专利名称：：爪哇正青霉菌株及其筛选培养方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种真菌的菌株及其筛选培养方法和应用，尤其涉及一种生产高活性纤维素酶的菌株及其筛选培养方法和应用。
背景技术：
：目前，纤维素酶己广泛应用于酿造、果汁与蔬菜汁加工、粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分提取、植物基因工程、细胞工程以及原油开采等各
技术领域：
，纤维素酶的主要用途是实现对纤维素的分解与转化，纤维素酶作用的机理主要是通过水解使连接葡萄糖分子的J3-l,4-糖苷键断裂，最终将纤维素分解与转化成小分子糖类。当前，本领域技术人员普遍认为，完全降解纤维素至少需要三种功能不同但又具互补作用的活性酶组分内切P-1,4-葡聚糖酶(Cx酶)、外切(3-l,4-葡聚糖酶(d酶)和卩-葡萄糖苷酶。然而，本领域技术人员尚未能研发出一种能够高产纤维素酶，且使上述三种组成酶的活性同时达到较高指标的制酶方法。随着生物工程技术的发展，利用微生物产酶的技术逐渐进入人们的视野。当前，能够用于生产纤维素酶且所得纤维素酶分解能力较强的菌种主要包括木霉属(7Wd!0&nwfl)的菌株、曲霉属G4sperg!7/"s)的菌株、青霉属(Pem'd/^附)的菌株以及枝顶孢霉属C4cmwo/H'ww)的菌株，但这些菌种的菌株生产制备的纤维素酶活性还不够高，即使上述菌株制得的纤维素酶中某一组成酶的活性能够达到较好的效果，但由于其他组成酶的活性较低也会对纤维素酶的整体活性形成制约。因此，对于本领域技术人员来说，培养筛选出一种高酶活(即Cx酶、Q酶和(3-葡萄糖苷酶二种组成酶的活性同时达到较高的指标)的纤维素分解菌，对今后纤维素酶在各个
技术领域：
的广泛应用将具有重要意义。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种爪哇正青霉菌株以及其筛选培养方法和该菌株在制备生产纤维素酶上的应用，通过优化该菌株生产纤维素酶的发酵方法，以制备出活性高、成本低的纤维素酶。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种爪哇正青霉菌株，其特征在于所述爪哇正青霉菌株的保藏名称为爪哇正青霉(五wpem'c朋wn/awm'ram)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM208204。上述爪哇正青霉菌株的菌落呈青绿色，菌落背面呈橙褐色，无渗出液；菌丝质地呈地毪状，在显微镜下可见菌丝分枝繁杂、透明、有隔，细胞壁光滑；所述菌株的分生孢子梗丛束疏松，簇状排列，由菌丝直立生出，无色；主分枝呈树状，其上有很多次级分枝，对生或互生2~3级分枝，末端为小梗，小梗瓶形，瓶梗短，基部变细，中间膨大，以大角度伸出；分生孢子呈球形或长椭圆形，聚集成球状绿色的分生孢子头，分生孢子壁光滑，孢子小。上述爪哇正青霉CCTCCM208204的孢子梗形态如图1所示；在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养后的菌落形态如图2所示；经分子生物学鉴定，其18SrDNA序列全长为1687bp。本发明还提供一种上述爪哇正青霉菌株的筛选培养方法，具体包括以下步骤(1)初筛将收集的菌株放入富集培养基中，在28'C、150r/min的条件下振荡培养35d，然后稀释涂布于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基上，3(TC倒置培养4d后挑取单菌落再次稀释涂布，直到获得纯菌株；将分离得到的纯菌株点种到CMC-Na培养基上培养4d后用lmg/mL的刚果红溶液染色，再用蒸熘水清洗，最后用lmol/L的NaCl溶液脱色，然后比较各个菌落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值；(2)复选将初筛后的各菌株按5%的接种量(接种量是指接种菌株体积占待发酵培养基的体积百分数)接种到液体产酶培养基中于3(TC、150r/min下振荡培养5d,然后将培养液在5000r/min的条件下离心，取其上清液，测定和比较各个菌落的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和(3-葡萄糖苷酶活；(3)筛选出同时满足以下两个条件的菌株(a)所述初筛后测定的茼落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值均表现最大的；(b)所述复选后测定的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和P-葡萄糖苷酶活均表现最大的。本发明还提供一种上述爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用。所述爪哇正青霉菌株是通过以下步骤来生产纤维素酶将所述菌株接入种子培养基中，在2532'C条件下培养4884小时得种子液；将种子液按3~10%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为4.5~6.0，在2532。C条件下培养96~120小时得发酵液；发酵液经离心得到含纤维素酶的粗酶液。