乙酰氧基酮的微生物还原的制作方法

专利名称：：乙酰氧基酮的微生物还原的制作方法乙酰氧基酮的微生物还原本发明涉及制备式I的2-氨基-[5-(l-羟基-2-羟基或卤代-乙基)]-吡嗪衍生物的方法，其中R是低级垸基羰基或氨基保护基并且R1是羟基或卤素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不对称还原，其中W是低级烷基羰基氧基或卤素。该方法在对映体纯的(S)-N-[5-(1,2-二羟基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺的制备中特别有用。该化合物是作为葡糖激酶激活剂的式III的2-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-(l,2-二羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺的中间体，所述式III化合物可用于治疗和/或预防II型糖尿病式III化合物公开于PCT国际专利申请WO2004/052869Al中。在合成式III化合物中使用的关键砌块之一是式Ia的对映体纯的2-氨基-[5-(l,2-二羟基-乙基)]-吡嗪衍生物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R是低级垸基羰基或氨基保护基。为了制备活性药物成分(APIs)，绝对必需使用异构体纯的砌块和/或高度立体选择性的程序，因为APIs中的副组分可能不利地影响疾病的治疗。因此，所有APIs都要求高纯度。旋光活性的1，2-二醇是通用的合成中间体并且难以以对映体纯的形式获得。WO2004/052869Al中描述的用于制备(S)-N-[5-(l,2-二羟基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺的方法包括，在包含四氧化锇的反应中Sharpless氧化相应的乙烯基吡嗪前体(参见方案1)。该反应由于四氧化锇催化剂的毒性而不能在多-kg规模上进行。因此，需要解决的问题是找到一种不含有毒试剂并且能够在大的工业规模上进行的合适的工艺备选方案。鲜有报道在单个步骤中将垸氧基酮微生物水解/还原成相应的二醇的文献实例。G.Egri等，r"ra/z^ra"y^ymme^y1998,义277-2S3，描述了一系列l-乙酰氧基-3-芳氧基丙-2-酮通过面包酵母的生物转化。所测试的13种酮中只有2种在没有形成中间体一乙酸酯的情况下被直接转化成二醇。6大多数情况下看到的是一乙酸酯和二醇的混合物，对于制备式I化合物的方法而言，这是不合需要的。另外，这些反应仅是以0.5g的规模在0.25%w/w的底物浓度下进行的；远低于用于制备式I化合物的规模和底物浓度。T.Kometani等，《/说c^c/e"ce.所oe"g.2001,P/'525-527，描述了通过使用面包酵母还原l-乙酰氧基-2-丙酮而制备(S)-l,2-丙二醇。尽管向二醇的转化是在1。/。w/v底物浓度完成的，ee为88。/。。该值只能通过抑制乙酰氧基酮的水解而提高。Z-LWei等，MW"力a/C7zem&^y2000,S,"29-/737，描述了由相应的2-乙酰氧基-l-芳基乙酮制备S-二醇，但是同样选择性较低并且在大多数情况下存在一乙酸酯。通过微生物还原/水解反应形成的(S)-二醇的ee是关键值，因为它影响API的最终收率。在根据本发明制备的API的情形中，随后的酮缩醇化和结晶步骤导致对映体过量增加到>99%。除了所述的烷氧基酮的水解/还原的微生物生物转化外，可以应用的仅是必需分离的生物催化剂-酶(例如水解酶、酮还原酶、葡糖脱氢酶)-以一罐法。采用分离的酮还原酶的不对称还原与使用葡糖脱氢酶和酯部分的酶促水解的酶促辅因子循环的组合是本领域的现状。S.Kambourakis等，7^ra/2^/ra"v4矽mwe/72005,M,j(5卵，描述了使用不同酮还原酶的2-羟基-l-苯基-乙酮的还原。采用两种以上的酶类型的酶促转化经常是成功的，如V.Kren等，C/zem.￡d1995,340」，卵3中所述。因此，乙酰氧基酮转化成羟基酮的上游酶促水解和此原位产生羟基酮的下游还原模拟了可能的微生物-水解/还原-生物转化。使用孤立的酶的多酶促反应具有以下一些优点，如i)可以使用标准的设备；ii)高反应速率，iii)与整个细胞体系相比无副活性，iv)简单的反应控制以及v)由于所产生的(S)-二醇的更高ee，在随后的酮縮醇化反应中有更高的收率。