。
回归曲线方程是Y"4.088X+48.78，相关系数『=-0.99，标准差为0. 303。反复重复试验3次，得到Ct值和Tm值进行统计学分析尸> 0. 05，数据差 异无显著性，说明不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且， 荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2小时就能完成，而传统的细菌培养 法约需3天左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大縮短检测时间。该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程， 一次可检测1 377 个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。按上述方法对100多例临床标本进行了检测，并与常规培养方法的结果进行 对比，验证本方法的效果优于培养方法，检出率高，操作简单，省时省力。相关 实验结果己写成论文，将发表于有关的学术期刊。
权利要求
1、一种快速检测尿液中粪肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由荧光定量PCR反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有正向引物、反向引物和SYBR Green I荧光染料；正向引物为5′-TTCAGCGATTTGACGGATTG-3′；反向引物为5′-TGTGGCAACAGGGATCAAGA-3′；标准阳性模板是从粪肠球菌细菌标准菌株中提取的粪肠球菌细菌组DNA；所述的PCR即聚合酶链式反应。
2、 根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征是荧光定量PCR反应液是由正向引物、反向引物，SYBR PremixEx Taq和无菌双 蒸水组成；所述的SYBR PremixEx T叫内含TaKaRa Ex TaqTM HS， dNTP Mixture, Mg2+ 和SYBR Green I。
3、 根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征是标准阳性模板从粪肠球菌细菌标准菌株中提取的粪肠球菌细菌组DNA。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测尿液中粪肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种泌尿道感染病原体基因检测技术，适用于尿液中粪肠球菌定性定量检测。本发明由荧光定量PCR反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有正向引物、反向引物和荧光染料。本发明定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；步骤简单，可重复性高；可同时进行高通量的样品检测；不仅可对尿液中粪肠球菌菌进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法的诊断方法。
文档编号C12Q1/68GK101629208SQ20081023679
公开日2010年1月20日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者艳 李, 汤永飞, 明 汪 申请人:武汉大学