专利名称：一种从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法。
背景技术：
黑色素(Melanin)是广泛存在于动物、植物和微生物中的 一种棕色到黑色的色素，是一种结构较为复杂的酚类聚合物，能够提高生物的生存和竞争能力(AloisandMichael, Annual Review of Phytopathology 1986,24:411-451)。它是生物体为抵抗紫外线和电离辐射等因素的伤害，逐渐进化而成的，可以被看成是生物体用来保护自己的一道屏障。黑色素的应用潜力巨大，不仅具有抗氧化、抗辐射作用，还具有免疫促进(Savaet al. ， Food Research International, 2001， 34 (4) :337-343)、抗癌(El-0beid et al.，Phytomedicine， 2006， 13(5) :324-333)、抑制病毒复制(Montef ioriand Zhou， AntiviralResearch, 1991， 15(1) :11-25)等作用，因此，在医药、化妆品、食品、电子等领域有着广泛的应用前景。 入药的冬虫夏草是冬虫夏草菌
寄 生在鳞翅目(L印idoptera)蝙蝠蛾科(H印ialidae)幼虫，尤其是虫草蝠蛾(H印ialusarmoricanusOberthilr)上形成的虫菌复合体，是我国特产的 一 种名贵中药和高级滋补品。在生物分类上冬虫夏草菌归属于子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、蛇 包虫草禾斗(Ophiocordycipitaceae)、蛇孢虫草属
，作为青藏高原特有的真菌，其分布地域局限，天然产量非常有限，并被国家相关部门列为了二级保护物种[《国家重点保护野生植物名录(第一批)》，1999]。针对天然冬虫夏草资源紧缺的现状，全国先后有多个科研单位进行了冬虫夏草菌的深层发酵研究，有的进入了工业化生产，但发酵后的发酵液没有能得到很好的开发利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法。
本发明所提供的从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法，包括以下步骤将冬
虫夏草菌发酵液除去菌丝体后，进行酸化处理，收集沉淀，得到黑色素粗提物。 所述冬虫夏草菌发酵液是由冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762经液体深层发酵
得到的；所述发酵的温度10-21°C ;所述发酵的时间为20-60天。 冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762已于2008年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC 2793。
所述方法还包括以下纯化的步骤 (a)脱蛋白采用盐酸水解法对黑色素粗提物进行脱蛋白，得到脱蛋白的黑色素；
(b)脱脂将步骤(a)所述脱蛋白的黑色素用有机溶剂进行脱脂，得到脱脂的黑色素； (c)去除氯离子以去离子水洗涤步骤(b)所述脱脂的黑色素，直至氯离子定性检测为阴性为止；然后经真空干燥或在25-5(TC干至恒重，得到纯化的黑色素。
其中，所述酸化处理是将所述冬虫夏草菌发酵液的pH值调至1-3。
所述酸化处理中所加入的试剂为浓度l-3mol/L的盐酸。 所述方法还包括将酸化处理后的冬虫夏草菌发酵液静置过夜并离心的步骤；所述离心的相对离心力可为5000-8000g，离心时间可为20-40分钟。 所述步骤(a)脱蛋白的具体方法是将黑色素粗提物用6-7mol/L盐酸进行水解，经离心分离，收集沉淀，将沉淀依次用l-0.01mol/L盐酸、去离子水洗涤得到脱蛋白的黑色素；其中，所述水解的时间为2-5小时，所述水解的温度95-100°C。 所述步骤(b)脱脂的具体方法是将步骤(a)得到的脱蛋白的黑色素溶解在0. 1-1. Omol/L碱溶液中，依次加入氯仿、正丁醇，搅拌，离心，收集水层液体，并调节所述水层液体的PH值为l-3，离心收集沉淀，得到脱脂的黑色素。 也可将得到的沉淀重复上述溶解、有机溶剂洗涤、离心沉淀的操作至少一次，得到脱脂的黑色素。 所述碱溶液具体可为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述碱溶液的用量以使所述脱蛋白的黑色素充分溶解即可；所述氯仿与正丁醇的体积比为IO : 1至20 : 1。
冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793也属于本发明的保护范围。