2-氨基-[5-(乙酰基)]-吡嗪衍生物的末端位置可以具有不同的取代基，其在酮部分的不对称还原后可转换成羟基官能团。对于卤素取代基，或更具体地，氯取代基，即一种潜在选择物，在以下文献中描述了不同芳基酮的几种生物催化的不对称还原L.Hua等，Ogam'cc&说bwo/ecw/"rC/zem&^y2006,4,2仰0-2砂5和L.Hua等r"ra/2edrawj^mme^y2005,W75-W7S。据描述，由芳香族氯化醇开始的对映体纯1，2-二醇的合成是，经由T.Ikamiya等，T^ra/z^/ra"2004,<5化74〃-7W7中的相应的对映体纯环氧化物，和随后的环氧化物水解，所述环氧化物水解或者经由生物催化的水解，如Z.Li等，rdraW應勿画勿2006,77,仏52中所述，或者具有使用金属催化的水解，如G-J.Kim等，re/ra/z^ra"2005,W,22^-2266中所述。采用根据本发明的生物转化方法，己经发现了制备对映体纯的2-氨基-[5-(1，2-二羟基-乙基)]-吡嗪衍生物的一个有效程序。除非另外指出，以下的定义用于举例说明和限定本文中用于描述本发明的各种术语的含意和范围。在本说明书中，术语"低级"用于表示由1-6个、优选l-4个碳原子组成的基团。术语"卤素"是指氟和氯，优选氯。单独的或与其他基团组合的术语"垸基"是指1-20个碳原子、优选1-16个碳原子、更优选l-10个碳原子的支链或直链一价饱和脂肪族烃基。单独的或与其他基团组合的术语"低级垸基"或"CrC6-烷基"是指1-6个碳原子、优选l-4个碳原子的支链或直链一价垸基。该术语进一步示例为以下基团如甲基，乙基，正-丙基，异丙基，正-丁基，仲-丁基，异丁基,叔丁基，正-戊基,3-甲基丁基，正-己基，2-乙基丁基等。优选的低级垸基残基是甲基，乙基和叔丁基，其中特别优选叔丁基。术语"低级烷基羰基"是指基团-C(0)-R，，其中R，是l-6个碳原子、优选l-4个碳原子的支链或直链一价垸基。优选的"低级垸基羰基"或"CrCV烷基羰基"基团是乙酰基，丙酰基，丁酰基，新戊酰基，戊酰基和己酰基。更优选乙酰基和新戊酰基(叔丁基羰基)，最优选叔丁基羰基。此处使用的术语"氨基保护基"是指通常用于在化合物上的其他官能团反应时封闭或保护氨基官能团的取代基。合适的氨基保护基选自甲酰基，苄基，酯基如苄氧羰基("Cbz"),9-芴基甲氧羰基("FMOC"),叔丁氧羰基("BOC")和烯丙氧羰基，以及芳基磺酰基衍生物如对-甲苯磺酰基，苄磺酰基和苯磺酰基。氨基保护基的选择和使用(添加和随后的去除)是本领域技术人员熟知的。上述术语所指基团的更多实例描述于T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,3fedition,JohnWileyandSons,NewYork,NY,1999。优选的氨基保护基是BOC。术语"低级垸基羰基氧基"是指基团-O-C(O)-R"，其中R"是1-6个碳原子、优选1-4个碳原子的直链一价烷基。优选的"低级烷基羰基氧基"或"CVC6-垸基羰基氧基"基团是乙酰氧基，丙酰氧氧基，丁酰氧基，戊酰氧基和己酰氧基。特别优选的"低级垸基羰基氧基"是乙酰氧基。术语"对映体纯"是指组合物中单个对映体占至少90%、优选约95%-100%、更优选98%-100%、最优选99%-100%这样的组成。此处使用的术语"对映体过量"(简称"ee")，定义为[F(+)-F(-)]，其中F(+)指(+)-对映体的摩尔或重量分数并且F(-)指(-)-对映体的摩尔或重量分数。相应地，术语"对映体过量百分比"或"。/。ee"定义为100x[F(+)-F(-)]。备选地，可以将对映体过量百分比计算为100x([R]-[S]/[R]+[S])。本发明涉及一种用于制备式I化合物的方法，其中R是低级烷基羰基或氨基保护基并且R1是羟基或卤素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不对称还原，其中W是低级烷基羰基氧基或卤素。在本发明优选的实施方案中，所述方法的特征在于，R'是羟基并且W是乙酰氧基，即获得式Ia化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R是低级烷基羰基或氨基保护基。