新型溶血磷脂酸酰基转移酶基因的制作方法

专利名称：：新型溶血磷脂酸酰基转移酶基因的制作方法
技术领域：
：本申请基于2007年5月25日申请的日本国专利申请2007-139046及2007年12月14日申请的日本国专利申请2007-323965，主张优先权。本发明涉及新型溶血磷脂酸酰基转移酶基因。
背景技术：
：脂肪酸是构成磷脂质、三酰基甘油等脂质的重要成分，含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为高不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已报道了各种生理活性(非专利文献l)。其中，花生四烯酸作为形成前列腺素、白三烯等的中间代谢物受到关注，使其适用于功能性食品、医药品的材料的尝试已大量进行。并且，花生四烯酸在母乳中含有，对婴儿的发育，特别是胎儿的身高、脑的发育很重要，作为婴儿发育的必要成分，从营养学的观点来看与DHA(二十二碳六烯酸)同样受到关注。虽然期待着该高不饱和脂肪酸在各种领域的应用，但其中也包括了在动物体内不能合成的物质。因此，开发出了培养各种微生物获得高不饱和脂肪酸的方法。并且，也进行了用植物生产高不饱和脂肪酸的尝试。在这种情况下，已知高不饱和脂肪酸例如作为三酰基甘油等储存脂质的构成成分，在微生物的菌体内或植物种子中积累。更加详细地说，三酰基甘油在生物体内按以下方式生成。即甘油一3—磷酸被甘油一3—磷酸p基转移酶酰化生成溶血磷脂酸，该溶血磷脂酸被溶血磷脂酸酰基转移酶酰化生成磷脂酸，该磷脂酸被磷脂酸磷酸酯酶脱磷酸化生成二酰基甘油，该二酰基甘油被二酰基甘油酰基转移酶酰化生成三酰基甘油。并且已知酰基CoA:胆甾醇酰基转移酶、溶血卵磷脂酰基转移酶等间接参与三酰基甘油的生物合成。由上述可知，在溶血磷脂酸(lys叩hosphatidicacid:以下在本说明书中有时记为"LPA"。此外有时记为"1—酰基甘油一3—磷酸")被酰化生成磷脂酸(phosphatidicacid:以下本说明书中有时记为"PA"、或"l，2—二酰基一sn一甘油一3—磷酸")的反应中，有溶血磷脂酸酰基转移酶(以下有时记为"LPAAT")参与。已知该LPAAT为1—酰基甘油—3—磷酸酰基转移酶(E.C.2,3.1.51)。到目前为止，已在一些生物中报道了LPAAT基因。作为来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的LPAAT基因，plsC基因已被克隆(非专利文献2)。除此之外，在真菌中来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的SLC1基因已被克隆(非专利文献3)。此外，也已经从动物或植物中进行克隆(专利文献l)。对于脂质生产菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)(以下有时记为"M.alpina")的LPAAT，已报道微粒体组分具有溶血磷脂酸酰基转移活性(非专利文献4)。并且作为高山被孢霉(M.alpina)的LPMT基因，已报道了2种同源基因。(专利文献2及专利文献3)。专利文献l国际专利申请手册(pamphlet)W02004/076617号专利文献2美国专利公报第2006/174376号专利文献3美国专利公报第2006/0094090号非专利文献lLipids,39，1147(2004)非专利文献2Mol.Gen.Genet.，232，295-303，1992非专利文献3J.B.C.，268，22156-22163，1993非专利文献4BiochemicalSocietyTransactions,28，707-709，2000非专利文献5J.Bacteriology,180，1425-1430，1998非专利文献6J.Bacteriology,173，2026-2034，199
发明内容但是，至今为止已报道的LPAAT基因，即使导入宿主细胞使其表达，也因其底物特异性，使宿主产生的脂肪酸组合物受到局限。因此，希望鉴定出可产生与以往不同组成的脂肪酸组合物的新型基因。特别是希望鉴定出可生产利用价值高、脂肪酸含量高的脂肪酸组合物的蛋白质的基因。本发明的目的是提供通过在宿主细胞内表达或导入，可制造目的脂肪酸组成的油脂、或可增加目的脂肪酸的含量的蛋白质及核酸。本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，首先进行脂质生产菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)的EST分析，从中提取出与已知LPAAT基因同一性高的序列。进而为了获得编码LPAAT的开放阅读框(0RF)的全长，进行cDNA文库筛选或通过PCR克隆基因。将其导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞内，以试验产生期望脂肪酸组合物的发明者，成功克隆出可生产与以往LPAAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物，且宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未导入该基因的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高，底物特异性不同的新型LPAAT相关的基因，完成了本发明。即本发明如下所述。(1)核酸，其含有以下(a)(e)中任一项所述的碱基序列，(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在'严谨条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(c)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列有67%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(d)碱基序列，其编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(e)碱基序列，其与由编码序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交、且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质。(2)(1)所述的核酸，其含有以下(a)(c)中任一项的碱基序列，(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中110个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、5(TC的条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸gfe基转移酶活性的蛋白质，(c)碱基序列，.其编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质。(3)核酸，其含有以下(a)(c)中任一项所述的碱基序列或其片段，(a)碱基序列，其由序列号36或序列号37表示，(b)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质，(c)碱基序列，其由序列号1或3表示。(4)核酸，其含有以下(a)(e)中任一项所述的碱基序列，(a)碱基序列，其编码以下蛋白质，由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质己表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码以下蛋白质，具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(c)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列有67%以7上同一性的碱基序列组成，且编码以下蛋白质，具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质。i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(d)碱基序列，其编码以下蛋白质，由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质。i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(e)碱基序列，其与由编码序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交、且编码以下蛋白质，具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(5)(4)所述的核酸，其含有以下(a)(c)中任一项的碱基序列(a)碱基序列，其编码以下蛋白质8由序列号2或4表示的氨基酸序列中110个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(b)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、5CTC的条件下杂交，且编码以下蛋白质，具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(c)碱基序列，其编码以下蛋白质，由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在上述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性的蛋白质。i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(6)核酸，其含有以下(a)(e)中任一项所述的碱基序列。(a)碱基序列，其编码以下蛋白质，由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有包含上述氨基酸序列的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有上述碱基序列编码的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(c)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列有67%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有上述碱基序列编码的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(d)碱基序列，'其编码以下蛋白质，由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有包含上述氨基酸序列的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性蛋白质，(e)碱基序列，其与由编码序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有上述蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(7)(6)所述的核酸，其含有以下(a)(c)中任一项的碱基序列，(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中110个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有包含上述氨基酸序列的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、5CTC的条件下杂交，且编码具有上述碱基序列编码的蛋白质己表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，10(c)碱基序列，其编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有包含上述氨基酸序列的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性的蛋白质，(8)蛋白质，其如以下(a)或(b)中任一项所述，(a)蛋白质，其由序列号2或4中l个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性，(b)蛋白质，其是由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性。(9)蛋白质，其如以下(a)或(b)中任一项所述，(a)蛋白质，其由序列号2或4中l个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有形成在由上述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性，i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(b)蛋白质，其由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有形成在由上述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性。i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(10)蛋白质，其如以下(a)或(b)中任一项所述，(a)蛋白质，其由序列号2或4中l个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有由上述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性，.(b)蛋白质，其由与序列号2或序列号所4组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有由上述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性。(11)蛋白质，其由序列号2或4表示的氨基酸序列组成。(12)重组载体，其含有(1)(7)中任一项所述的核酸。(13)转化体，其被(12)所述的重组载体转化。(14)脂肪酸组合物，其为培养(13)所述的转化体获得的脂肪酸组合物，其特征在于，在上述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)iv)中至少一项以上比培养未用(12)的重组载体转化的宿主获得的培养物的上述比率高。i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率(15)脂肪酸组合物，其为培养(13)所述的转化体获得的脂肪酸组合物，其特征在于，上述脂肪酸组合物中花生四烯酸含有率比培养未用(12)所述的重组载体转化的宿主获得的培养物的高。(16)脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养(13)所述的转化体获得的培养物中，提取(14)或(15)所述的脂肪酸组合物。(17)食品，其含有(14)或(15)所述的脂肪酸组合物。