本发明的发明人研究发现冬虫夏草菌发酵液中含有黑色素，而且冬虫夏草菌的一些生物学活性与黑色素有关。以冬虫夏草菌发酵液为原料提取黑色素，可以提高冬虫夏草菌深层发酵的经济效益，实现其综合应用。另一方面，冬虫夏草黑色素可能与冬虫夏草菌抗紫外线能力、对蝠蛾幼虫的侵染等有关，从冬虫夏草发菌酵液中提取纯化黑色素将促进冬虫夏草菌生理学和半人工培植的研究，具有一定的理论意义。 试验证明，采用本发明的方法提取的黑色素和Sigma公司销售的黑色素(CAS :8049-97-6)性质相近。两者均溶于碱性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等有机溶剂，也不溶于植物油，pH小于3时完全沉淀，易被KMnOpNaClO、H202、 K2Cr207等强氧化剂漂白，多酚反应为阳性。
图1为本发明提取纯化冬虫夏草黑色素的流程图。 图2为实施例1的冬虫夏草黑色素(1)与Sigma公司合成的黑色素(2)的紫外吸收光谱。 图3为实施例1的冬虫夏草黑色素(1)与Sigma公司合成黑色素(2)的红外吸收光谱。
具体实施例方式
实施例1、从冬虫夏草菌发酵液中提取纯化黑色素
1)菌株的分离与鉴定 菌株的分离菌株从四川省康定县采集的冬虫夏草标本虫体上分离。
分离方法如下将采集的新鲜冬虫夏草标本刷去表面的泥土和植物碎片，用75%的乙醇进行表面消毒处理后，取一小块组织块放在培养基上培养，培养基配方见[姚一建，董彩虹，王波，谢雪钦(2005) —种冬虫夏草的培养方法及其专用培养基。专利号ZL200510137457. 8]。
菌株鉴定 形态学鉴定在培养基(ZL200510137457. 8)上，菌落凸起表面不平，培养基背面呈明显的棕褐色。菌丝体无色，有隔膜，分枝，宽2. 2-4. 3 (-5. 4) ym。分生孢子梗无色，单生或2-8个簇生，但不形成孢梗束。产孢细胞系瓶形小梗，无色。分生孢子无色，无隔膜，肾形或长椭圆形，5. 4-14. 0 X 3. 2-4. 3 (-5. 4) y m，单生或2-4 (-6)个一群，为一柠檬形粘膜所包围。 分子生物学鉴定按照文献[Jiang， Y. &Yao， Y. -J. (2006) ITS sequenceanalysisand ascomatal development of Pseudogymnoascus roseus. Mycotaxon.94 :55-73.]的方法，菌株培养物经DNA提取、PCR扩增核糖体DNA内转录间隔区(ITS)并测序，所得序列经与本实验室递交到GenBank的序列AY608925 —致，并与从青藏高原不同地区采集的冬虫夏草标本的ITS序列比对，确认为冬虫夏草。该菌株的编号是762。
冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762已于2008年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC 2793。
2)冬虫夏草菌发酵液的制备 冬虫夏草菌经液体深层发酵40天后，5000g离心15分钟，去除菌丝体，收集滤液，
并抽滤除去滤液中的细小杂质，得到冬虫夏草菌发酵液。 具体制备方法如下 (1)菌株活化将冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793接种于冬虫夏草半合成固体培养基中，培养温度10-2rC，培养时间40-60天； 该冬虫夏草半合成固体培养基[姚一建，董彩虹(2004) —种冬虫夏草半合成培养基.专利号ZL 200410090875.1]按照如下方法配制取蔗糖50. 0克，蛋白胨10. 0克，酵母提取物3. 0克，磷酸二氢钾1. 0克，硫酸镁0. 5克，琼脂20克，用蒸馏水定容至1000毫升；
(2)发酵菌种培养用步骤(1)的培养物，在无菌条件下接种到培养基中，培养温度10-2rC，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速120转/分钟，培养时间6-20天；
(3)发酵培养以5_10%的体积比的接种量，将种子培养液接入发酵培养基，培养温度10-21°C ，培养时间40天，然后将得到的发酵液在5000g离心15分钟，去除菌丝体，收集滤液，并抽滤除去滤液中的细小杂质，制得去除菌丝体的冬虫夏草菌发酵液。
冬虫夏草黑色素的提取纯化按照图1所示的流程图进行。
3)冬虫夏草黑色素粗提物的提取 以步骤1)得到的冬虫夏草菌发酵液为原料，提取方法包括如下步骤 取冬虫夏草菌发酵液3000ml ，加入2mol/L的盐酸调节溶液的pH值为2. 5，静置过
夜，使黑色素完全沉淀，8000g离心30分钟，收集沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀，然后将所
得沉淀经冷冻干燥得到3g冬虫夏草黑色素粗提物。 4)冬虫夏草黑色素粗提物的纯化
将3g冬虫夏草黑色素粗提物用30ml 6-7mol/L浓盐酸溶液在IO(TC水解2小时，冷却后8000g离心30分钟，收集沉淀，将沉淀依次用0. Olmol/L盐酸、去离子水洗涤以除去蛋白质杂质，得到脱蛋白的冬虫夏草黑色素； 将得到的脱蛋白的冬虫夏草黑色素溶解在1. 0mol/L的氢氧化钾稀碱溶液中，氢氧化钾溶液的用量为黑色素体积的50倍，加入氯仿溶液和正丁醇溶液以除去脂类。具体做法是将脱蛋白的冬虫夏草黑色素充分溶解在150mll.0mol/L氢氧化钾溶液中，依次加入25ml氯仿、2. 5ml正丁醇(氯仿与正丁醇的体积比为10 : 1)，室温磁力搅拌30分钟，8000g离心时间IO分钟离心去下层(有机层)，将水层转移，在水层中加入2mol/L盐酸调节pH值为2. 5， 8000g离心时间30分钟得到黑色素沉淀，并重复两次溶解、有机溶剂洗涤、沉淀的操作；以去离子水反复洗涤黑色素沉淀，除去其中的氯离子，直至上清液与Ag+反应为阴性，氯离子定性检测为阴性为止；室温风干至恒重，即得1. 2g冬虫夏草黑色素成品。
