一种用褐藻胶裂解酶制备褐藻胶寡糖的方法

专利名称：一种用褐藻胶裂解酶制备褐藻胶寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种用褐 1^酶^arira/ms YKW-34制备褐^^的方法。
背景技术：
褐m^是褐翻鹏的錢结构多糖，是由D"甘赚^^和a-L-古罗糖M两 种单体会贼的线性无分支多糖。褐^l^ 酶是一类催化褐繊,鹏的麟，根据 其底物专一性可分为甘露^ 卩古罗、 ^ 酶。褐^IMP酶具有广泛的 应用。首先，它可催化褐 为具有#^活性的褐 (A0S)。 AOS可以显著 提高植物的发芽和芽的生长，具有清除自由凝啦癌活性，可提高巨噬细胞的白细胞吞 噬活性以提高人体免疫力，能有效iSS人角鄉胞的扩增用于AX舰的制造，謝腿 MW益菌如双itJ^菌和乳酸菌的生长，因此可广^^于 、食品及制药^^域。相 对,方法，酶解效去反应割中温和，设备简单，會謝氐，污染小的优势。其次，褐藻 ^ 酶可用于^l翻鹏，而这种縦人体内是败的。褐藻的细lfell破损后， 其细胞内部的营^t/质可以^A^动物获得，海藻的营养价值得至腿一步提高。齡卜， 褐^^f酶还;im藻类学和舒生物学的工具酶用于海^iM体的制备。
近几+￥以来，国内外的许多工作者开展了褐^l^酶的分离纯化方面的研虹
作。海洋微生物 (:类酶的錢来源。 一些褐^Mi 断目職弧菌、交替单胞菌、假
单胞菌、交纖单胞菌中分离出来。f践由于海洋环境的微性如较低盼鹏，导致海 洋m^物产生的海藻多糖,献繊定性不好或活性有限。寻找性状稳定、高活力的海
藻多糖,HiM是研虹作者的棘。
々a^'7or朋s属是2004年建立的新属，检索niProtKB/TrEMBLiyg库，目前仅有四 个^rirar朋s属!t4物产生的琼胶酶的记录，M微生物倉^生琼,，在琼胶平板 上顿凹陷的菌圈，其命名依据即是鉴于其琼胶,(agar"devoring)會旨力。除琼胶酶 外，没有驗到关于^ar^or朋s产褐M^酶附隨。本发明人于2005年;WiW
3道中^^获得的菌株々arjVo7ms W^/sYKW-34既會^生琼胶酶，又育^生褐^S^f 酶。目前尚未JW褐^^酶v4^Wp^a^ W力m YKW-34制备褐^|$,0<^。

发明内容
本发明的目的^f共一种用褐^l^ 酶^arip^ms Wfe/s YKW-34帝恪褐,寡 糖的方法，以弥补现有fe^的，不足。
一种用褐^M^酶^az7Vora^a7Z^YKW-34帝i恪褐ill^MI的方法，^#征是 先制备褐m^ 酶^a^Vo7msa/Z^YKW-34酶液，另将褐ll^溶解于水中，加入制 备的酶液，于20-55。 C水浴中，分解2-180小时，升温60 - IO(TC灭活，MJl滤，浓
縮，冷冻千燥，娜^m
本发明制备褐^^ 酶时用的培养基纟M^济简单，酶产量高，制得的褐mi^
解酶^az7'rara/ s a7Zws YKW-34具有独特的Na+/『离子 性，优良的^和pH的稳 定性，高的比活力，肯詷时(^i繊的甘露糖^^和古罗M斷段，妒的聚合度 为2—12的褐^M具有良好的OT前景。
本发明用褐^i^ 酶^az^cra/7s a^肪YKW-34制备褐ill^^的;^法，，征 是先帝(J备褐^^^酶4garirara/zsa乃〃sYKW-34酶液，另将褐^l^溶解于水中，加入 制备的酶液，于20-55° C水浴中，爐2-180小时，升温60 - 100。C灭活，M 滤，
繊，冷冻千燥，娜^m
帝U备褐^^i 酶/4gar/rar朋s a"〃s YKW—34酶液时，取海水1000ml，力口入50g ^^和10g硝,，以Na0H水溶液调1^刀始pH働7.0，灭菌荆转卩體温，力口入 100ml 12h种龄的^an'rara/z YKW-34謝，在25° C 110rpm振荡J:歸48h，
取歸液，离心W:清液，加入10g聚iifflK除掉多糖及褐藻胶的降解产物，离心除 掉絮状沉淀。将上清肚样至DEAE-S印h画e FF色谱柱，线性升梯度法繊，将酶活 组始并。酶肚样至Phenol S印harose 6 FF色谱柱，线性,度法繊，将酶^^且 始并。酶^h样至S印hacryl S-100服色谱柱，^I^得单一酶峰。得到活力为3731 U/mg 的褐^^i 酶纯酶液50ml，纯化倍数为20倍。
用褐^^l酶v^ar2'rar朋s a历i/s YKW-34制备褐^l^^时，取10g褐^^溶解于1000ml水中，力口入5ml4garjVor朋sa历iAsYKW-34褐ili^i军酶纯酶液，于35。 C 水浴中，分解16小时，升温90。C，灭活1小时，鹏:滤，浓縮，冷冻千燥，得7.8g聚 合度为2-12的褐 成品。
本发明制备的褐藻胶裂解酶^a^Vo2ms a^os YKW-34的基本酶学性质如下 SDS-PAGE种ll^l滤色i歸明此酶由单一肽^^賊，好量为60kDa。等电聚焦实验表 明其等电点为5.5- 5.7。 it鹏的最适pH为7.0， ； 温度为30- 40° C，低于50° C时 稳定。ji鹏具有钠/钾离子^^性。透析除去反应体系中钠/钾离子后，酶活力丧失；添 加钠/钾离子后，酶活力可完全咴复。此酶对还原剂如H镇乙醇和DTT、金属离子络 合剂如EDTA和EGTA具有耐受性；变性剂如SDS和尿素可使酶活力提高30%。底物专一 性实验表明，此酶能同时糊军甘露糖^^和古罗M^t断。该離良的酶学I4M使得 其具有良好的应用前景。