在本发明的一个实施方案中，所述方法的特征在于，酶促水解和酶促不对称还原是采用近平滑假丝酵母(Ca"&^para;^7a^)种的酵母一起进行的。因此，本发明涉及用于制备式&的2-氨基-[5-(1，2-二羟基-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低级垸基羰基或氨基保护基，所述方法包括式IIa的酮化合物的釆用近平滑假丝酵母种酵母的酶促水解和酶促不对称还原通过使用酵母近平滑假丝酵母菌株，由处于技术上相关的底物浓度的相应乙酰氧基酮IIa的水解和不对称还原，制备所需的产物Ia。该方法可以在不添加水解酶如脂酶的情况下进行，因为该菌株可以同时催化水解和不对称还原。详细地，本发明涉及可放大的生物催化法，其包括式IIa化合物的使用酵母近平滑假丝酵母的水解和不对称微生物还原，以获得式Ia的对映体纯的(S)-二醇，所述方法包括以下步骤a)将近平滑假丝酵母培养物在含有富有营养的培养基的烧瓶或发酵罐中于27-30。C生长1-2天，所述培养基中包括酵母提取物(1%w/v)，大豆胨(1%w/v)，含氮酵母碱基(0.67%w/v)和葡萄糖(2。/。w/v);b)在接种后16-20h加入NH40H，以将pH维持在6.5-7.0范围内，并且供给相当于3-5%(v/v)/24h的乙醇，以提供用于生长和用于不对称还原的还原等价物；c)再过2-4小时后，向发酵液中以在875ml水中的悬浮液形式加入175g的式IIa的乙酰氧基酮底物，以得到1-5%(w/v)的最终浓度；d)在2-5天内将式IIa的乙酰氧基酮水解和还原成相应的(S)-二醇；e)通过分离生物质(离心)离析出(S)-二醇，接着将(S)-二醇用乙酸乙酯萃取(用2体积当量萃取3次)并且浓缩。该反应还必须进行完全，§卩，所有的底物必须在5M(w/v)的底物浓度被转化，这显著高于在文献实例中所引用的浓度。通过用近平滑假丝酵母将式IIa的乙酰氧基酮生物转化，获得ee在91.4。/。-95.6。/。范围内的对映体纯的(S)-二醇。如此处所使用的，近平滑假丝酵母是在Roche分离的菌株并且根据Budapest条约在2007年3月9日存放在DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany),保藏登记号为DSM19155。几种其他的近平滑假丝酵母菌珠也催化以92-95%的ee得到(S)-二醇的所述生物转化，表明可潜在地使用任何近平滑假丝酵母菌株。另外，可以使用酵母乳酒假丝(Ca"fife/aA:e7^r),可克斯克塞维酵母(尺/w少verom少ces附anc/(3"ws)禾口真菌可可花瘿病菌(Ga7o"ecW"ia'gWz^cM/(2)的菌珠。在优选的实施方案中，本发明涉及可放大的生物催化法，其包括乙酸2-[5-(2，2-二甲基-丙酰基(propioyl)氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酉旨(式IIa的化合物，其中R是叔丁基羰基)的不对称微生物还原，和使用酵母近平滑假丝酵母的水解，以获得对映体纯的(8)-^[5-(1，2-二羟基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺。在本发明进一步的实施方案中，该方法的特征在于，酶促水解是通过选自酯酶、蛋白酶或脂酶的水解酶(EC3丄1)进行的并且随后的酶促不对称还原是通过一种或多种氧化还原酶(ECl丄l)进行的。因此，本发明还涉及用于制备式Ia的2-氨基-[5-(l,2-二羟基-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低级烷基羰基或氨基保护基，该方法包括式IIa的酮化合物的通过选自水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶的酶的酶促水解和通过一种或多种氧化还原酶的酶促不对称还原，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>优选地，酶促水解是通过脂酶进行的。更优选脂酶获自南极假丝酵母(Cawo^flJwtorc"ca),产碱杆菌属中的禾中"/co/z'ge"esw.)或洋葱伯克霍尔德氏菌(5wrA:/zoWer/ace/QC〖")。在优选的实施方案中，使用酮还原酶或醇脱氢酶作为酶促不对称还原中的氧化还原酶。