将本实施例制备的黑色素和Sigma公司销售的黑色素(CAS :8049_97_6)进行比较。试验证明，两者的性质相近，均溶于碱性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等有机溶剂，也不溶于植物油，pH小于3时完全沉淀，被KMn(^、NaC10、 H202、 K2Cr207等强氧化剂漂白，多酚反应为阳性，如加入FeCl3后发生沉淀，遇FeS04/!^Fe(CN)e产生蓝色。紫外光谱(见图2)为一条随波长增大而吸光度减小的曲线。红外光谱(见图3)在3400cm—工附近存在强而宽的共振吸收带，是由OH和NHj勺伸縮振动而产生，在1620cm—1有一强的吸收带，由芳香C = C、酰胺中的C = 0和(或)C00—的振动引起。
权利要求
一种从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法，包括以下步骤将冬虫夏草菌发酵液除去菌丝体后，进行酸化处理，收集沉淀，得到黑色素。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酸化处理是将所述冬虫夏草菌发酵液的PH值调至1-3。
3. 根据权利要求1或2所述的方法所述酸化处理中所加入的试剂是浓度为l-3mol/L的盐酸。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述冬虫夏草菌发酵液是由冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793经液体深层发酵后得到的；所述发酵的温度10-21°C ;所述发酵的时间为20-60天。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将酸化处理后的冬虫夏草菌发酵液静置过夜并离心的步骤；所述离心的相对离心力为5000-8000g，所述离心的时间为20-40分钟。
6. 根据权利1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下纯化的步骤(a) 脱蛋白采用盐酸法对权利要求l-5中任一所述方法提取的黑色素进行脱蛋白，得到脱蛋白的黑色素；(b) 脱脂将步骤(a)所述脱蛋白的黑色素用有机溶剂进行脱脂，得到脱脂的黑色素；(C)去除氯离子以去离子水洗涤步骤(b)所述脱脂的黑色素，直至氯离子定性检测为阴性为止；然后经真空干燥或在25-5(TC干至恒重，得到纯化的黑色素。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(a)脱蛋白的方法是将权利要求1-5中任一所述方法提取得到的黑色素用6-7mol/L盐酸进行水解，经离心分离，收集沉淀，将沉淀依次用0.01-lmol/L盐酸、去离子水洗涤得到脱蛋白的黑色素；其中，所述水解的时间为2-5小时，所述水解的温度95-100°C。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步骤(b)脱脂的方法是将步骤(a)所述脱蛋白的黑色素进行至少一个如下操作过程，得到脱脂的黑色素溶解在0. 1-1. 0mol/L碱溶液中，依次加入氯仿和正丁醇，搅拌，离心，收集水层液体，并调节所述水层液体的pH值为l-3，离心收集沉淀。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述氯仿与正丁醇的体积比为10 : 1至20 : 1。
10. 冬虫夏草(Cordyc印s sinensis) 762，其保藏编号为CGMCC 2793。
全文摘要
本发明公开了一种从冬虫夏草菌发酵液中提取黑色素的方法。该方法包括以下步骤将冬虫夏草菌发酵液除去菌丝体后，进行酸化处理，收集沉淀，得到黑色素粗提物。将黑色素粗提物用盐酸水解去除蛋白质杂质，有机溶剂反复洗涤和反复碱溶解后酸化使之沉淀进行纯化，去离子水反复洗涤除去氯离子，最后干燥得到冬虫夏草黑色素成品。本发明制备的黑色素，和Sigma公司销售的黑色素CAS8049-97-6性质相近。两者均溶于碱性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷等有机溶剂，pH小于3时完全沉淀，遇强氧化剂褪色，紫外可见光区扫描图谱为一条随波长增大而吸光度减小的曲线，红外光谱中有3400cm-1附近和1620cm-1各有一强的吸收带。
文档编号C12R1/645GK101760038SQ200810241008
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者姚一建, 董彩虹 申请人:中国科学院微生物研究所