专利名称：一种快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法，该方法属于环境保护领 域中物絮凝剂产生菌快速筛选的方法优化。主要是通过特定的筛选程序，快速优选出所需 要的菌种，以满足现场的实际需要。
背景技术：
石油化工产生的废水成分复杂、水质水量波动大、污染物浓度高且难降解，多为有毒 有害的有机物，对环境污染严重。随着水资源的日益紧张和人们环境保护意识的加强，石 油化工废水的处理技术逐渐成为研究的热点。絮凝是石化废水处理的一种重要方法。目前 常用的絮凝剂包括聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，但它们的残留物大多有害，存在二次污染问 题。虽然絮凝剂的生产技术不断提高，它们的应用也取得了进步，但是目前仍存在很多问 题，铝盐类絮凝剂易受氯等的干扰而使处理效果降低，PFS等铁盐絮凝剂易引起腐蚀且脱 除COD的能力不十分强；由于混凝处理需投加化学药剂，因此，药剂的费用决定着处理费 用，目前处理含油废水的费用约2. 0元/m3,最高可达5.0元/m3左右，处理费用较高；
另外高分子絮凝剂的残留物大多有害，存在二次污染问题。据有关学者研究表明，老年痴 呆与现在广泛使用无机絮凝剂聚合氯化铝(PAC)有关，铁盐会造成处理水中带颜色，高浓
度的铁也会对人类健康和生态环境产生不良影响。聚丙烯酰胺的单体(丙烯酰胺)具有强 烈的神经毒性和三致效应(致畸、致癌、致突变)，其在聚合过程中的残留，是一个令人十 分担忧的问题。
微生物絮凝剂属第三代生物有机高分子絮凝剂，主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、 纤维素和DNA等。因其具有特超强的絮凝性能，可使一些难处理的高浓度废水得到絮凝， 并明显降低C0D、石油类、色度等指标，因此也是一种有着良好发展前景的新型絮凝剂。 生物絮凝剂是通过微生物发酵得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒的 廉价水处理剂，可广泛应用于废水处理、生物制药等方面。获得高活性的微生物絮凝剂的 前提是优良的生产菌种。优良的生产菌种通常是从不同的环境样品分离、纯化微生物，进 一步筛选后获得的。传统的筛选微生物絮凝剂产生菌的方法主要是通过平板分离，获得纯培养物，然后对每个纯培养物进行摇瓶培养，测定发酵液是否具有絮凝活性来确定絮凝剂 产生菌，存在着筛选目标不确定、工作量大、周期长、筛选效率低等缺点。因此，为使生 物絮凝技术在炼油污水处理中得以应用，必须建立一种快速、高效筛选炼油废水微生物絮 凝剂产生菌的方法。
发明内容
本发明的目的就在于避免上述现有技术的不足之处而提出了 一种快速筛选炼油废水微 生物絮凝剂产生菌的方法，该方法能克服传统微生物絮凝剂产生菌筛选方法的不足，依据 需要获得相应用途的絮凝剂，可定向筛选絮凝炼油废水的微生物絮凝剂的产生菌，工艺简 单，工作量小，周期短，筛选效率高。
该方法主要是将土样或活性污泥接入吡啶培养基，吡啶作为氮源，使可以耐受吡啶的 微生物存活下来，然后将培养液稀释涂布，得到单菌，通过测定单菌发酵液的絮凝活性， 从而筛选出絮凝剂产生菌。具体筛选过程如下
1. 样品采集
实验样品主要来源于含油废水处理单元曝气池中的水样、活性污泥和钻井架旁被石 油污染的土壤。
2. 培养基
① .牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g、蛋白陈10g,NaC15g、琼脂15-20g，水1000mL，
pH=7.6。
② .富集培养基H1:葡萄糖20g, K風12g， KH2P04 llg, Na2S04 2g, KC1 2g， MgS04 7H20
4g， NH4C1 lg,酵母膏0. 05g,吡啶50mg，水lOOOmL，自然PH;
③ .富集培养基H2:葡萄糖20g, K風12g, KH2P04 llg, Na2S04 2g， KC1 2g, MgS04 7H20
4g,， NH4C1 0.5g,吡嚏100mg，水1000mL，自然pH;
④ .富集培养基H3:葡萄糖20g, K風12g, KH2P04llg， Na2S04 2g, KC1 2g， MgS04 7H20
4g,吡嚏100mg,水lOOOmL,自然pH;
⑤ .放线菌培养基可溶性淀粉20g, KN03 lg ， NaCl 0. 5g, K2HP04 0. 5g, MgS04 . 7H20 0. 5g,
FeS04 0. Olg,琼脂15-20g,水lOOOmL, pH 7.2—7.4。