上述制得的粗酶液具有以下酶学性质纤维素酶的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)的最适作用pH值为5，在pH值45之间，酶的稳定性较好，在pH值小于4和大于5的区域，酶的稳定性都急剧下降；最适作用温度为6(TC。纤维素酶的滤纸酶活(FPA酶活)最适作用pH值为5，在pH值5~7之间，酶的稳定性比较好，而当pH值大于7和小于5时，酶活急剧下降；最适作用温度为5(TC。上述种子培养基是由以下质量分数的组分组成CMC-Nal~2%、MgSO4.7H2O0.02~0.1%、KH2PO40.05~0.5%、NH4NO30.050.2免和余量的水。上述富集培养基和液体产酶培养基均为普通的培养基，其组分也可与种子培养基的组分相同。上述发酵培养基是由以下质量分数的组分组成稻草粉0.5~1.5%、麸皮粉0.1~0.5%、KN030.5~2%、KH2P040.05~0.5o/o、CaCl2.2H200.01~0.1%、MgS04'7H200.02~0.1%、吐温0.1~0.8%和余量的水。上述种子培养基中培养时、发酵培养基中培养时转速均控制在160200r/min;发酵液离心时转速控制在1000~8000r/min。与现有技术相比，本发明的优点在于通过研究筛选出一种高酶活纤维素分解菌——爪哇正青霉CCTCCM208204,本发明通过优化该菌株生产纤维素酶的发酵方法以及创造良好的产酶条件，可以制备得到活性高、成本低的纤维素酶。本发明筛选爪哇正青霉CCTCCM208204的方法相对简单，容易操作；利用本发明的爪哇正青霉CCTCCM208204生产制备的纤维素酶，可以将纤维素物质转化为小分子糖。因此，本发明的应用可能成为开辟饲料、发酵工艺原料和人类食品的新来源，并且对处理废物、消除公害、保护环境等都具有重要意义。本发明的爪哇正青霉菌株已于2008年11月6日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCM208204。图1为本发明的爪哇正青霉菌株的孢子梗形态图2为本发明的爪哇正青霉菌株在PDA培养基上培养后的菌落形态图；图3为本发明的爪哇正青霉菌株通过刚果红平板分离筛选的照片。具体实施方式实施例l:从长沙岳麓山森林腐烂树木和土壤中筛选和分离出一株高活力纤维素酶生产菌ZN-205,具体方法如下(l)初选将收集的菌株样品放入含50mL富集培养基的三角瓶中，在28。C、150r/min的条件下振荡培养4d，然后稀释涂布于CMC-Na培养基上，3(TC倒置培养4d后挑取单菌落再次稀释涂布，直到获得纯菌落为止。将分离得到的纯菌株点种到CMC-Na培养基上培养4d后用lmg/mL的刚果红溶液染色30min,再用蒸馏水清洗，最后用lmol/L的NaCl溶液脱色30min，以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的标准。通过刚果红平板分离筛选(见图3)，得到透明圈直径和菌落直径比值较大的8个菌落(见表l)，结果表明，相对其他菌株，菌株ZN-205生长情况最好，其菌落直径、透明圈直径以及透明圈直径与菌落直径比值也均为最大。进一步将筛选到的菌株接种到滤纸液体培养基中，在30。C、150r/min的条件下6培养5d，以不接种任何菌株的滤纸液体培养基作为空白对照，重复三次实验，以滤纸的失重率(X)作为这次筛选的标准，X=(M-M,)/M(其中M为最初滤纸质量，M!为降解后滤纸经烘干后的质量)，结果见表2，相对其他七株菌，菌株ZN-205降解滤纸后的失重率最大，说明其酶活最高。表l刚果红平板分离筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)复选将初筛得到的菌株按5o/。的接种量接种到液体产酶培养基中于3(TC、150r/min下振荡培养5d，然后将培养液在5000r/min的条件下离心10min,取其上清液测定各个酶活大小，以里氏木霉(7Wc/racfer附areey")RUT-C30为对照株，各菌株粗酶液酶活见表3。结果表明，ZN-205的各个酶活均较好。表3各菌株粗酶液酶活IU/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述富集培养基和液体产酶培养基的组分相同，各组分的质量分数为CMC-Nal.5%、MgS04'7H200.05%、KH2PO40.1%、NH4N03(U。/o和余量的水。菌株ZN-205经形态和分子鉴定(鉴定结果如下)为爪哇正青霉，该菌株名称为爪哇正青霉(￡w/ew'"7//ww^ram'cww)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为形态鉴定将分离得到的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养3天后观察菌落的特征，在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上并置于显微镜下观察。菌落呈青绿色，菌落背面呈橙褐色，无渗出液；菌丝质地呈地毯状，在显微镜下可见菌丝分枝繁杂、透明、有隔，细胞壁光滑；菌株分生孢子梗丛束疏松，簇状排列，由菌丝直立生出，无色；主分枝呈树状，其上有很多次级分枝，对生或互生2~3级分枝，末端为小梗，小梗瓶形，瓶梗短，基部变细，中间膨大，以大角度伸出；分生孢子呈球形或长椭圆形，聚集成球状绿色的分生孢子头，分生孢子壁光滑，孢子小。