本发明的LPAAT与以往的LPAAT的底物特异性不同，可在宿主中产生与表达以往LPAAT的宿主产生的脂肪酸组合物的组成不同的脂肪酸组合物。因此可提供具有期望特性、效果的脂质，所以作为可适用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的物质是有用的。本发明的LPAAT已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率，比未表达本发明的LPAAT的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高，从该细胞的培养物中获得的脂肪酸组合物，因为可期待其在营养学方面有更高的效果，所以优选。此外，因为本发明的LPAAT可提高脂肪酸、储存脂质的生产能力，所以优选作为可提高微生物、植物中高不饱和脂肪酸的生产能力的酶。图1是表示本发明的2个同源基因LPAAT3及LPAAT4和公知的同源基因LPAAT1及LPAAT2的关系的系统树。图2表示本发明的LPAAT3的cDNA序列和推定氨基酸序列。图3表示LPAAT4的cDNA序列和推定氨基酸序列。图4是比较LPAAT3和LPAAT4的CDS部分的DNA序列的图。图5是比较LPAAT3和LPAAT4的推定氨基酸序列的图。图6是比较LPAAT3p及LPAAT4p的推定氨基酸序列和已知氨基酸序列的图。具体实施例方式本发明涉及以酰化溶血磷脂酸生成磷脂酸为特征的来自被孢霉属(Mortierella)的新型溶血磷脂酸酰基转移酶基因。本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)，是催化将溶血磷脂酸酰化生成磷脂酸的反应的酶。酰基供体通常为酰基CoA，但不限于此。此外，本发明涉及的蛋白质发挥作用的酰基转移反应的酰基受体不仅限于LPA，各种溶血磷脂质均可作为酰基受体。本发明涉及的LPA(也称为l一酰基一sn—甘油一3—磷酸)是甘油磷脂质的1种。LPA是通过甘油一3—磷酸(也称为sn—甘油一3—磷酸)的1位(a位)羟基酰化生成的仅具有1个脂肪酸的溶血磷脂质。LPA不仅是脂质生物合成的中间体，而且是具有细胞增殖、血小板凝集效果、平滑肌收縮效果、癌细胞浸润促进效果等领域广泛的生物学、药理学作用的脂质性细胞内及细胞间介质。编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)中包含LPMT3及LPAAT4。将编码LPAAT3及LPAAT4的核酸的cDNA、CDS、0RF以及氨基酸序列的对应关系整理记载于以下表l内。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>也就是说，作为与本发明的LPAAT3相关的序列，可例举LPAAT3的氨基酸序列的序列号2、表示LPAAT3的0RF区域序列的序列号36、表示其CDS区域序列的序列号8、以及其cDNA的碱基序列的序列号l。其中，序列号8相当于序列号1的第1581147位碱基序列，序列号36相当于序列号1的第1581144位碱基序列、以及序列号8的第1987位碱基序列。同样，作为与LPAAT4相关的序列，可例举LPAAT4的氨基酸序列的序列号4、表示LPAAT4的0RF区域序列的序列号37、表示其CDS区域序列的序列号23、以及表示其cDNA的碱基序列的序列号3。在此，序列号23相当于序列号3的第55996位碱基序列，序列号37相当于序列号3的第55993位碱基序列、以及序列号23的第1939位碱基序列。本发明的核酸，除单链及双链DNA之外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制作。DNA中例如可例举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及其组合物、DNA和RNA的杂交体等，但并不限于这些。作为本发明的核酸的优选形态，可例举(a)序列号36或序列号37表示的碱基序列、(b)编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1或3表示的碱基序列等。序列号36或序列号37表示的碱基序列及编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、以及序列号1或3表示的碱基序列，如表1中记载。为了获得上述碱基序列，也可从具有LPMT活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与以往的具有LPAAT活性的蛋白质有高的同一性的蛋白质的碱基序列。作为具有LPAAT活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可例举高山被孢霉(M.alpina)，但并不限于此。进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法，可参考"MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded."(ColdSpringHarborPress(2001))。并且也可用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举以下方法。即将脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的适当菌株接种到适当的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，例如作为培养基的组成可例举1.8%葡萄糖、1%酵母膏、P朋.O，培养时间为3天，培养温度为28。C的条件。然后将预培养物在适当的条件下供给本培养。作为适合本培养的培养基组成，例如可例举丄8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄榄油、0.01%Adecanol、0.3%KH2P04、0.1%Na2S04、0.05%CaCl22H20、0.05%MgCl26H20、p服.O。作为适合本培养的培养条件，例如可例举300rpm、lvvm、26X:下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。在本培养中适时提取培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从获得的总RNA中纯化poly(A)+RNA。并且可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意的克隆的碱基序列，使用按照可确定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物进行确定，可获得EST。例如用ZAP-cDNAGi卿ackIIIGoldCloningKit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。LPAAT3及LPAAT4的0RF间的碱基序列的同一性为66.6。/L另一方面，作为来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT有公知的LPAAT1和LPAAT2。这2个同源物和本发明的2个同源物的关系如图1的系统树所示。本发明的LPAAT3和公知的LPAAT1及LPAAT2的0RF的碱基序列的同一性分别为34.3%、47.0%，LPAAT4和公知的LPAAT1及LPMT2的0RF的碱基序列的同一性分别为34.6%、47.3%。图1表明，本发明的LPAAT3及4，作为进化分类来说已与公知的LPAAT相差甚远，其功能也不相同。即如下所述，本发明的LPAAT3及4，可使宿主中产生与公知的LPAAT已表达的宿主所产生的脂肪酸组合物有不同组成的脂肪酸组合物，并且具有本发明LPAAT已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比本发明的LPAAT未表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的、与公知的LPAAT完全不同的功能。此外，对编码本发明的LPAAT3的碱基序列及编码LPAAT4的碱基序列分别进行BLASTX分析，结果与E-value最低的编码来自玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)521的推定蛋白质(图1)(UM06426.1，GBaccessionNo.EAK87199)的碱基序列(GBaccessionNo.XM—757480)的同一性分别为49.2%、51.3%。同样，LPAAT3和LPAAT4之间的氨基酸序列的同一性为69.1%，LPAAT3和公知的LPAAT1及LPAAT2的同一性分别为12.3%、17.3%，LPAAT4和公知的LPAAT1及LPAAT2的同一性分别为12.5%、15.5%。此外，将本发明的LPAAT3的氨基酸序列及LPAAT4的氨基酸序列分别进行BLASTP分析，结果也是与E-value最低的来自玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)521的推定蛋白质(图1)(UM06426.1，GBaccessionNo.EAK87199)的同一性分别为36.2%、36.7%。本发明还包括与含有上述序列号36及37表示的碱基序列(有时记为"本发明的碱基序列")、以及编码由序列号2及4表示的氨基酸序列(有时记为"本发明的氨基酸序列")组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。"具有同等功能"是指，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有LPAAT活性。LPAAT活性可用公知的方法测定，例如可例举以下方法，g卩从本发明的LPAAT表达后的酵母中，通过J.Bacteriology,173，2026-2034(1991)所述的方法等制备微粒体组分。接着，在反应液0.44mMLPA、0.36mM酰基-CoA、0.5mMDTT、lmg/mlBSA、2mMMgCl2、Tris-HC1(pH7.5)中添加上述微粒体组分，在28。C下反应适当时间，添加氯仿甲醇使反应停止后，进行脂质提取，将得到的脂质通过薄层色谱法等进行分离，可对上述反应生成的PA量进行定量。其结果，生成的PA量越多，即可判断LPMT的活性越高。例如通过本方法使LPAAT3、LPAAT4表达的菌株中，上述反应中用亚油酰基一CoA作为酰基一CoA时，PA组分中含有的亚油酸(18:2)的量增加。因此，可以说LPAAT3及LPAAT4具有LPAAT活性。此外，除这种LPAAT活性之外，还包括具有下述活性的蛋白质(以下，有时称为"具有可形成本发明的LPAAT的脂肪酸组成的活性的蛋白质")的情况，该活性为可形成在本发明的碱基序列编码的蛋白质或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率中的至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性。具体为含有编码具有下述活性的蛋白质的碱基序列的核酸，该活性为可形成将插入上述本发明的碱基序列等的表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221—1228'1995)以酵母SaccharomycescerevisiaeEH13-15株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30515-520，1989)作为宿主进行转化，将培养获得的转化体后回收的菌体，用以下实施例7记载的方法进行脂肪酸分析时，上述本发明的LPAAT的脂肪酸组成具体为i)油酸含量为52%以上ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为7.25以上iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为9.94以上，以及iv)硬脂酸及油酸的含量相对于棕榈酸含量的比率为10.72以上的数值的脂肪酸组成的活性。更优选本发明的碱基序列等是含有编码具有LPAAT活性及可形成上述本发明的LPAAT脂肪酸组成的活性的蛋白质的碱基序列的核酸。此外，对于这些脂肪酸组成，使用与上述实施例7记载的方法不同的培养条件培养时，有时其组成多少会有变化。作为上述培养条件例如可例举温度、培养时间。进而，上述"具有同等功能"中，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质除具有LPAAT活性及可形成本发明的LPAAT的脂肪酸组成的活性之外，还包括具有如下活性的蛋白质(有时称"具有提高本发明的细胞内花生四烯酸含有率的活性的蛋白质")的情况，该活性为本发明的碱基序列编码的蛋白质、或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率比未表达上述蛋白质的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高的活性。对于花生四烯酸，在"本发明的脂肪酸组合物"项中说明。这种核酸，具体为含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列的核酸，即具有的活性为与上述相同，可形成将插入本发明的碱基序列等的表达载体pYE22m，以在酵母SaccharomycescerevisiaeYPH499株中导入并表达A12脂肪酸去饱和酶、△6脂肪酸去饱和酶、A6脂肪酸链延长酶以及A5脂肪酸链延长酶后生产花生四烯酸的酵母ARA3-1株为宿主进行转化，将培养获得的转化体后回收的菌体，利用以下实施例7记载的方法进行脂肪酸分析时，细胞内的花生四烯酸含有率与未表达上述蛋白质的宿主相比为高比率的脂肪酸组成。进一步优选本发明的碱基序列等是含有编码具有LPAAT活性及提高本发明的细胞内花生四烯酸含有率的活性的蛋白质的碱基序列的核酸。这种作为与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举含有以下(a)(e)中任一项所述的碱基序列的核酸。此外，在以下例举的碱基序列的记载中，"本发明的上述活性"是指，上述"LPMT活性及/或可形成上述本发明的LPAAT的脂肪酸组成的活性及/或提高本发明的细胞内花生四烯酸含有率的活性"。(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，包括编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。具体为编码由下述氨基酸序列组成的蛋白质、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，(i)序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1100个、150个、130个、125个、120个、115个、110个、更优选15个))氨基酸发生缺失后的氨基酸序列，(ii)序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1100个、150个、130个、125个、120个、115个、110个、更优选15个))氨基酸用其他氨基酸取代后的氨基酸序列，(iii)序列号2或4表示的氨基酸序列中附加1个或多个(优选1个或数个(例如1100个、150个、130个、125个、120个、115个、l10个、更优选15个))其他氨基酸后的氨基酸序列，或(iv)将(i)(iii)组合后的氨基酸序列其中，取代优选为保守取代，保守取代是指，将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变原来序列的结构相关的特征，也可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构，或者不破坏赋予原来序列特征的其它种类的二次结构，也可为任何取^^。