.真菌培养基马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂15-20g,水lOOOml，自然pH。 ⑦.查氏培养基蔗糖30g, NaN03 3g, K2HP04 lg, FeS04 0. Olg, KC1 0.5g,琼脂15-
20g, H20 lOOOmL,自然pH 。⑧ .通用发酵培养基葡萄糖20g, (NH4)2S04 0. 2g,尿素0. 5g， KH2P04 2g, K2,4 5g，
NaCl 0. lg,酵母膏0. 5g, H20 lOOOmL, pH7-8,自然状态即可。
⑨ .种子培养基葡萄糖20g, (NH4) 2S040. 2g,尿素0. 5g, KH2P042g， K2HP045g， NaClO. lg,
蛋白胨20g，酵母膏10g,牛肉膏10g, H201000mL, pH7. 0。
3.富集培养
将样品稀释后加入富集培养基适当培养，筛选过程中共进行3次富集培养，这3 次富集培养采用的富集培养基其氮源含量不同。具体如表1所示。
表l富集培养基中氮源的含量表
富集培养基酵母 (g/L)膏氯化 (g/L)铵 吡啶(mg/L)
Hl0. 05150
H200. 5100
H300100
取一定量的样品直接加入富集培养基H1中，3(TC、 140rpm摇床培养48小时后， 以20。/。的接种量转接入富集培养基H2，仍是30。C、 140rpm摇床培养48小时。之后再 以20。/。的接种量接入富集培养基H3， 30°C、 140rpm摇床培养48小时。
4. 纯种分离
将富集培养液在①、 、 、⑦培养基平板上稀释涂布，获得纯菌株，并测定培养 液的絮凝活性。
5. 菌种筛选
① .初筛
将纯化菌种的种子液接入装入通用发酵培养基，在一定条件下培养。通过絮凝 实验，目测观察絮凝现象，选出絮体较大沉降速度较快的菌，进行下一步复筛。
② .复筛
初筛得到的纯菌株在锥形瓶内进行发酵，得到的发酵液进行炼油废水的絮凝试 验，测絮凝前后废水COD、石油类和悬浮物等指标，挑选各指标去除率最大的菌株 发酵液即为目标菌株。
附图即为本发明中吡啶條选方法的流程图。
具体实施例方式
下面将结合实施例和附图详述本发明的技术特点。
实施例1
吡啶筛选法筛选针对炼油废水的微生物絮凝剂产生菌
取2g的样品置于无菌研钵中研磨，然后用无菌水稀释成适当浓度的菌悬液备用。用 250mL三角瓶盛60mL富集培养基H1，将已编号的样品接入其中，3(TC、 140rpm摇床培养 48小时后，以20y。的接种量转接入富集培养基H2，仍是WC、 "Orpm摇床培养化小时。 之后再以20y。的接种量接入富集培养基H3， 3(TC、 140rpm摇床培养48小时。将富集培养 液进行稀释涂布，获得纯菌株，对其编号。将各单菌株一一接入到培养基中，28'C振荡培 养24h，取培养液测定其絮凝活性。(1)初筛絮凝活性的测定方法向2S0mL烧杯中加入 150mL 4g/L高岭土悬浮液。再加入5 u L生物絮凝剂产生菌的培养液。放置在六联搅拌机 下，插入搅拌叶轮。将速度、时间分别设置为先快速(^Orpm)搅拌lmin，再慢速(60rpm) 撹拌3min。搅拌完成后，拔出叶轮，静置3min。从烧杯的中间高度用注射器取20mL水样， 用721分光光度计测定其0D55。。同时以蒸馏水代替培养液作对照试验。(2)复筛方法300mL 炼油废水加入50pL微生物絮凝剂在六联搅拌机下搅拌，快速搅拌(200rpm) lmin,慢速 搅拌(60rpm) 3min,静置5rain。之后从烧杯同一高度取20mL水样，分别测定其石油类、 COD和悬浮物的含量。
絮凝剂菌种的传统分离方法
分离采用常规的稀释涂布法获得纯菌株，并对之编号。(l)初筛用250mL三角瓶盛 60mL各种液体培养基(①⑤⑥⑦)，将已编号的纯菌株接入其中，3(TC、 140rpm摇床培养 48小时。对培养液进行絮凝活性的初步检测，向250mL烧杯中加入150mL4g/L高岭土悬 浮液。再加入5iuL生物絮凝剂产生菌的培养液，在六联搅拌机搅拌，目测观察絮凝现象， 选出絮体较大沉降速度较快的菌株，进行复筛。(2)复筛向250mL烧杯中加入150mL4g/L 高岭土悬浮液。再加入5ML生物絮凝剂产生菌的培养液。放置在六联搅拌机下，插入搅拌 叶轮。将速度、时间分别设置为先快速U00rpm)搅拌lmin,再慢速(^rpin)搅拌hin。 搅拌完成后，拔出叶轮，静置3min。取水样，用721分光光度计测定其OD55。。同时以蒸馏水代替培养液作对照试验。
两种菌种分离方法的结果比较