多酶促生物转化是以一罐式反应方式转化的。水解-脱乙酰基化-是通过使水解酶与悬浮在两相反应介质中的式IIa的乙酰氧基酮接触而进行的。还原是通过使氧化还原酶与原位形成的(x-羟基酮接触而进行的。由于原位形成的a-羟基酮的低稳定性，还原酶的应用活性必须超过水解酶的应用活性。所需的还原当量是以催化量应用的并且原位循环。预期的式Ia产物是在工业反应条件下制备的。在优选的实施方案中，本发明涉及可放大的生物催化方法，该方法包括通过选自水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶的酶的乙酸2-[5-(2,2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(式IIa的化合物，其中R是叔丁基羰基)的水解，和通过一种或多种氧化还原酶的酶促不对称还原，以获得对映体纯的(S)-N-[5-(l,2-二羟基-乙基)-吡嗪基]-2，2-二甲基-丙酰胺。RH-N、乂N、N。JOCH。方案2H、UOOH第一步，通过乙酰氧基酮(5)脱乙酰基化的羟基酮(6)的原位生成是采用水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶进行的，优选采用脂酶；还更优选釆用来自南极假丝酵母的脂酶[例如CALBL(Novozyme)]，采用来自产碱杆菌属的种的脂酶[例如QLM(MeitoSangyo)]，采用来自洋葱伯克霍尔德氏菌的脂酶(脂酶PS)及其突变脂酶AH。后续的不对称还原是采用氧化还原酶进行的，优选采用酮还原酶或醇脱氢酶，更优选采用酮还原酶KRED101,107,111,112,113禾P114,A1F,B1D和B1E[BioCatalytics]。所需的还原当量可以采用所有现有技术的方法在原位循环；优选采用酶；更优选采用葡糖脱氢酶GDH102[BioCatalytics]。合适的缓冲剂是生化领域中普遍使用的常规缓冲剂，其在pH5-8、优选pH6-7范围内。在反应进程中，通过加入碱，优选NaOH或KOH溶液，将反应混合物的pH在选择的值保持恒定。中和形成的乙酸需要一个当量，中和形成的葡糖酸需要更多的当量。在KRED101，脂酶AH和GDH102的酶组合的情况下，在非极性有机溶剂如正-庚垸或叔丁基甲基醚(TBME)(例如20%v/v)和D-葡萄糖(例如0.5M)存在下使用2-(4-吗啉基)-乙磺酸缓冲齐!」(例如pH6.25)正向影响总的反应性。反应温度可以在25-45°C、优选30-40°C范围内。底物浓度可以在1-20%(w/w)范围内，优选5%(w/w)。原位形成的羟基酮(6)的低稳定性要求催化还原活性超过脱乙酰基化活性。羟基酮(6)的原位浓度必须足够高，以使其不对称还原的周转率高。酮还原酶显示出对乙酰氧基酮(5)直接还原明显较低的活性，以及对于生成的乙酰氧基醇-二醇(7)的潜在中间体，明显较低的对映体纯度。该方法条件必须抑制乙酰氧基酮(5)的直接还原，或通过触发其原位浓度提高原位形成的羟基酮(6)的不对称还原的高周转率，以维持对映体纯的0S)-二醇(7)。在另一实施方案中，本发明涉及用于制备式Ib的2-酰氨基-[5-(l-羟基-2-卤代-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低级烷基羰基或氨基保护基并且R1是卤素，该方法包括式lib的酮的酶促不对称还原，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中W是卤素。优选R和R2是氯。优选地，酶促不对称还原是通过一种或多种氧化还原酶进行的。更优选使用酮还原酶或醇脱氢酶作为氧化还原酶。在优选的实施方案中，本发明涉及N-[5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪基]-2，2-二甲基-丙酰胺(4)至(5)-N-[5-(2-氯-l-羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(5)的酶促还原。该不对称还原是通过使氧化还原酶与氯酮(8)接触而进行的。所需的还原当量是以催化量应用的并且原位还原。优选的氧化还原酶是酮还原酶或醇脱氢酶，更优选酮还原酶KRED101,KRED111，KRED112,KRED113和KRED114[BioCatalytics]。