分子鉴定将分离得到的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养3天，取菌丝体抽提DNA，用18SrDNA基因通用引物进行扩增(上游引物5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'，下游引物5'-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3')，扩增片断由上海生物工程公司测序，获得18SrDNA基因全序列如下所示ac!Acctctaatgaccgagtttgaccaactttccggctct認gggtcgttgccaaccctcctgagccagtccgaaggcctcactgagccattcaatcggtagtagcgacgggcggtgtgt3caaagggcagggacgt犯tcggcacgagctgatgactcgtgcctactaggcattcctcgttga卿gc犯taattgcaatgctctatccccagcacgacagggtttaacaagattacccagacctctcggcc鄉gtgatgtactcgctggccctgtcagtgtagcgcgcgtgcggcccagaacatctcagacctgttattgccgcgcacttccatcggcttgagccgatagtccccctaagatagccagCggCCCgC3aatgcggaccgggctattLaagggccgaggtctcgttcgttatcgcaattatcsctccaccaax:t^gaacggccatgcaCC3CC3tCC3a朋gatcaaga^gagctctcaatctgtcaatccttattttgtctggacctggtgagtttccccgtgttgagccgcaggctccacgccttgtggtgcccttccgtcaatttctttaagtttcagccttgcgaccatactccccccagaa^ctgatttctcgt犯ggtgccgaacgggtcatcateig朋tcccgtccgatccCtSLgtCggCatagtttatgggscggt3tctgatcgtcttcgatcccctaactttcgttcctggcgaatgctttcgcagtagttagtcttcagaatttcacctctgacagctgsatactgacgcccccgactatccctattgcggtcctag朋tag朋ccgcacgtcctattctattattccatgctaatgtettcgagcaaaggcctgctttgaacactctaattttttcacagtaaaagtxctggttccCCCC3C3gCCagtg犯ggccatgaggttccaggtccagccggaccagtactcgcggtgaggcggaccggccagccagacccaaggttcaactacgagctttttaactgcaacaact11aatat3cgctattgg3gctggaattaccgcggctgctggcaccagacttgccctccaattgttcctcgttaattgttctcattccaattacgg3gCCCCgt3tcagtatttattgtcactacctccccgtatCggg3ttgggtaatttgcgcgcctgctgccttccttggatgtggtagccgtttctcaggctccctctccgg服tcg肌ccctaattccccgttacccgttgccaccatggtaggccactatcctaccatcgaaagttgatccatcgccggCgC朋ggCC3tgcgsttcgttaagttattatgattc3ccaaggagccccga鄉gcgttggttttttatcaccccttcctg鄉tcggggtttttagcatgtattagctxtag犯ttax:cacaggtatccatgtagtEiaggtactatcaaactgatttaatgagccattcgcagtttcacagtataaagtgcttata上述序列全长1687bp，经登陆GeneBank进行Blast分析，菌株ZN-205的18SrDNA基因序列与爪哇正青霉18SrDNA基因序列同源性高达99%。实施例2:一种本发明的爪哇正青霉菌株，其是通过以下步骤来生产纤维素酶将己经筛选、培养出的菌株接入种子培养基中，在3(TC、175r/min的条件下培养72小时得种子液；将种子液按5%的接种量接入发酵培养基中(在发酵瓶中装20~50%体积的发酵培养基)，发酵培养基的初始pH值为5.5，在3(TC、175r/min的条件下培养120小时得发酵液；发酵后的发酵液经4000r/min离心得到含纤维素酶的粗酶液。经测定，该菌株粗酶液的CMC酶活为24.52IU/ml，FPA酶活为2.68IU/ml、p-葡萄糖苷酶为2.03IU/ml，与现有其他菌株产酶进行比较(见表4)，本发明菌株所产的纤维素酶其CMC酶活最高；虽然FPA酶活和|3-葡萄糖苷酶酶活不是最高，但三种酶活的整体性和均衡性表现最好。表4爪哇正青霉ZN-205与其他菌株产酶比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"--------"表示未作过测定上述种子培养基的组分及各组分的质量分数为羧甲基纤维素钠(CMC-Na).5%、MgSO4.7H2O0.05%、KH2PO40.1%、NH4NO30.1呢和余量的水。