保守取代通常用生物学体系合成、化学肽合成来导入，优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也含有肽模仿物、氨基酸序列中没有被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。以下按照可取代氨基酸残基的残基分类例示，但可取代的氨基酸残基并不限于以下记载的残基。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2—氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2—氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4一二氨基丁酸、2，3—二氨基丙酸；E组脯氨酸、3—羟基脯氨酸、4一羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。非保守性取代时，上述种类中的1种成分可以与其他种类的成分交换，此时为了保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131(1982))。此外，非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。在本说明书及图中，碱基、氨基酸及其縮略语，均遵照IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature的规定，或者基于例如Immunology--ASynthesis(第2片反，E.S.Golub及D.R.Gren监修，SinauerAssociates,Massachusetts州Sunderland(1991))等记载的同领域惯用的缩略语。此外，对于氨基酸，如果有光学异构体时，如无特别标示，均表示L体。D—氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、a,a—二取代氨基酸等非天然氨基酸、N—烷基氨基酸、乳酸、以及其它非惯用的氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。此外，本说明书中使用的蛋白质的表示方法，根据标准用法及同领域常用的表示方法，左方是氯基末端方向，右方是羧基末端方向。同样，在通常情况下如无特别说明，单链多核苷酸序列的左端为5'端，双链多核苷酸序列的左方为5'方向。如果是同领域技术人员，使用同领域公知的技术，可设计并构建本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如通过将认为对本发明的蛋白质的生物学活性不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而可改变其结构的蛋白质分子中适当的区域。并且也可鉴定在类似蛋白质间保存的分子残基及区域。进而，在认为对本发明的蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏.生物学活性、且对蛋白质的多肽结构不产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是，在本发明中，如图6中的双重下线所示，本发明的2个LPAAT的氨基酸序列中，有保守基序(motif)"HXXXXD(HXJ))"(保守氨基酸残基用*符号表示)。该基序(motif)是甘油磷脂质酰基转移酶(Glycerolipidacyltransferase)所必需的基序(motif)(J.Bacteriology,180，1425-1430，1998)，对于本发明的LPAAT来说也是重要的基序(motif)。因此，本发明的突变体保存有上述保守基序(motif)，并且只要不损坏本发明的上述活性，可以是任何突变体。此外表明上述保守基序(motif)中，X可以是任意氨基酸残基。只要是同领域技术人员，通过鉴定对本发明的蛋白质生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽相类似的肽残基，比较这2个肽的氨基酸残基，即可预测与本发明的蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，也就是说，可进行结构-功能研究。进一步通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持本发明蛋白质的生物学活性的突变体。此外，如果是同领域技术人员，也可对本蛋白质的突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。并且从获得的分析结果中，也可预测与蛋白质的三维结构相关的氨基酸残基的比对。预测在蛋白质表面上存在的氨基酸残基，.有参与和其他分子的重要相互作用的可能性，如果是同领域技术人员，均可根据上述分析结果，构建使预测在这种蛋白质表面上存在的氨基酸残基不变化的突变体。进而如果是同领域技术人员，也可构建在构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基中，仅有一个氨基酸残基发生取代的突变体。将这种突变体通过公知的分析方法进行筛选，可收集各种突变体的信息。因此，通过对某种特定氨基酸残基被取代的突变体的生物学活性与本发明的蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现这种生物学活性时、或者产生阻碍本蛋白质的生物学活性的不适当活性时的情况进行比较，可评价构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是同领域技术人员，根据这种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，即可容易地分析作为本发明蛋白质的突变体所不期望的氨基酸取代。如上所述，由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，可根据《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》(ColdSpringHarborPress(2001))、《CurrentProtocolsinMolecularBiology》(JohnWiley&Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.'Acad.Sci.USA82:488—92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6等记载的定点诱变法等方法进行制备。这种氨基酸发生了缺失、取代或附加等突变的突变体的构建，例如可使用通过Kunkel法、Gappedduplex法等公知的方法，使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒，例如QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司制)、GeneTailorSite-DirectedMutagenesisSystem(Invitrogen公司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等-TaKaRaBio公司制)等进行。此外，作为在蛋白质的氨基酸序列中，在保持其活性的同时导入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，除上述定点诱变之外，还可例举用突变源处理基因的方法、以及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。本发明的核酸中含有的碱基序列，优选为编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中110个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有LPAAT活性的蛋白质的碱基序列。此外，本发明的核酸中含有的碱基序列中，也包括编码由序列号2或4中l10个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的蛋白质中氨基酸的突变或修饰的数量、或者突变或修饰的位点，只要保持LPAAT活性、或本发明的可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性、或本发明的提高细胞内花生四烯酸含有率的活性，没有特别限定。本发明的LPAAT活性、或本发明的可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性、或本发明的提高细胞内花生四烯酸含有率的活性，可用公知的方法测定。例如可参照以下文献J.B.C.，265，17215-17221，1990。例如本发明的"LPAAT活性"可按以下方法测定，从使本发明的LPAAT表达后的酵母中，通过J.Bacteriology,173，2026-2034(1991)记载的方法制备微粒体组分。接着在反应液0.44mMLPA、0.36mM酰基-CoA、0.5mMDTT、lmg/mlBSA、2raMMgCl2、50mMTris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒体组分，在28。C下反应适当时间，添加氯仿甲醇终止反应后，进行脂质的提取，将获得的脂质通过薄层色谱法等进行分离，可对生成的PA量进行定量。此外，本发明的"可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性"，例如可按照以下方法测定。在通过本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加并搅拌以适当比率调整的氯仿甲醇后，加热处理适当时间。进一步通过离心分离来分离菌体，回收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化后，添加氯仿等溶剂溶解脂质。将该试样分取适量，利用盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己垸提取，蒸馏除去己垸后，用气相色谱法进行分析。此外，本发明的"提高细胞内花生四烯酸含有率的活性"，也可用上述方法通过分析花生四烯酸的含量来测定。(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，包括与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。关于序列号36或序列号37以及LPAAT活性，如上所述。上述碱基序列，用同领域技术人员公知的方法使用适当的片段构建探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。对于杂交法的详细操作步骤，可参照《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》(ColdSpringHarborPress(2001);特别是Section6-7)、《CurrentProtocolsinMolecularBiology》(JohnWiley&Sons(1987-1997);特别是Section6.3-6.4)、《■Cloning1:CoreTechniques,APracticalApproach2nded.》(OxfordUniversity(1995);杂交条件特另'提Section2.10)等。杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中"严谨条件"包括中度或高度严谨条件。具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可例举1XSSC6XSSC、42匸55。C的条件，更优选1XSSC3XSSC、45。C50。C的条件，最优选2XSSC、5(TC的条件。杂交溶液中例如含有约50%甲酰胺时，采用比上述温度低5至15°C的温度。作为洗涤条件，可例举0.5XSSC6XSSC、40°C60°C。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05%0.2%SDS、优选约0.1%SDS。作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件，可例举O.1XSSC2XSSC、55°C65。C的条件，更优选O.1XSSC1XSSC、6(TC65'C的条件，最优选0.2XSSC、63。C的条件。作为洗涤条件，可例举0.2XSSC2XSSC、50°C68°C，更优选0.2XSSC、6065°C。特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可例举:在5XSSC、1%SDS、50rnMTris-HCl(pH7.5)及50。/。甲酰胺中在42。C的条件下，进行预杂交后，添加探针，在42。C保温过夜形成杂交体，然后在O.2XSSC、0.P/。SDS中在65。C下进行3次20分钟的洗涤的条件。但并不限于此条件。此外，还可使用探针内不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒，具体可例举使用DIG核酸检测试剂盒(RocheDiagnostics公司)、ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham公司制)的杂交等。作为本发明含有的碱基序列，优选与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50。C的条件下杂交，且编码具有LPAAT活性的蛋白质的碱基序列。(c)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列有67%以上同一性的碱基序列组成、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，包括由与序列号36或37表示的核酸序列有至少67%以上的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。可例举优选含有'与序列号36或37表示的核酸序列有至少70%、更优选75%、进一步优选80%(例如85%以上、更优选90%以上、最优选95%、98%或99%)同一性的碱基序列的核酸，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。如上所述，LPAAT3(序列号36)及LPAAT4(序列号37)的同一性为66.6%。本发明的核酸包括与序列号36或37表示的核酸序列有至少67%以上同一性、与两者类似的核酸。