所需的还原当量可以通过常规方法原位循环；优选采用酶；更优选采用葡糖脱氢酶GDH102[BioCatalytics]。'合适的缓冲剂是生化领域中普遍使用的常规缓冲剂，其在pH5-8、优选pH6-7范围内。在反应进程中，通过加入碱，优选NaOH或KOH溶液，将反应混合物的pH在选择的值保持恒定。中和形成的葡糖酸需要一在KRED101和GDH102的酶组合的情况下，在D-葡萄糖(例如0.06M)存在下、在更高的底物浓度使用磷酸钾缓冲剂(例如pH6.5)和更高D-葡萄糖浓度的加入正向影响总的反应性。反应温度可以在25-45°C、优选30-35°C范围内。底物浓度可以在0.1-10%(w/w)范围内，优选5%(w/w)，更优选0.5%(w/w)。有利地，氯酮(8)向对映体纯的(5>>^-[5-(2-氯-1-羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(Ic)的不对称还原不需要第三种水解酶(例如脂酶)并且不原位产生潜在的不稳定中间体。绝对构型是由晶体结构确定的。随后，必须通过氯对羟基的亲核取代将对映体氯化的醇(Ic)转化成所需的对映体纯的(S)-二醇(7)。如上己经描述的，R优选是叔丁基羰基，即此前定义的方法优选是由其中R是叔丁基羰基的式II化合物开始而进行的。因此，在另一实施方案中，本发明涉及新的式IIc的化合物其中112是低级院基羰基氧基或卤素。式IIc化合物的制备可以根据下面的方案4和5进行。在步骤1中，将2-氨基-5-溴代吡嗪(l)的氨基在二氯甲垸中用三甲基乙酰氯(新戊酰氯；PivCl)保护，以卯％收率得到酰胺7。钯催化的酰胺2的羰甲氧基化(步骤2)是在4:1的二甲基甲酰胺:甲醇混合溶剂中、在500psi的一氧化碳下、在帕尔反应器中进行的，以84%收率得到甲酯9。在步骤3中，甲酯9与通过用双(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)处理由乙酸叔丁酯生成的烯醇的克莱森縮合，产生酮酯10。在萃取后处理和溶剂交换后，将得到的10的乙醇溶液在催化量的溴化锂存在下用N-溴琥珀酰亚胺(NBS)处理，从9以95%的总收率得到溴化物11。用在二氯甲垸中的三氟乙酸(TFA)处理11，以97%的收率得到oi-溴酮IId(步骤5)，在室温搅拌40h后完成脱羧基。通过在室温与在DMF中的乙酸钠的取代反应，将a-溴酮IId转化成乙酰氧基酮lie(步骤6)。在从乙酸乙酯/庚垸结晶后，以卯M的收率获得乙酰氧基酮IIe。随后，发现，通过加入水，IIe可以直接从反应混合物中沉淀出来。万案4步骤lPivCl吡啶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>步骤2CO催化剂PdCI2(PPh3)2Et3N4:1DMF:MeOHN-[5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(IIf)可以由甲酯9通过与溴氯甲垸反应和用丁基锂活化而直接获得(参见方案5)。、C02Me步骤3LHMDStBuOAcTHF10步骤4NBS催化剂L旧r丁酮11步骤6NaOAcAcOH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>万;在另一实施方案中，本发明涉及新的式Ic的化合物，CH，H3CH。CHN、乂NO、、Zlc、ClOH在再一实施方案中，本发明提供用于制备式ni化合物的方法，H。CIII该方法包括根据权利要求1-11的方法，接着是a)式Ia的二醇la、OHOH其中R是低级烷基羰基或氨基保护基，与2,2-二甲氧基丙烷反应以形成縮醛，并且在碱性条件下将胺脱保护以获得式IV的化合物，▽、oIVoCH，b)式IV的胺与式V的羧酸或其活化衍生物缩合17获得所述的胺；和C)在酸性条件下水解所述缩醛。发现2R-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-(lS,2-二羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(式III的化合物)是有效的葡糖激酶激活剂。激活GK从而提高GK传感系统的灵敏度的化合物，在所有II型糖尿病的高血糖特征的治疗中是有用的。葡糖激酶激活剂将增加P-细胞和肝细胞中葡萄糖代谢的通量，这将与增加的胰岛素分泌联系在一起。