利用传统筛选方法，从10多个样品中分离出200多株菌。其中由培养基①得到81株 菌，21株具有絮凝性，筛出率为25.6%。由培养基⑤得到64株菌，有18株具有絮凝性， 筛出率为28%。由培养基⑥得到78株菌，有25株具有絮凝性，筛出率为32%。培养基⑦ 得到63株菌，有13株具有絮凝效果，筛出率为21%。
表2 传统筛选方法筛出率 培养基 ^ ^^ 5平均值
筛出率(％)Kl ^75~~~~~~^
对目测效果较好的菌进行复筛。复筛得到絮凝率在80%以上的菌有7株。其絮凝活性 如下表所示
表3 传统筛选方法复筛结果
菌株N4Ml 5GllG22C14CIO C53
絮凝活性(y。)83. 584. 083. 589. 589. 084.0 83.5
通过吡啶筛选方法筛选六个土样得到的复合菌群。将混合菌群涂布后得到单菌，再进
行筛选。每个混合菌群中含有6-12种不同菌种。筛选结果如表4所示。共筛得絮凝剂产 生菌61株，其中有絮凝性的有27株。筛出率为44. 3%。絮凝率在85%以上的有7株，如 表5所示。其中一株编号为B-6-l的菌，其发酵液特别粘稠，絮凝性达到92%,加入其发 酵液后，水质很清，其中的高岭土聚集成了球形，而不是像其他微生物絮凝剂一样形成高 岭土颗粒。
表4混合菌群筛选结果
混合菌群编号B-1B-2B-3 B-4B-5B-6
菌株种类1196 131210
有絮凝性的菌453 735
数
表5吡啶筛选方法复筛结果
菌株 B-1-7B-2-7B-3-1B-4-3B-4-7B-5-4B-6-1
絮凝性(％ ) 87. 587. 089. 4 90. 5 84. 592. 292. 5
由此可以看出，传统筛选方法的平均筛出率为26.6%,吡啶筛选方法的筛出率为44.3%。吡啶筛选方法筛出率远远高于传统筛选方法。 实施例2
微生物絮凝剂处理炼油废水的絮凝试验
利用吡啶筛选法从活性污泥中初筛得到13株絮凝率较高的菌株，进一步进行炼油废水 的絮凝实验。在500mL烧杯中加入300mL炼油废水，然后加入50 |u L微生物絮凝剂，在六 联搅拌机上快速搅拌(200rpm) lmin,使微生物絮凝剂与炼油废水充分混合形成细小矾花， 将废水倒入气浮简中，利用小型静态气浮装置进行气浮，静置5min后，从取样口中取50mL 水样，测定废水化学需氧量(COD)、石油类和悬浮物等指标，并算出各个指标的去除率。 实验结果见表6。
表6 菌株发酵液对炼油污水絮凝情况 菌种编号絮凝活性/% COD去除率邝悬浮物去除率/%石油类去除率/%
HT1-2 96.16 38.12 85.01 72.78
HT2-4 65.13 21.09 66.56 36.69
HT3-5 71.50 21.80 66.79 36.98
HT3-10 30.88 10.20 43.33 18.51
HT5-6 58.50 16.74 45.05 20.98
HT8-3 46.13 9.32 40.36 18.39
HT10-8 72.75 22.63 67.78 37.15
HT11-7 64.00 20.09 65.91 32.67
HT14-2 56.24 18. 42 51.11 25.32
HT15-3 38.96 15.57 46.67 20.15
HT18-6 73.56 23.10 67.31 37.68
HT22—6 45.26 19.57 49.82 22.16菌种编号絮凝活性/% cod去除率/。/。悬浮物去除率/%石油类去除率/%
ht26-9 58.79 19.47 66.10 30.29
从表6可以看出，利用吡咬法筛选出的菌株对炼油废水均具有一定的絮凝处理能力。 从而可以看出利用吡啶筛选法可以定向、快速筛选絮凝炼油废水的微生物絮凝剂的产生菌。
发明效果
本发明是是提供一种快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法，克服传统微生物 絮凝剂产生菌筛选方法的不足，可定向筛选絮凝炼油废水的微生物絮凝剂的产生菌。因此, 与现有技术相比，本发明具有以下突出的特点
① 生物絮凝剂是通过微生物发酵得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、 无毒的水处理剂；
② 依据需要获得相应用途的絮凝剂，可定向筛选絮凝炼油废水的微生物絮凝剂的产生 菌。
③ 通过实验表明传统筛选方法的平均筛出率为26.6%,吡啶筛选方法的筛出率为44. 3 %。工艺简单，工作量小，周期短，筛选效率高。
权利要求