2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，优选使用计算机程序通过比较2个核酸的序列信息来决定，作为序列比较的计算机程序，例如可例举可利用美国国立医学图书馆网站http:Mvww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序(Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10):version2.2.7版、或WU-BLAST2.0计算法等。对于而-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站http:〃blast.wust1.edu记载的参数值。(d)碱基序列，其编码与序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有69Q/。以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，包括编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质，只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功能，也可以是与LPAAT3或LPAAT4的氨基酸序列有同一性的蛋白质。具体可例举与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列有70%以上、优选75%以上、更优选80%、进一步优选85%以上、更进一步优选90°/。(例如95%、进一步98%)以上同一性的氨基酸序列等。如上所述，LPAAT3(序列号2)和LPAAT4(序列号4)之间的氨基酸序列的同一性为69.1%。本发明的核酸编码的蛋白质包括与序列号2或4表示的氨基酸序列有至少69%以上、与两者类似的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，优选为编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。2个氨基酸序列的同一性百分数，可通过视觉检查、数学计算来决定，此外，可使用计算机程序来决定同一性百分数，作为这种计算机程序，例如可例举BLAST、FASTA(Altschul等、J.Mol.Biol.，215:403-410(1990))、及ClustalW等。特别是BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nncl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)作了记载，所以可从美国国立生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站公开获得。(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda,MD20894;Altschul等)。此外，也可使用遗传信息处理软件GENETYXVer.7(GENETYX)、DINASISPro(日立软件)、VectorNTI(Infomax)等程序来决定。使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，因为也可以显示序列中特定的短区域的配合，所以即使使用的序列的全长序列间没有显著性的关系，在这种区域，也可检测出特定的序列同一性非常高的区域。并且，BLAST算法可使用BL0SUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数，还可使用以下(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段(由Wootton及Federhen的SEG程序(ComputersandChemistry,1993)决定；Wootton及Federhen,1996"序列数据库组成偏向性区域的分析(Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatabases)",也可参照MethodsEnzymoL，266:544-71)、或短周期内部重复序列组成的片段(Claverie及States(ComputersandChemistry,1993)的XNU程序决定)遮蔽的过滤器，以及(B)用于报告相对于数据库序列的一致性25的统计学显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然性发现的一致性期望概率；因某种一致性引起的统计学显著误差大于E-score阈值时，不报告该一致性。(e)碱基序列，其与编码由序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中含有的碱基序列，包括与编码由序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交条件如上所述。作为本发明的核酸中含有的碱基序列，可例举与编码由序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。此外，本发明的核酸还包括由序列号36或序列号37组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加后的碱基序列组成、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。具体可使用含有以下碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸，(i)序列号36或37表示的碱基序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1300个、1250个、1200个、1150个、1100个、150个、130个、125个、120个、115个、110个、更优选15个))碱基发生缺失后的碱基序列，(ii)序列号36或37表示的碱基序列中1个或多个(优选1个或数个(例如1300个、1250个、1200个、1150个、1100个、150个、130个、125个、120个、115个、110个、更优选15个))碱基被其他碱基取代后的碱基序列，(iii)序列号36或37表示的碱基序列中附加1个或多个(优选1个或数个(例如1300个、1250个、1200个、1150个、1100个、150个、130个、125个、120个、115个、110个、更优选15个))其他碱基后的碱基序列，(iv)将上述(i)(iii)组合后的碱基序列。作为本发明的核酸的优选形态，也包括含有以下(a)(C)中任一项所述的碱基序列或其片段的核酸。(a)序列号36或序列号37表示的碱基序列，(b)编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(c)序列号1或3表示的碱基序列，对于(a)序列号36或序列号37表示的碱基序列、(b)编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1或3表示的碱基序列，如表1所述。上述序列的片段，包括上述碱基序列中含有的0RF、CDS、具有生物学活性的区域、作为以下记载的引物使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制作。本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白质本发明的蛋白质，包括由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质及具有与上述蛋白质同等功能的蛋白质，可来自天然，也可由人工制作。对于由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。"具有同等功能的蛋白质"，如上述"本发明的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸"项目中所述，是指具有「本发明的上述活性」的蛋白质。在本发明中，作为具有与由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质同等功能的蛋白质，可例举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质。(a)蛋白质，其由序列号2或4中l个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性，(b)蛋白质，其由与序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性；其中，对于序列号2或4中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列、或与序列号2或序列号4组成的氨基酸序列的同一性为69%以上的氨基酸序列，如上述"本发明的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸"项目中所述。此外，上述"具有本发明的上述活性的蛋白质"，是由含有序列号36或序列号37的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体，或序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等经过多种修饰发生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且是具有LPAAT活性的蛋白质，及/或具有可形成本发明的LPAAT的脂肪酸组成活性的蛋白质，及/或包括具有本发明的提高细胞内花生四烯酸含有率活性的蛋白质。此外，本发明的蛋白质，也可人工制作，此时可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用AdvancedChemTech公司制、珀金埃尔默(PerkinElmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnologyInstruments公司帝!j、Synthecell—Vega公司帝U、PerSeptive公司制、岛津制作所(島津製作所)制等的肽合成仪进行化学合成。LPAAT的核酸的克隆本发明的LPAAT的核酸，例如通过使用适当的探针从cDNA文库中筛选，可进行克隆。此外，可通过用适当的引物通过PCR反应进行扩增并和适当的载体连接进行克隆。并且还可亚克隆到其他载体上。例如可使用pBlue-ScriptSK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM:Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-T0P0(Invitrogene)等市售的质粒载体。此外，通过PCR反应进行扩增时，引物可使用上述序列号1或3等表示的碱基序列的任意部分。例如对于序列号l，可分别使用作为上游侧用引物的1-1:5'-GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG-3'(序列号9)，作为下游侧用引物的I-2:5，-CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC-3'(序列号10)，对于序列号3，可分别使用作为上游侧用引物的B-1:5，-CCTCGCAAAATGTATCGTGG-3，(序列号15)，作为下游侧用引物的B-2:5，-GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG-3'(序列号16)等。接着在从高山被孢霉(M.alpina)菌体中制备的cDNA中，使上述引物及耐热性DNA聚合酶等作用进行PCR反应。上述方法，根据《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》(ColdSpringHarborPress(2001)，，等，同令页域技术人员可容易地实施。作为本发明的PCR反应条件，例如可例举以下条件:变性温度9095。C退火温度4060。C延伸温度6075。C循环数IO次以上将获得的PCR产物进行纯化时，可使用公知的方法。例如有使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquickPCRpurificationKits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GEHealthcareBio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶中切出，可通过GENECLE認(Funakoshi)、QIAquickGelextractionKits(QIAGEN)、Freeze&Squeeze法等进《亍纯化。已克隆的核酸的碱基序列，用碱基序列测序仪来决定。LPAAT表达用载体构建及转化体的制作本发明还提供含有编码本发明的LPAAT3及4的核酸的重组载体。本发明还进一步提供被上述重组载体转化的转化体。这种重组载体及转化体可通过以下方法获得。即将含有编码本发明LPAAT的核酸的质粒用限制性内切酶进行酶切。作为使用的限制性内切酶，例如可例举EcoRI、Kpnl、BamHI及SalI等，但不限于这些。此外，也可通过T4聚合酶处理进行末端平滑化。酶切后的碱基序列片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。通过用公知的方法将该碱基序列断片重组到表达用载体内，可获得LPAAT表达用载体。将该表达载体导入宿主制作转化体，供给目的蛋白质的表达。此时，表达载体及宿主，只要能够表达目的蛋白质，没有特别限定，例如作为宿主，可例举真菌、细菌、植物、动物或其细胞等。作为真菌，可例举脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)等丝状菌、酿造酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母等。此外，作为细菌，可例举大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等。进而作为植物，可例举油菜子、大豆、棉花、红花、亚麻等油粮植物等。作为脂质生产菌，例如可使用MYC0TAX0N，Vol.XLIV，NO.2，pp.257-265(1992)所记载的菌株，具体来说属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如可例举长孢被包霉(Mortierellaelongate)IF08570、MortierellaexiguaIF08571、MortierellahygrophilaIF05941、高山被孢霉(Mortierellaalpine)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250,53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属29于被孢霉属亚属(subgenusMortierella)的微生物，或者深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)CBS194.28、IF06336、工F07824、IF07873、IF07874、IF08286、IF08308、IF07884、MortierellananaIF08190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IF05426、IF08186、CBS112.08、CBS212.72、IF07825、IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)CBS236.82等属于Micromucor亚属(subgenusMicromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierellaalpina)。