因此这样的试剂可用于治疗II型糖尿病和其他代谢疾病。在步骤a)中，1，2-二醇基团以环状缩醛形式被保护。1,2-二醇与二甲氧基丙烷的反应提供l，3-二氧戊环。优选地，反应在酸催化剂如对甲苯磺酸(PTSA)或樟脑磺酸(CSA)的存在下进行。缩醛对除质子酸如乙酸水溶液，三氟乙酸水溶液和盐酸以及路易斯酸外的大多数反应条件是稳定的。因此缩醛将不被用于随后的胺脱保护的碱如碳酸钾攻击。对于步骤b)中的缩合，可以采用式V羧酸的活化衍生物，例如其可以是通过本领域技术人员己知的方法制备的保护的酯或酰氯。优选地，可以使用式V酸的酰氯，并且在碱如吡啶或氨基吡嗪的存在下进行偶合。酰氯可以通过式V化合物与草酰氯或亚硫酰二氯在合适的溶剂如二氯甲烷中.的反应而制备。在步骤c)中，将縮醛保护基在酸性条件下，例如通过使用盐酸而解离，以获得式III的1,2-二醇。在下面的方案6中，举例说明了由式Ia化合物开始制备式III化合物的方法，所述式Ia化合物是通过此前定义的酶促方法制备的。方案6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>以下实施例用于举例说明本发明而不限制本发明。实施例实施例1乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯的制备步骤l:N-(5-溴-吡嗪-2-基)-2,2-二甲基丙酰胺(2)的制备将配备有磁力搅拌器、温度计、冷凝器和氮气入口/出口的3-颈lL圆底烧瓶装入50.00g(287.4mmol)的2-氨基-5-溴吡嗪(1),218mL的二氯甲烷和30.50mL(377.1mmol)的吡啶。然后，在5min内滴加39.30mL(319.1mmol)的三甲基乙酰氯(PivCl)。随之发生放热，使混合物温度从22。C升高到44。C。在约40。C搅拌2h后，HPLC分析显示反应完全。将反应混合物用200mL乙醇稀释，然后通过在大气压下蒸馏而浓縮。在收集240mL馏出物并且混合物温度达到68。C后，缓慢加入100mL水，同时将混合物温度保持在约68。C。加入完成后，使得到的悬浮液冷却到室温并且搅拌过夜。通过过滤收集固体，用100mL的乙醇:水l:l洗涤，并且通过抽吸干燥，得到67.08g(90.4。/。收率)的标题化合物，为浅米色固体；由HPLC分析确定的纯度为98.21%(HPLC柱ZorbaxEclipseXDB-C8，4.6x50mm,1.8,,洗脱液5-100%乙腈/水+01.%TFA，以1mL/min洗脱5min，在UV250nm检测，停留时间4.22min)。步骤2:5-(2,2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2羧酸甲酯(9)的制备将300mL帕尔反应器装入15.00g(58.11mmol)在步骤1中制备的化合物，16.80mL(414.8mmol)的甲醇，67.20mL的二甲基甲酰胺(DMF),61.20mg(0.0872mmol)的氯化双(三苯膦)钯和8.900mL(63.92mmol)的三乙胺。将反应器用氮气吹扫2次(通过将其加压，接着通风至大气压)，然后用一氧化碳吹扫2次。将混合物加热到92。C，同时在500rpm搅拌，然后用CO加压至500psi，历时18h。HPLC分析显示反应完全。在冷却到65。C后，将反应器减压并且将内容物转移到500mL圆底烧瓶中。用30mL的DMF冲洗反应器，并且将冲洗液也转移到烧瓶中。然后，加入80mL的水。在冷却到室温后，将得到的固体通过过滤收集，用50mL的DMF:水1:1和50mL的水洗涤，并且通过抽吸干燥，得到11.56g(83.8%收率)的标题化合物，为浅米色固体；由HPLC分析确定的纯度为100%(条件与步骤i中相同，停留时间3.46min)。20步骤3:3-[5-(2,2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸-叔丁酯(10)的制备将配备有磁力搅拌器，加料漏斗，热电偶探头和氮气入口/出口的3-颈l-L圆底烧瓶装入25.00mL(185.5mmol)的乙酸叔丁酯，20.00g(84.30mmol)在步骤2中制备的化合物和20mL的THF。在冷却到-20。C后，滴加261.4mL(261.4mmol)的l.OM双(三甲基甲硅垸基)氨基化锂(LHMDS)的THF溶液，同时将反应混合物的温度保持在-20。