上述发酵培养基的组分及各组分的质量分数为稻草粉0.7%、麸皮粉0.3%(稻草粉与麸皮比例为7:3)、KN031%(氮源添加浓度)、KH2PO40.4%、CaCl2'2H200.03^MgS04'7H200.03%、吐温0.4%和余量的水。本发明方法用到的培养基以稻草和麸皮(0.5元/kg)作碳源、以KN03(5元/kg)作氮源，相比通常以微晶纤维素(5元/kg)为碳源、蛋白胨(50元/kg)为氮源，具有价格低、来源广等优点，能够使本发明技术方案的成本降低、操作更加简便易行。上述实施例中是采用我国轻工行业标准(QB2583-2003)中规定的纤维素酶活测定方法来进行酶活测定。酶活单位采用国际定义方法，以lmL酶液每分钟产生l微摩尔的葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位IU。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>权利要求1、一种爪哇正青霉菌株，其特征在于所述爪哇正青霉菌株的保藏名称为爪哇正青霉(Eupenicilliumjavanicum)ZN-205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM208204。2、根据权利要求1所述的爪哇正青霉菌株，其特征在于所述爪哇正青霉菌株的菌落呈青绿色，菌落背面呈橙褐色，无渗出液；菌丝质地呈地毯状，显微镜下见菌丝分枝繁杂、透明、有隔，细胞壁光滑；所述菌株的分生孢子梗丛束疏松，簇状排列，由菌丝直立生出，无色；主分枝呈树状，其上有次级分枝，末端为小梗，小梗瓶形，瓶梗短，基部变细，中间膨大；分生孢子呈球形或椭圆形，聚集成球状绿色的分生孢子头，分生孢子壁光滑。3、一种如权利要求1或2所述的爪哇正青霉菌株的筛选培养方法，具体包括以下步骤-(1)初筛将收集的菌株放入富集培养基中，在28'C、150r/min的条件下振荡培养35d，然后稀释涂布于羧甲基纤维素钠培养基上，30'C倒置培养4d后挑取单菌落再次稀释涂布，直到获得纯菌株；将分离得到的纯菌株点种到羧甲基纤维素钠培养基上培养4d后用lmg/mL的刚果红溶液染色，再用蒸馏水清洗，最后用lmol/L的NaCl溶液脱色，然后比较各个菌落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值；(2)复选将初筛后的各菌株按5呢的接种量接种到液体产酶培养基中于3(TC、150r/min下振荡培养5d，然后将培养液在5000r/min的条件下离心，取其上清液，测定和比较各个菌落的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和P-葡萄糖苷酶活；(3)筛选出同时满足以下两个条件的菌株(a)所述初筛后测定的菌落直径、透明圈直径和菌落直径与透明圈直径的比值均表现最大的；(b)所述复选后测定的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和P-葡萄糖苷酶活均表现最大的。4、一种如权利要求1或2所述的爪哇正青霉菌株在生产纤维素酶上的应用。5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述爪哇正青霉菌株是通过以下步骤来生产纤维素酶将所述菌株接入种子培养基中，在2532"C条件下培养48~84小时得种子液；将种子液按3~10%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为4.5~6.0，在2532'C条件下培养96~120小时得发酵液；发酵液经离心得到含纤维素酶的粗酶液。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述种子培养基是由以下质量分数的组分组成羧甲基纤维素钠1~2%、MgSCV7H200.02~0.1%、KH2PO40.05~0.5%、NH4NO30.050.2免和余量的水；所述发酵培养基是由以下质量分数的组分组成稻草粉0.5~L.5%、麸皮粉0.1~0.5%、KNO30.5~2%、KH2P040.05~O.5%、CaCl2'2H200.01-0.1%、MgS04'7H200.02—0.1%、吐温0.1~0.8%和余量的水。7、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述种子培养基培养时和发酵培养基培养时，转速控制在160~200r/min;发酵液离心时，转速控制在1000~8000r/min。全文摘要本发明公开了一种爪哇正青霉菌株及其筛选方法，该菌株的保藏号为CCTCCM208204，该爪哇正青霉的菌株可用于生产纤维素酶，其步骤包括将该菌株接入种子培养基中，在25～32℃条件下培养48～84小时得种子液；将种子液按3～10％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的初始pH值为4.5～6.0，在25～32℃条件下培养96～120小时得发酵液；发酵后的发酵液经离心得到含纤维素酶的粗酶液。通过本发明的爪哇正青霉菌株生产出的纤维素酶具有活性高、成本低等优点。文档编号C12N1/14GK101463327SQ20081023749公开日2009年6月24日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者钢何,刘海波,周再魁,王义强,陈介南申请人:中南林业科技大学