将真菌类作为宿主使用时，优选本发明的核酸可在宿主中自主复制，或者是可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选是含有启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉〈M.alpina)作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDum5等。作为启动子，只要能够在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(甘油醛-34粦酸脱氢酶)基因启动子、TEF(翻译延伸因子)基因启动子等来自高山被孢霉(M.alpina)的启动子。作为向高山被孢霉(M.alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法(particledelivery)以及向核内直接显微注射DNA等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养的选择培养基上生长发育的菌株，可获得转化体。此外，转化时使用抗药性标记基因时，在含有该药剂的选择性培养基上进行培养，可获得显示抗药性的细胞菌落。使用酵母作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。此外，也可使用pYES(Invitrogen)pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。此外，作为适合于本发明的宿主，可例举SaccharomycescerevisiaeEH13-15株(trpl，MATa)等，但并不限于这些。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gall启动子、gallO启动子等来自酵母的启动子。作为向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举乙酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或复数)的包裹、以及在核内直接显微注射DNA等。使用大肠杆菌等细菌作为宿主时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。本发明的脂肪酸组合物的制造方法
技术领域：
：本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。用于培养使LPAAT表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使LPAAT表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，例示SC-Trp培养基每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g。培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。以下，作为本发明的脂肪酸组合物的具体制造方法，以使用酵母作为宿主进行2段培养为例进行说明。即作为预培养，将上述获得的菌落例如接种到上述SC-Trp培养基等中，在30。C下振荡培养2天。然后，作为本培养，在YPD5(2%酵母膏、1%多聚蛋白胨、5%葡萄糖)培养基10ml内添加预培养液500u1，在30。C下振荡培养2天。本发明的脂肪酸组合物本发明还提供布本发明的LPAAT3或4已表达的细胞中的1种或1种以上脂肪酸的集合物脂肪酸组合物。优选为培养本发明的LPAAT3或4已表达的转化体而获得的脂肪酸组合物。脂肪酸可以是游离脂肪酸，也可以是三甘油酯、磷脂质等。特别是，本发明的脂肪酸组合物的特征在于，在其脂肪酸组成中，以下i)油酸含量ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率中的至少一项以上比培养未用本发明的重组载体转化的宿主而获得的培养物的上述比率高，或者本发明的脂肪酸组合物中花生四烯酸的含有率比培养未用上述重组载体转化的宿主而获得的培养物高。在此，"未用本发明的重组载体转化的宿主"是指，例如使用未整合本说明书中的"本发明的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸"项目中所记载的核酸的载体(空载体)转化的宿主。此外，对于上述脂肪酸组合物，如上述"本发明的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸"项目中说明的那样，改变培养条件时，有时其脂肪酸组成多少也会发生变化。作为本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristicacid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻酸(myristoleicacid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9一十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式一9一十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸(ll一十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式一9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、a—亚麻酸(9，12，15—十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、Y_亚麻酸(6，9，12—十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(Stearidonicacid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，ll一二十碳二烯酸)(20:2(8，ll))、Mead酸(5，8，ll一二十碳三烯酸)(20:3(5，8，ll))、二高Y-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14一二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(5，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山嵛酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(4，7，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19—二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式一15—二十四碳烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值)。作为本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举花生四烯酸的含有率高。花生四烯酸是用化学式C2。H3A表示的、分子量为304.47的物质，是含有4个双键的20个碳链所组成的羧酸(〔20:4(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。花生四烯酸作为动物细胞膜中重要的磷脂质(特别是磷脂酰乙醇胺磷脂酰胆碱磷脂酰肌醇)而存在，在脑内大量存在。此外，花生四烯酸是通过花生四烯酸级联反应生成的前列腺素凝血黄素白三烯等一系列的类二十烷酸的起始物质，作为细胞间信息传递中的第二信使非常重要。另一方面，花生四烯酸是动物将亚麻酸作为原料在体内合成的。但是，由于动物种类或年龄等不同，该功能不充分，所以不能生产必需的量，或者完全没有了生产功能，所以必须从食物中摄取花生四烯酸，可以说花生四烯酸是必须的脂肪酸。本发明的脂肪酸组合物中的花生四烯酸含有率，例如可通过以下方法测定。即将本发明的LPAAT3或4的质粒，例如通过实施例9记载的方法，插入到pDuraSC、pDura5MCS等的载体内，在高山被孢霉(M.alpina)株中使转化获得的转化体进行表达'，使用根据实施例9记载的培养方法获得的培养菌体，测定菌体内的脂肪酸含有率、每单位培养基的花生四烯酸的含量等。作为花生四烯酸的含量等的分析方法，例如可例举通过盐酸甲醇法将获得的培养菌体的脂肪酸衍生为脂肪酸甲酯，然后用己垸提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析的方法。由此表明，将本发明的LPAAT3或4在高山被孢霉(M.alpina)中转化时，菌体内的脂肪酸含有率、每单位培养基的花生四烯酸的生产量均高。这样，花生四烯酸含有率高的本发明的脂肪酸组合物，因为能够高效摄取花生四烯酸，所以优选。本发明的脂肪酸组合物，只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合，可以是由任意数量、任意种类的脂肪酸组成的组合物。为了证明获得了这种本发明的脂肪酸组合物，即证明本发明的LPAAT3或4已表达，可使用公知的通常的方法进行。例如在酵母中使LPAAT表达时，可证明脂肪酸组成的变化。即在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿甲醇并搅拌后，加热处理适当时间，进而通过离心分离将菌体分离，回收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。将该试样分取适当量，通过盐酸甲醇法;f吏菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，用气相色谱法进行分析。其结果，在获得了具有上述脂肪酸组成的脂肪酸组合物及/或花生四烯酸含有率高的脂肪酸组合物时，可判断获得了本发明的脂肪酸组合物。此外，因为本发明的LPAAT，与公知的LPAAT脂肪酸组合物的脂肪酸组成在脂肪酸组成上不同，由此表明本发明的LPAAT与公知的LPAAT的底物特异性不同。本发明的含有脂肪酸组合物的食品等此外，本发明提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据通常方法，例如可使用于含有油脂的食品、工业原料(化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品、以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。进而，作为本发明的食品例，可例举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体、及液体及其混合物，是可摄取食用的物质的总称。营养辅助食品是指强化了特定的营养成分的食品，保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥身体的调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途食品含义相同。幼儿用食品是指供给小于约6岁的孩子用的食品，老人用食品是指处理成与无处理的食品相比，容易消化吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给小于约1岁的孩子用的配方乳，早产儿用配方乳是指供给早产儿出生后到34约6个月为止所用的配方乳。作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)；中华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味料、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。使用本发明的编码LPAAT的核酸或LPAAT蛋白质的菌株的评价选择方法本发明还提供使用本发明的编码LPAAT的核酸或LPAAT蛋白质，进行评价、选择脂质生产菌的方法。具体如下所示。(l)评价方法作为本发明的一个实施方式，可例举使用本发明的编码LPAAT的核酸或LPAAT蛋白质，进行评价脂质生产菌的方法。作为本发明的上述评价方法，首先例举使用根据本发明的碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。这种评价方法的通常方法是公知的，例如在国际专利申请手册W001/040514号、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、乙酸钾法等任《可公矢口的方法(例女口参照MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,pl30(1990))。根据本发明的碱基序列、优选根据序列号36或37设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明的碱基序列的任意部分，并且可使用公知的方法进行其设计。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为1525个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以3002000碱基为宜。使用上述构建的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明的碱基序列的特异性序列。本发明的碱基序列的特异性序列的检测可采用公知的方法进行。例如，用含有本发明的碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述5咸基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可以测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。适合本发明方法的PCR法的反应条件，没有特别限定，例如可例举以下条件，变性温度9095°C退火温度4060。C延伸温度6075。C循环数IO次以上等条件。将获得的反应生成物的扩增产物，通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可以测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明的碱基序列的特异区域的核酸分子的大小，可以预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，可以进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。