C和0。C之间。将得到的红色溶液在-20。C搅拌40min。HPLC分析显示反应完全。将混合物温热到0。C，然后通过加入预冷的200mL(260.3mmol)的25wt。/。柠檬酸溶液猝灭。将有机层分离，用2x200mL的饱和氯化钠溶液洗涤并且在30°C/60mmHg浓縮至约50mL的体积。将浓缩的溶液用200mL丁酮稀释并再次在30。C/60mmHg浓縮至约50mL。将浓縮物再次用200mL丁酮稀释并且在30°C/60mmHg浓缩至约100mL的体积。NMR分析显示不存在THF。将得到的标题化合物的丁酮溶液直接用于下一步骤。步骤4:2-溴-3-[5-(2，2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸叔丁酯(11)的制备将配备有磁力搅拌器的l-L圆底烧瓶装入73.00mg(0.841mmol)的溴化锂和在步骤3中获得的丁酮溶液(约100mL)，其在理论上含有27.09g(84.30mmol)的3-[5-(2，2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸-叔丁酯和约73mL的丁酮。在通过HPLC仔细监测反应的情况下，向得到的混合物分批加入总量为15.16g(85.17mmol)的N-溴琥珀酰亚胺。在室温搅拌1h后，HPLC分析显示反应完全。将反应混合物在25°C/25mmHg浓縮至约70mL的体积，然后用130mL乙酸乙酯稀释并且用3x100mL的水洗涤。在35。C/60mmHg浓缩至约90mL的体积后，将得到的悬浮液用200mL庚烷稀释，并且再浓縮至约90mL的体积。然后，加入200mL的庚烷，并且将悬浮液再次浓縮至约150mL的体积。然后将固体通过过滤收集，用2x50mL的庚垸洗涤并且通过抽吸干燥，得到32.16g的标题化合物，为浅黄色固体；由HPLC分析确定的纯度为98.7%(HPLC柱ZorbaxXDB-C8,3x100mm,3.5洗脱液20-100%乙腈/水+01.°/。TFA，流速0.5mL/min，历时10min，在UV254nm检测，停留时间9.52min)。21步骤5:N-[5-(2-溴-乙酰基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(IId)的制备将配备有磁力搅拌器和氮气入口/出口的500mL圆底烧瓶装入32.10g(80.19mmol)在步骤4中制备的化合物，90mL的二氯甲烷和56.20mL(756.6mmol)的三氟乙酸，并且将反应混合物在室温搅拌40h。HPLC分析显示反应完全。将反应混合物在30°C/30mmHg浓縮至约40mL的体积，用200mL甲苯稀释，并且浓縮至约50mL的体积。将得到的浆液用100mL甲苯稀释并且再次浓縮至约50mL的体积。在用100mL庚垸稀释后，通过过滤收集固体，并且通过抽吸干燥，得到23.30g(96.8%收率)的标题化合物，为黄色固体；由HPLC分析确定的纯度为99.15。/。(条件与步骤4中相同，停留时间7.76min)。步骤6:乙酸2-[5-(2，2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(IIe)的制备将配备有磁力搅拌器，加料漏斗，热电偶探头和氮气入口/出口的500mL圆底烧瓶装入4.40mL(76.86mmol)的乙酸，140mL的DMF和7.000g(85.33mmol)的乙酸钠。然后，在45min内滴加23.30g(77.62mmol)在步骤5中获得的化合物。在室温再搅拌lh后，HPLC分析显示反应完全。将反应混合物用350mL乙酸乙酯稀释，并且在搅拌下加入100mL饱和碳酸氢钠。将有机层分离，用3x100mL水洗涤并且在30°C/60mmHg浓缩至约60mL的体积。将得到的浆液用200mL庚垸稀释，在30°C/60mmHg浓縮至约150mL的体积，并且在50°C搅拌30min。在冷却到室温后，将固体通过过滤收集，用40mL在庚烷中的10%乙酸乙酯洗涤，并且通过抽吸干燥，然后减压蒸馏(中央清扫系统(housevacuum))24h，得到19.52g(90.0%收率)的标题化合物，为灰白色固体；由HPLC分析确定的纯度为98.81%(条件与步骤4中相同，停留时间6.78min)。'H-NMR(DMSO-d6):10.71(s，1H),9.37(d,1H),8.89(d,1H),5.48(s,2H),2.14(s，3H),1.25ppm(s，9H)。