1. 一种快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法，该方法是将样品接入吡啶培养基，以吡啶作为氮源，使可以耐受吡啶的微生物存活下来，然后将培养液稀释涂布，得到单菌，通过测其发酵液的絮凝活性，再筛选出絮凝剂产生菌，其特征在于絮凝剂产生菌的快速筛选过程如下(一). 样品的采集实验样品主要来源于含油废水处理单元曝气池中的水样、活性污泥和钻井架旁被石油污染的土壤；(二). 培养基的制备①. 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g、蛋白陈10g，NaCl 5g、琼脂15-20g，水1000mL，pH＝7.6；②. 富集培养基H1葡萄糖20g，K2HPO4 12g，KH2PO4 11g，Na2SO4 2g，KCl 2g，MgSO4·7H2O4g，，NH4Cl 1g，酵母膏0.05g，吡啶50mg，水1000mL，自然pH；③. 富集培养基H2葡萄糖20g，K2HPO4 12g，KH2PO4 11g，Na2SO4 2g，KCl 2g，MgSO4·7H2O4g，，NH4Cl 0.5g，吡啶100mg，水1000mL，自然pH；④. 富集培养基H3葡萄糖20g，K2HPO4 12g，KH2PO4 11g，Na2SO4 2g，KCl 2g，MgSO4·7H2O4g，吡啶100mg，水1000mL，自然pH；⑤. 放线菌培养基可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.2-7.4；⑥. 真菌培养基马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH；⑦. 查氏培养基蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，FeSO4 0.01g，KCl 0.5g，琼脂15-20g，H2O 1000mL，自然pH；⑧. 通用发酵培养基葡萄糖20g，(NH4)2SO4 0.2g，尿素0.5g，KH2PO4 2g，K2HPO45g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，H2O 1000mL，pH7-8，自然状态即可；⑨. 种子培养基葡萄糖20g，(NH4)2SO40.2g，尿素0.5g，KH2PO42g，K2HPO45g，NaCl0.1g，蛋白胨20g，酵母膏10g，牛肉膏10g，H2O1000mL，pH7.0；(三). 富集培养将样品稀释后加入富集培养基适当培养，筛选过程中共进行3次富集培养，这3次富集培养采用的富集培养基其氮源含量不同，具体如下取一定量的样品直接加入富集培养基1中，30℃、140rpm摇床培养48小时后，以20％的接种量转接入富集培养基2，仍是30℃、140rpm摇床培养48小时，之后再以20％的接种量接入富集培养基3，30℃、140rpm摇床培养48小时；(四). 纯种的分离将富集培养液在①、⑤、⑥、⑦培养基平板上稀释涂布，获得纯菌株，并测定培养液的絮凝活性；(五). 菌种的筛选(1)初筛将纯化菌种接入装入通用发酵培养基，在一定条件下培养，通过絮凝实验，目测观察絮凝现象，选出絮体较大沉降速度较快的菌，进行下一步复筛；(2)复筛初筛得到的纯菌株在锥形瓶内进行发酵，得到的发酵液进行污水的絮凝试验，测絮凝前后废水COD、石油类和悬浮物的指标，挑选各指标去除率最大的菌株发酵液即为目标菌株。
2.根据权利要求1所述的快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于在 富集培养基的制备及富集培养基的培养顺序中，富集培养基H1中氮源NH4C1 1 g /L, 酵母膏0. 05g,吡嚏50mg/L;富集培养基H2中的氮源为NH4C1 0. 5 g /L,吡嚏100mg/L; 富集培养基H3只以吡啶为氮源(100mg/L);富集培养的顺序如下① .将预处理的样品直接接入富集培养基H1中培养；② .将步骤①已培养好的培养物转入富集培养基H2中继续培养；③ .将步骤②培养好的培养物转入富集培养基H3进一步培养。
全文摘要
一种快速筛选炼油废水微生物絮凝剂产生菌的方法，该方法能克服传统微生物絮凝剂产生菌筛选方法的不足，依据需要获得相应用途的絮凝剂，可定向筛选絮凝炼油废水的微生物絮凝剂的产生菌，实验表明传统筛选方法的平均筛出率为26.6％，本发明中的吡啶筛选方法的筛出率为44.3％。该方法工艺简单，工作量小，周期短，筛选效率高。
文档编号C12N1/00GK101440347SQ20081024003
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者刘其友, 张云波, 赵东风, 赵朝成 申请人:中国石油天然气集团公司;中国石油大学(华东)