此外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。此外，作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号36或37等本发明的碱基序列编码的LPAAT的表达量，可以评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，LPMT的表达量，可以通过在适当的条件下培养被测菌株，对LPAAT的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1994-2003)。此外，作为上述活性的评价方，去，可例举测定本发明的LPMT产生的脂肪酸组合物的组成及/或花生四烯酸含有率的方法。脂肪酸组合物的组成及/或花生四烯酸含有率的测定方法如上所述。(2)选择方法作为本发明的其他实施方式，可例举使用本发明的编码LPAAT的核酸或LPAAT蛋白质进行选择脂质生产菌的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号36或37等本发明的碱基序列编码的LPAAT的表达量，选择目的表达量的菌株，可以选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可以选择出期望的菌株。具体来说，例如将标准菌株和被测菌株在适当的条件下培养，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比较，被测菌株为高表达、或低表达的被测菌株，可以选择具有期望活性的菌株。对于期望的活性，如上所述可例举测定LPAAT的表达量及/或LPAAT产生的脂肪酸组合物的组成及/或花生四烯酸含有率的方法。此外，作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，可以选择具有期望活性的被测菌株。对于期望活性，如上所述，可例举测定LPAAT的表达量及/或LPAAT产生的脂肪酸组合物的组成及/或花生四烯酸含有率的方法。作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸的表达受到抑制的菌株、实施突变处理的菌株、发生自然突变的菌株等，但并不限于这些。此外，本发明的LPAAT活性及可形成LPAAT的脂肪酸组合物的活性及提高本发明的细胞内花生四烯酸含有率的活性，例如可通过本说明书中的"本发明的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸"、"本发明的脂肪酸组合物"项目中记载的方法进行测定。作为突变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原名；大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版七>夕一)。但不限于这些。此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体来说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。'37实施例以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例1(1)EST分析将高山被孢霉(M.alpina)1S-4株接种到100ml的培养基(1.8%葡萄糖、1%酵母膏、pH6.0)中，在28。C预培养3天。在10L培养槽(AbleCo.，东京)中加入5L培养基(1.8。/。葡萄糖、P/。大豆粉、0.1%橄榄油、0.01%Adecanol、0.3%KH2P04、0.1%Na2S04、0.05%CaCl22H20、0.05%MgCl26H20、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、lvvm、26°C的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2、及3天分别添加相当于2%、2%、及1.5%的葡萄糖。在培养的第l、2、3、6、及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备总RNA。使用01igotex-dT30〈S叩er〉mRNAPurificationKit(TaKaRaBio)，从总RNA中纯化poly(a)+RNA。使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(STRATAGENE)，构建各阶段的cDNA文库，进行cDNA的5'端一步法序列分析(8000克隆X5步)。将获得的序列进行聚类，其结果，获得约5000序列。(2)LPAAT同源基因的检索将通过EST分析获得的碱基序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列使用同源性检索程序BLASTX进行检索，提取出LPAAT基因的同源基因。其结果，发现4个LPAAT同源基因的序列(序列号l、5、6及7)。在上述检索中，各序列显示最高同一性的蛋白质如下所示。序列号5和来自粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的l一酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶类推定蛋白质(GBaccessionNo.EM28956)，序列号6和来自甘蓝型油菜(Brassicanapus)的1—酰基一sn—甘油一3一磷酸酰基转移酶类推定蛋白质(GBaccessionNo.T07936)，序列号1和来自构巢裸胞壳(Emericellanidulans)的l一酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶类蛋白质AtaAp(GBaccessionNo.AAD37345),序列号7和来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的l一酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶蛋白质Slclp(GBaccessionNo.CAA98614)，同一性分别最高。比较国际专利申请手册W02004/087902号和美国专利申请US2006/0094O90号公报说明书中记载的高山被孢霉(M.alpina)的LPMT同源基因的序列和上述获得的序列，发现序列号5是LPMT1同源基因的部分序列，序列号6是LPAAT2同源基因的部分序列。因此，将与序列号5相关的基因作为LPAAT1基因，与序列号6相关的基因作为LPAAT2基因，与序列号1相关的基因作为LPMT3基因，与序列号7相关的基因作为LPAAT4基因。对于上述序列，其来源文库和其EST如表2所示。此外，表2中表示了来自培养第几天获得的cDNA文库的克隆。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>实施例2(1)LPAAT同源基因的克隆序列号1中含有由990bp组成的CDS(序列号8)，认为其是编码LPAAT3全长基因的序列。被该基因编码的蛋白质(LPAAT3p)的推定氨基酸序列用序列号2表示。为了通过PCR扩增含有该ORF序列的DNA，构建以下引物。引物1-1:GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG(序列号9)引物I-2:CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC(序列号10)将第3天的cDNA文库作为模板，通过引物1_1和1-2，使用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR。PCR的条件为94°C2分钟以后，将94°C1分钟、54°C1分钟、72°C2分钟作为1个循环，进行30个循环。将扩增的片段用TOPO-TAcloningKit(INVITROGENCORPORATION)进行TA—克隆，确认有多少个克隆的碱基序列，将认为是含有该基因的正确碱基序列的克隆作为pCR-LPAAT3。因为序列号5、6及7中不存在认为是编码LPAAT同源物的CDS，因此为了39克隆编码这些基因全长的CDNA，根据各序列构建以下引物。根据序列号5设计的引物引物955-1:GGACGTGTCAAGGAAAAGGA(序列号ll)引物955-2:TCCTTCAGATGAGCCTCCTG(序列号12)根据序列号6设计的引物弓1物A-1:ggcgtccttctccacgtacttc(序列号13)弓I物A-2:gtgaaatacattccattctacg(序歹U号14)根据序列号7设计的引物引物B-1:CCTCGCAAAATGTATCGTGG(序列号15)引物B-2:GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG(序列号16)使用这些引物，将含有构成各序列号5、6及7的EST的cDNA文库作为模板，使用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR反应。将获得的DNA片段用T0P0-TAcloningKit(INVITROGENCORPORATION)进行TA—克隆，确定各插入部分的碱基序列。其结果，确认含有序列号5的第20位到518位、序列号6的第116位到第616位、序列号7的第159位到第687位的碱基序列的DNA片段已分别被克隆，将这些质粒分别作为pCR-955-P、pCR-A-P及pCR-B-P。接着，将这些质粒分别作为模板，使用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了ExTaq(TaKaRaBio)，但用PCR标记用混合物(RocheDiagnostics公司)代替添加的dNTP混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，构建用于筛选cDNA文库的探针。使用该探针，对通过EST分析获得了构成各种序列的EST的cDNA文库进行筛选。杂交条件如下所示。缓冲液5XSSC、1%SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)、50%甲酰胺;温度:42。C(一夜)；洗涤条件在0.2XSSC、0.P/。SDS溶液中(65。C)，20分钟X3次；捡测，使用DIG核酸检测试剂盒(RocheDiagnostics公司)进行。从经过筛选获得的噬菌体克隆中，通过体内切割，切出质粒，获得各质粒DNA。筛选含有序列号5的cDNA，获得的克隆的插入碱基序列用序列号17表示。序列号17中含有从第36位到第1289位的1254bp所组成的CDS，所以认为获得了编码LPAAT1同源物全长的序列。由该基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列用序列号18表示。将含有序列号17的质粒作为pB-LPAAT1。筛选含有序列号6的cDNA获得的插入长度最长的克隆的插入碱基序列用序列号19表示。序列号19中含有从第26位到第949位的924bp所组成的CDS，所以认为获得了编码LPAAT2同源物全长的序列。由该基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列用序列号20表示。将含有序列号19的质粒作为pB-LPAAT2。筛选含有序列号7的cDNA获得的克隆中，确定插入长度最长的克隆的^^基序列，发现其中含有序列号1的第103位到第1148位的碱基序列。因为其含有与上述获得的序列号.7共有的序列，装配这些序列后获得序列号3表示的序列。序列号3中存在由序列号23表示的942bp所组成的CDS，认为获得了编码LPMT同源基因全长的序列。被该基因编码的蛋白质(LPAAT4p)的推定氨基酸序列用序列号4表示。为了利用PCR扩增含有该区域的DNA，构建以下引物。B-3:CAYGYCCATAGGCTCTTCTAATCC(序列号21)B-4:GTTTTACTCTTTCAGTGTCCTCC(序列号22)以从第3天的菌体中制备的cDNA作为模板，通过引物B-1和B-2，使用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR。将扩增的片段TA—克隆到pCR2.1-T0P0上，确认碱基序列，将含有该基因的正确碱基序列的克隆作为pCR-LPAAT4。(2)序列分析将上述获得的来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT同源物的cDNA序歹lj，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列，使用BLASTX进行同源性分析。其结果是，相对于各序列E-value最低、即同一性最高的氨基酸序列如下所示。与各序列的0RF同一性最高的序列相关的碱基序列的同一性、及氨基酸序列的同一性用clustalW求出，以下合并记载。序列号17，仅比较相当于来自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的l一酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶类的推定蛋白质(GBaccessionNo.EAA60126)部分时，碱基序列为51%、氨基酸序列为32.1%。序列号19，仅比较相当于来自稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)的l一酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶类的推定蛋白质(GBaccessionNo.EAA48685)的部分时，碱基序列为53%、氨基酸序列为31%。序列号1及3，仅比较相当于来自玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)的l一41酰基一sn—甘油一3—磷酸酰基转移酶类的推定蛋白质(GBaccessionNo.EAK87199)的部分时，序列号1的碱基序列为49%、氨基酸序列为37%;序列号3的碱基序列为51%、氨基酸序列为36%。此外，对于序列号17和序列号19，用各种来自高山被孢霉(M.alpina)的已知的LPAAT同源物的LPAAT1基因(W02004/087902)和LPAAT2基因(US2006/0094090)以及其编码的推定氨基酸序列进行比较。将上述文献中公开的序列和从高山被孢霉(M.alpina)1S-4株得到的序列在各自相当的区域比较时，确认LPAAT1的碱基序列为89%、氨基酸序列为91%的同一性，LPAAT2的碱基序列为92%、氨基酸序列为98%的同一性。另一方面，序列号14,与已知的碱基序列及氨基酸序列比较时同一性并不显著地高，认为是来自高山被孢霉(M.alpina)的新型LPAAT基因。各个cDNA序列和推定氨基酸序列如图2及图3所示。将LPAAT3和LPAAT4的0RF部分的DNA序列比较时，同一性为67%(图4)，比较被所述基因编码的蛋白质LPAAT3p和LPAAT4p的推定氨基酸序列时，同一性为69%(图5)。将LPAAT3p及LPAAT4p的推定氨基酸序列和已知的氨基酸序列相比较(图6)。如图的下线所示，LPAAT3p及LPMT4p也与所述的LPAAT蛋白质或其同源物相同，保留有甘油脂酰基转移酶(Glycerolipidacyltransferase)的保守序列HXJ)(J.Bacteriology,180，1425—1430，1998)。