本发明帝lJ备褐^I^ 酶^a^'rar朋sa7^sYKW-34时，所用的培养基由海水、海 藻粉及硝,戶形贼，海,的M百分数范围为0.001-10%，硝酸钾的M百分数范 围为0.01-20%，其余为海水，培养基初始pH值范围为6.5-10.0;所述的海藻粉为, 粉、马尾藻粉、江蓠粉、麒JH^粉、紫菜粉、裙带菜粉、称苔粉、角叉菜粉、凝ra^粉、 螺旋藻粉^f^^;戶脱的制备褐^^解^>离纯化方法为在海拟咅养基中，以重 量百分数范围为1-20%的接种量，接种12h种龄的^arz'rara/zs s历ws YKW-34菌种，在 25° C，振荡培养2-180小时，上清液，加入重量百分数范围为0. 0001-5%的絮》齩驟醚 St3EI安，上清液依 :^圣DEAE-S印harose FF色i普柱、Phenol S印harose 6 FF色i普柱和 S印hacrylS-100HR色i普柱线性升梯度法tt， 、M得单一酶峰，为^feaz7'rar朋sa历〃s YKW-34的褐^^l早酶；所述的褐^feK中的Si百分数范围为0. 00卜30%的溶液， 褐1^ ^7K中的韓百分数范围为0. 001-20%，战的褐^l^鎌的聚合度范围 为2- 12。
权利要求
1. 一种用褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34制备褐藻胶寡糖的方法，其特征是先制备褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34酶液，另将褐藻胶溶解于水中，加入制备的酶液，于20-55°C水浴中，分解2-180小时，升温60-100℃灭活，膜过滤，浓缩，冷冻干燥，得褐藻胶寡糖。2.如权利要求1所述的用褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34制备褐藻胶寡糖的方法，其特征是所述褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34的培养基由海水、海藻粉及硝酸钾所组成，海带粉的重量百分数范围为0.001-10％，硝酸钾的重量百分数范围为0.01-20％，其余为海水，培养基初始pH值范围为6.5-10.0；所述的海藻粉为海带粉、马尾藻粉、江蓠粉、麒麟菜粉、紫菜粉、裙带菜粉、浒苔粉、角叉菜粉、凝花菜粉、螺旋藻粉或羊栖菜粉。
2、 如权利要求1所述的用褐藻胶裂解酶J^3nVors77s YKW-34制备 褐藻胶寡糖的方法，其特征是所述褐藻胶裂解酶^ah^raM aM"s YKW-34 的培养基由海水、海藻粉及硝酸钾所组成，海带粉的重量百分数范围为 O.OO卜10%，硝酸钾的重量百分数范围为0.01-20%，其余为海水，培养基初 始pH值范围为6.5-10.0;所述的海藻粉为海带粉、马尾藻粉、江蓠粉、麒 麟菜粉、紫菜粉、裙带菜粉、浒苔粉、角叉菜粉、凝花菜粉、螺旋藻粉或 羊栖菜粉。
3、 如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶^anVora/Ls YKW-34制备褐 藻胶寡糖的方法，其特征是所述的制备藻胶裂解酶^卵^Vora/7s 3""S YKW-34酶液时，在海水培养基中，以重量百分数范围为1-20%的接种量， 接种12h种龄的如ri,愿WteYKW-34菌种，在25° C，振荡培养2-180 小时，上清液，加入重量百分数范围为0.0001-5%的絮凝剂聚醚酰亚胺，上 清液依次经DEAE-S印harose FF色谱柱、Phenol S印harose 6 FF色谱柱禾口 Sephacirl S-100 HR色谱柱线性升梯度法洗脱，洗脱得单一酶峰，为 ^^anVara/^ a7Zws YKW-34的褐藻胶裂解酶。
4、 如权利要求1所述的用褐藻胶裂解酶Z卵2^Vora/ s a"i/s YKW-34制备 褐藻胶寡糖的方法，其特征是所述的褐藻胶在水中的重量百分数范围为 0.001-30%，褐藻胶裂解酶在水中的重量百分数范围为0.001-20%，所述的褐藻胶寡糖的聚合度范围为2- 12。
全文摘要
一种用褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34制备褐藻胶寡糖的方法，其特征是先制备褐藻胶裂解酶Agarivorans albus YKW-34酶液，另将褐藻胶溶解于水中，加入制备的酶液，于20-55℃水浴中，分解2-180小时，升温60-100℃灭活，膜过滤，浓缩，冷冻干燥，得褐藻胶寡糖。本发明的优点是制备褐藻胶裂解酶用的培养基组成经济简单，褐藻胶裂解酶酶产量高，具有独特的Na⁺/K⁺离子依赖性，优良的温度和pH的稳定性，高的比活力，能同时降解褐藻胶的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸片段，生产的聚合度为2-12的褐藻胶寡糖具有良好的应用前景。
文档编号C12P19/00GK101423854SQ20081023777
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者付晓婷, 杰 徐, 李来好, 杨贤庆, 洪 林, 王永昌, 王经佐, 薛长湖, 许加超, 金相武, 昕 高 申请人:中国海洋大学