这里，图6的氨基酸中，gi—46101966表示的氨基酸序列(序列号40)来自玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)521(GBaccessionNo.EAK87199)，gi—5002178表示的氨基酸序列(序列号41)来自构巢裸胞壳(Emericellanidulans)(GBaccessionNo.AAD37345),gi—6320151表示的氨基酸序列(序列号42)来自酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(GBaccessionNo.NP一010231)，gi_19115517表示的氨基酸序列(序列号43)来自裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)972h-(GBaccessionNo.NP—594605)，gi_17564032表示的氨基酸序列(序列号44)来自线虫(Caenorhabditiselegans〕(GBaccessionNo.NP—505578)。实施例3LPAAT活性的测定(1)Aslcl:URA3株的育种为了获得已知具有酵母的LPAAT活性的基因SLC1的CDS,构建以下引物。引物SLC1-1ggtgaagggggaattcttc(序列号45)弓I物SLC1-2atgtcgacgtggcttaatgcatc(序列号46)为了获得酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C株的基因组DNA，将其接种到YPD培养基10ml中，30。C下振荡培养1天。从培养液1.5ml中，使用DR.GenTLE(TaKaRaBio商标)(酵母用)，提取DNA。以此为模板，使用引物SLC1-1和SLC1-2通过PCR反应扩增SLC1的CDS。将获得的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和Sail酶切，插入载体pUC18的EcoRI-Sa11位点后，确认碱基序列，获得质粒pUC-SLC1。接着，用限制性内切酶SalI将质粒pUC-SLC1酶切后，进行末端平滑化，通过自身连接作用，获得质粒pUC-SLC1-2。SLC1基因的缺失株按以下方法构建。将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276号公报)且将末端平滑化后获得的约1.2kb的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRV和HincII酶切质粒pUC-SLC1-2获得的约3.lkb的DNA片段连接，构建质粒pUCAslcl:URA3。将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499株(STRATAGENE)，用经限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒pUCAslcl:URA3后的DNA片段转化，转化株选择可在SC-Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸O.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2%琼脂)上生长发育的转化株。将获得的转化株中的任意l株作为Aslcl:URA3-l株。(2)向Aslcl:URA3株内导入LPAAT基因为了构建ScSLCl表达用载体，将用限制性内切酶EcoRI和Sail酶切pUC-SLCl后获得的0.9kb的DNA片段，插入载体pYE22m的EcoRI-Sail位点，构建质粒pYE-ScSLCl。将Aslcl:URA3.-1株用质粒pYE22m、pYELPAAT3、pYELPAAT4、pYESLCl分别进行转化。转化株选择可在SC-Trp，Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2%琼脂)上生长发育的转化株。将用各种质粒获得的转化株的任意株作为C-3株、LPAAT2-3株、LPAAT3-3株、SLC1-3株。(3)微粒体组分的制备将C-3株、LPAAT3-3株、LPAAT4-3株、SLC1-3株分别在SC-Trp，Ura液体培养基10ml中，3(TC下振荡培养1天。取该培养液lml接种到SC-Trp，Um液体培养基100ml中，28。C下培养1天。将菌体通过离心分离收集，用1/2量的灭菌水洗漆，然后悬浮在5ml的缓冲液B(0.6M山梨糖醇、5mM2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、lmMKC1、0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、lmM苯甲基磺酰氟(PMSF)、pH6.O)中。使用法式压滤壶，在16kPa下破碎菌体，在20000Xg、4。C下离心分离1小时，将获得的上清进一步在100000Xg、4"C下离心分离1小时，将获得的沉淀物溶解于缓冲液B中，调整微粒体组分。各试样中含有的蛋白质浓度，用蛋白质分析CBB溶液(NacalaiTesque)进行定量。(4)LPAAT活性的测定LPAAT活性按以下方法测定。反应液为100ug1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸(LPA-18:1)、50ug亚油酰基辅酶A(18:2-CoA)、0.5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mg牛血清白蛋白(BSA)、2mMMgCl2、50mMTris-HCl缓冲液pH7.5、100u1微粒体组分，使全体量为500u1。在28'C下反应10分钟，添加1875p1的氯仿甲醇1:2溶液终止反应。作为内标，添加20Pg的1，2-二-十七酰基-sn-甘油-磷酸。根据Bligh&Dyer等的方法提取脂质，总量通过薄层色谱法(TLC)分离。TLC使用硅胶60板(Merck)，展开剂为氯仿甲醇乙酸水=170:25:25:4。刮取PA组分，加入lml的二氯甲垸和2ml的10%盐酸甲醇，通过盐酸甲醇法使脂肪酸衍生为甲酯后，用己垸提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析，对该组分中含有的亚油酸量进行定量。通过上述反应PA组分中的每单位酶液蛋白质的亚油酸的值如表所示。表3PA组分中的每单位酶液蛋白质的亚油酸的值(LPAAT活性)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>这样，使LPAAT3、LPAAT4、SLC1表达的株中，上述反应中PA组分中含有的亚油酸(18:2)量增加，表明LPAAT3及LPAAT4具有LPAAT活性。实施例4酵母表达载体的构建为了使LPAAT1、LPAAT2、LPAAT3及LPAAT4在酵母中表达，如下所述，构建酵母表达用载体。为了使LPAAT1在酵母中表达，如下所述构建酵母表达载体。§卩将质粒pB-LPAATl作为模板，使用以下引物LPAAT1-6F(序列号38)和LPAAT1-R1(序列号39)，使用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR反应。LPAAH-6F:TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC(序列号38)LPAAT1-R1:GTCGACTCMCCAGACGATACTTGCTGCAGAG(序列号39)对于获得的DNA片段，使用T0P0-TAcloningKit(INVITROGEN)，进行TA-克隆，确认插入部分的碱基序列，将具有正确的碱基序列的质粒作为pCR-LPAATl。将用限制性内切酶EcoRI和Sail酶切该质粒获得的约1.3kb的DNA片段，插入酵母表达，载体pYE22m的EcoRI-Sail位点，构建质粒pYE-MALPAATl。为了使LPAAT2在酵母内表达，如下所述，构建酵母表达载体。即用限制性内切酶KpnI酶切质粒pB-LPAAT2后，通过碱性磷酸酯酶处理进行末端平滑化，接着将用限制性内切酶BamHI酶切获得的DNA片段，插入用限制性内切酶Sail酶切后进行末端平滑化并继续用限制性内切酶BamHI酶切后的酵母用表达载体pYE22m内，作为质粒pYE-MALPAAT2。为了使LPAAT3及4在酵母内表达，如下所述，构建酵母表达载体。BP:用限制性内切酶EcoRI酶切质粒pCR-LPAAT3或质粒pCR-LPAAT4，切出插入部分，连接于酵母用表达载体pYE22m的EcoRI位点。确认插入的DNA片段的方向，将从pYE22m的GAPDH启动子开始按0RF可转录的方向插入后的产物分别作为pYE-MALPAAT3及pYE-MALPAAT4。实施例5酵母的转化用质粒pYE22m、pYE-MALPAAT1、pYE-MALPMT2、pYE-MALPAAT3或pYE-MALPMT4，通过乙酸锂法转化入酵母SaccharomycescerevisiaeEH13-15株(trpl，MATa)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)中。转化株选择在SOTrp(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉((腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2y。琼脂)上生长发育的菌株。实施例6酵母的培养分别选择使用各个载体的任意2株转化株(c-l株、c-2株、LPAAT1-1株、LPAAT1-2株、LPAAT2-1株、LPAAT2-2株、LPAAT3-1株、LPAAT3-2株及"LPAAT4-1株、LPAAT4-2株)，在以下条件下培养。即作为预培养，从平板上取1白金耳酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，在30。C下振荡培养2天。本培养是在YPD5(酵母膏2%、多聚蛋白胨1%、葡萄糖5%)培养基10ml中添加预培养液500u1，30。C下振荡培养2天。实施例7酵母的脂肪酸分析通过离心分离酵母培养液，回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，再通过离心分离回收菌体，进行冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中添加氯仿甲醇(2:l)4ml，剧烈搅拌后，7(TC下处理1小时。通过离心分离分离菌体，回收溶剂。在残留的菌体中再次添加氯仿甲醇(2:l)4ml，同样回收溶剂。在离心浓縮仪中使脂质干燥固化后，添加2ml氯仿溶解脂质。从该试样中分取200ul，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己垸提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。其结果如表4所示。表4转化株的脂肪酸组成(宿主EH13-15)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>比较导入来自高山被孢霉(M.alpina)的4个LPAAT同源物的酵母和对照酵母的脂肪酸组成。导入LPAAT2的酵母的脂肪酸组成与对照株相比，虽然油酸的比例略有增加，但基本没有差别。此外，导入LPAAT1的酵母的脂肪酸组成，棕榈酸的比例相对于对照株升高，而另一方面，棕榈油酸含量的比例减少。因此，棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率相对于对照株降低。硬脂酸及油酸的比例与对照株为同等程度。另夕卜，导入LPAAT3或LPMT4的酵母中，油酸的比例与对照株相比上升10%以上，而棕榈油酸、棕榈酸的比例均减少。棕榈油酸与棕榈酸之比，相对于对照株升高。以上结果表明，来自高山被孢霉(M.alpina)的4个LPAAT同源物，因为其底物酰基的特异性不同，所以导入这些基因的酵母中各同源物的脂肪酸组成不同。并且表明，通过将上述同源物适时分开使用，能够育种目的脂肪酸组成的生物。实施例8花生四烯酸生产酵母中的表达分析(1)花生四烯酸生产酵母的育种为了育种花生四烯酸生产酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，构建以下质粒。首先，将从高山被孢霉(M.alpina)IS-4株中制备的cDNA作为模板，使用△12-f和△12-r、△6-f和△6_r、GLEL0-f和GLELO-r或△5-f和△5-r的引物组合，使用ExTaq进行PCR，扩增高山被孢霉(M.alpina)IS-4株的A12脂肪酸去饱和化酶基因、A6脂肪酸去饱和化酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因以及A5脂肪酸去饱和化基因。△12-f:TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列号24)△12-r:AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号25)A6-f:TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列号26)△6-r:AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号27)GLELO-f:TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列号28)GLELO-r:GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号29)△5_f:TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列号30)△5-r:AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号31)将这些通过T0P0-TA-cloningKit进行克隆。确认碱基序列，将含有序列号3235的碱基序列的克隆，分别作为质粒pCR-MAA12DS(含有序列号32的碱基序列)、pCR-MA△6DS(含有序列号33的碱基序列)、pCR-MAGLELO(含有序列号34的碱基序列)、pCR-MA△5DS(含有序列号35的碱基序列)。另一方面，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276号公报)后获得的约1.2kb的DNA片段，插入用限制性内切酶EcoRI和Sphl酶切载体pUC18后进行末端平滑化，通过自我连接作用获得的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5'端的克隆作为pUC-URA3。并且，将用限制性内切酶Sail和Xhol酶切YEpl3获得的约2.2kb的DNA片段插入载体pUC18的Sail位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5'端的克隆作为pUC-LEU2。接着，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MA△12DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶Xbal酶切获得的约1.2kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)并且进行末端平滑化后，用限制性内切酶Spel酶切后的约6.6kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-A12。将用限制性内切酶Xbal酶切质粒pCR-MAA6DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切获得的约1.6kbp的DNA片段，与用限制性内切酶Sail酶切质粒pESC-U-A12并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后的约8kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-A12:A6。将其用限制性内切酶Pvul工部分酶切获得的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的Smal位点，获得质粒pUC-URA-A12:A6。此外，将用限制性内切酶Xbal和Sacl酶切质粒pCR-MAGLEL0获得的约0.95kbp的DNA片段，与用限制性内切酶Xbal和Sacl酶切载体pESOLEU(STRATAGENE)获得的约7.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLEL0。将用限制性内切酶Xbal酶切质粒pCR-MAA5DS并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切获得的约1.3kbp的DNA片段，与用限制性内切酶Apal酶切质粒pESC-L-GLELO并且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后获得的约8.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLEL0:八5。将其用限制性内切酶PvuII酶切获得的约3.2kb片段插入pUC-LEU2的Smal位点，获得质粒pUC-LEU-GLEL0:A5。将SaccharomycescerevisiaeYPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-A12:A6和质粒pUC-LEU-GLEL0:A5进行共转化。转化株选择在SC-Leu，Ura(每l升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸；3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2。/。琼脂)上生长发育的菌株。将这样获得的菌株中的任意一株作为ARA3-1株。(2)花生四烯酸生产酵母的转化株的获得与分析将ARA3-1株用质粒pYE22m、pYE-MALPAAT3、pYE-MALPAAT4分别转化。转化株选择在SC-Trp，Leu，Ura(每l升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸；3g、组氨酸0.6g、赖氨酸Q.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2%琼脂)上生长发育的菌株。将这样获得的任意菌株分别作为ARA-C、ARA-LPAAT3、ARA-LPAAT4。将这些菌株在上述SC-Trp，Leu，Ura液体培养基10ml中30°C、培养1天，取其中lml在SG-Trp，Leu，Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)为6.7g、半乳糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氮酸;3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)液体培养基10ml中3(TC、培养2天，进行菌体的脂肪酸分析。菌体的脂肪酸组成如表5所示，菌体内的脂肪酸含有率如表6所示，菌体的花生四烯酸含有率如表7所示。表5转化株的脂肪酸组成试样名ARA-GARA-LPAAT3ARA-LPAAT416:029.8530.0727.3216:126,8826.8229.8118:010.2310.399.7618:113.2613.10R2418:1n-70.740.720.6618:28.068.179,2218:3(n-6)0.280.250.25DGLA0.400.380.33AA0.160.160.20other10.149.938.20total100.00100.00■00表6转化株的菌体内脂肪酸含有率试样名ARA-CARA-LPAAT3ARA-LPAAT4菌体内脂肪酸含有率(％)5.586.305.50表7转化株的菌体内花生四烯酸含有率试祥名ARA-CARA—LPAAT3ARA-LPAAT4yg/g89.4111.4101.0ARA-LPAAT4株，作为饱和脂肪酸的棕榈酸和硬脂酸的比率降低，亚油酸、花生四烯酸的比率增高。另一方面，ARA-LPAAT3的脂肪酸组成与对照株相比没有变化，但菌体内脂肪酸含有率增加。也就是说，LPAAT3已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率和LPAAT4已表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率，均比对照细胞内的花生四烯酸含有率高。此外，将这些质粒导入株各取4株在上述SC-Trp，Leu，Ura液体培养基10ml中30°C、培养1天，取其中lml接种到SG-Trp，Leu，Ura液体培养基10ml中，15°C、培养7天，进行菌体的脂肪酸分析。菌体的脂肪酸组成如表8所示，菌体内的脂肪酸含有率如表9所示，菌体内的花生四烯酸含有率如表IO所示。表8转化株的菌体内PUFA含有率菌体内PUFA占总脂肪酸的比率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在花生四烯酸生产酵母中使来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT3表达时，与对照相比较，亚油酸、Y-亚麻酸、DGLA、花生四烯酸等PUFA的比率增高。并且，菌体内的脂肪酸含有率增高。另一方面，使来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT4表达时，亚油酸、Y-亚麻酸的比率增高，花生四烯酸的比率也增高。实施例9(1)高山被孢霉(M.alpina)表达用载体的构建作为高山被孢霉(M.alpina)表达用载体，使用从GAPDH启动子开始^f吏目的基因表达的pDuraSC和从组蛋白启动子开始使目的基因表达的pDuraMCS。为了使LPAAT3及LPAAT4在高山被孢霉(M.alpina)中表达，按以下所述构建载体。用限制性内切酶EcoRI酶切质粒pCR-LPMT3或质粒pCR-LPAAT4，切出插入部分，插入载体pDuraSC或载体pDura5MCS的多克隆位点的EcoRI位点。确认插入的DNA的方向，将从各载体的启动子开始按0RF可转录的方向插入的部分，分别作为质粒pDuraSOLPMT3、质粒pDuraSC-LPAAT4、质粒pDura5MCS-LPAAT3、质粒pDura5MCS-LPAAT4。(2)高山被孢霉(M.alpina)转化株的获得使用这些质粒，通过高山被孢霉(M.alpina)，将根据专利文献(W02005/019437"脂质生产菌的育种方法")中记载的方法诱导的尿嘧啶缺陷型株Aura-3作为宿主，利用粒子轰击法进行转化。选择转化株时，使用SC琼脂培养基(无氨基酸酵母氮源(YeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate)(Difco)O.5%、硫酸铵0.17%、葡萄糖2%、腺嘌呤0.002%、酪氨酸0.003%、蛋氨酸0.0001%、精氨酸0.0002%、组氨酸0.0002%、赖氨酸0.0004%、色氨酸0.0004%、苏氨酸0.0005%、异亮氨酸0.0006%、亮氨酸0.0006。/。、苯丙氨酸0.0006%、琼脂2%)。(3)转化高山被孢霉(M.alpina)的评价将获得的转化株，接种到GY培养基(葡萄糖2。/。、酵母膏iy。)4ml中，2『C下振荡培养3天或4夭。通过过滤回收菌体，使用RNeasyplantkit(QIAGEN)提取RNA。通过SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemfor'RT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。为了确认导入的构建物中的各基因的表达、总的各基因的表达，用以下引物的组合进行RT-PCR。〇质粒pDuraSC-LPAAT3导入株导入构建物中表达所用的引物引物MaGAPDHpfw:CACACCACACATTCAACATC(序列号47)引物LAT3-2R:GAATCGTAGATATGGTTGTATCCAGCGCT(序列号48)总LPAAT3表达所用的引物引物LAT3-1F:CTGGCGGTCATCCTTGTTTTCTACCTG(序列号49)和引物LAT3-2R(序列号48)〇质粒pDuraSC-LPAAT4导入株导入构建物中表达所用的引物引物MaGAPDHpfw(序列号47)引物LAT4-2R:GAATCATAGATGTGTGAGTATCCTTGCGA(序列号50)总LPAAT4表达所用的引物引物LAT4-1F:TTCTAATCCTGTCCTACTGGCAGCG(序列号51)引物LAT4-2R(序列号50)〇质粒pDura5MCS-LPAAT3导入株导入构建物中表达所用的引物弓I物PD4P:CGCATCCCGCAAACACACAC(序列号52)引物LAT3-2R(序列号48)总LPAAT3表达所用的引物引物LAT3-1F(序列号49)和引物LAT3-2R(序列号48)〇质粒pDura5MCS-LPAAT4导入株导入构建物中表达所用的引物引物PD4P(序列号52)和引物LAT4-2R(序列号50)总LPAAT4表达所用的引物引物LAT4-1F(序列号51)和引物LAT4-2R(序列号50)根据上述RT-PCR的结果，作为各基因在导入构建物中的表达及总表达高的菌株，从质粒pDuraSOLPAAT3导入株中筛选出Gp-LPAAT3-3株、Gp-LPAAT3-29株，从质粒pDuraSC-LPAAT4导入株中筛选出Gp-LPAAT4-26株和Gp-LPAAT4-68株，从质粒pDura5MCS-LPAAT3导入株中筛选出Hp-LPAAT3-34株，从质粒pDura5MCS-LPAAT4导入株中筛选出Hp-LPAAT4-26株和Hp-LPAAT4-31株。将这些菌株在GY培养基4ml中，28°C下125rpm振荡培养3天或4天(各n=3)。培养结束后，通过过滤回收菌体，进行冷冻干燥。取出一部分(约1020mg左右)干燥菌体，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。菌体内的脂肪酸含有率和每单位培养基的花生四烯酸生产量总结于下表中。表llLPAAT3高表达M.alpina的菌体内脂肪酸含有率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表14LPAAT4高表达M.alpina的ARA生产量(g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>这些结果表明，试验的全部高山被孢霉(M.alpina)转化株，菌体内的脂肪酸含有率和每单位培养基的花生四烯酸生产量均比对照高。权利要求1.核酸，其含有以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列，(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(c)碱基序列，其由与序列号36或序列号37所组成的碱基序列有67％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(d)碱基序列，其编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有69％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(e)碱基序列，其与由编码序列号2或4表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交、且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质。2.如权利要求l所述的核酸，其含有以下(a)(c)中任一项的碱基序列，(a)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列中110个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，，(b)碱基序列，其与由序列号36或序列号37所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、5(TC的条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质，(c)碱基序列，其编码与由序列号2或序列号4组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质。3.核酸，其含有以下(a)(c)中任一项所述的碱基序列或其片段，(a)碱基序列，其由序列号36或序列号37表示，(b)碱基序列，其编码由序列号2或4表示的氨基酸序列组成的蛋白质，(C)碱基序列，其由序列号1或3表示。4.蛋白质，其为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，(a)蛋白质，其由序列号2或4中l个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性，(b)蛋白质，其为由与序列号2或序列号4所组成的氨基酸序列有69%以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性。5.蛋白质，其由序列号2或4表示的氨基酸序列组成。6.重组载体，其含有权利要求13中任一项所述的核酸。7.转化体，其为被权利要求6所述的重组载体转化的转化体。8.脂肪酸组合物，其为培养权利要求7所述的转化体而获得的脂肪酸组合物，其特征在于，所述脂肪酸组合物中花生四烯酸的含有率，比培养未用权利要求6所述的重组载体转化的宿主而获得的培养物高。9.脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养权利要求7所述的转化体而获得的培养物中提取权利要求8所述的脂肪酸组合物。10.食品，其含有权利要求8所述的脂肪酸组合物。全文摘要提供新型溶血磷脂酸酰基转移酶基因。其为含有序列号1、3、36或37表示的碱基序列或其片段的核酸。文档编号C12N15/09GK101541963SQ20088000024公开日2009年9月23日申请日期2008年5月23日优先权日2007年5月25日发明者得田久敬,落合美佐申请人:三得利株式会社