实施例2N-[5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪-2-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(IIf)的制备将配备有机械搅伴器，加料漏斗，热电偶探头和氮气入口/出口的3-颈l-L圆底烧瓶装入在实施例1，步骤2中制备的24.10g(102mmol)5-(2，2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-羧酸甲酯(9)，300mL的THF并且加入24.0mL(369mmol)的溴氯甲垸。在使用-90。C庚烷-液氮冷却浴冷却到-78。C后，滴加100.0mL(260mmol)的2.6M在己垸中的丁基锂溶液，同时将反应混合物温度保持在-77士2。C。然后加入另外15.0mL(231mmol)的溴氯甲烷，接着滴加另外的55.0mL(143mmol)的2.6M在己烷中的丁基锂，同时将反应混合物温度保持在-77士2。C。HPLC分析显示反应完全。将冷混合物缓慢倒入300mL(300mmol)的1TV盐酸中并且搅拌以温热到环境温度。将混合物在真空下部分浓縮，并且将沉淀的固体通过过滤分离，用水洗涤并且通过抽吸干燥，得到19.42g的粗制产物，为浅橙色固体，由HPLC分析确定的纯度为91.5%。将该粗制产物19.0g在100mL乙酸乙酯中形成浆液，并且用50mL庚烷稀释得到的悬浮液。然后将固体通过过滤收集，用2x50mL的庚垸-乙酸乙酯1:1洗涤并且通过抽吸干燥，得到13.5g(53%收率)的氯酮，为灰白色固体，由HPLC分析确定的纯度〉99M。'H-固R(DMSO-d6):10.71(s,1H),9.35(d,1H)，8.94(d,1H)，5.20(s,2H),1.25ppm(s,9H)。实施例3发酵和生物转化将2x500ml含100mL的508S培养基的带障板的烧瓶用1mL的近平滑假丝酵母R2599冷冻储液接种，所述508S培养基在每升去离子水中包含葡萄糖20g,酵母提取物10g和大豆胨10g。然后将烧瓶在设置在220rpm的环形振荡器上于27。C温育72小时。然后将烧瓶内容物储集到合适的接种烧瓶中，并且接种到含5L的YSD培养基的7.5L发酵罐中，所述YSD培养基在每升去离子水中包含葡萄糖20g,酵母提取物10g,大豆胨10g和不含氨基酸的含氮酵母碱基6.7g和ShellAseol防沫剂0.3ml。发酵参数设置如下温度27。C，通过自动调节通气和搅拌速度将溶解氧维持超过50%,通过自动加入25%w/v氢氧化铵将pH维持在6.5，使用剂量计以4-5。/。v/v每天的速率进料乙醇(100。/c))。在培养20h后，取出1.5L的液体培养基并且开始乙醇进料。再过2小时后，以在875mL水中的悬浮液的形式加入175.5g的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(实施例1)，得到5%(w/v)的最终浓度。定时取样并且用HPLC分析以确定CS)-N-[5-(l,2-二羟基-乙基)-吡嗪-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(7)的滴定度(titre)以及该产物的对映体纯度。当在68小时后判断反应完全时，通过将液体培养基在原位加热到70°C30分钟而将近平滑假丝酵母灭活。表l反应时间二醇R-二醇S-二醇(h)(g/L)(%)(%)11.033.42017.02417.02617.644.527.25132.36830.73.696.4分离将如上获得的热灭活的液体培养基用于产物分离。将4.23L液体培养基在实验室离心机上用转位式转子(3500rpm,15min)离心。除去乳色的上清液(3.60L)。将团粒再次悬浮在0.8L水中并且离心，得到0.76L混浊的上清液。将统一的水溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次9L)。在第一次萃取时发生自发的相分离。在第二次萃取时获得乳状液。通过混合在250gdicalitespeedplus(AcrosOrganics123380010)中并且真空过滤混合物(Filtrox滤板AF50/8427)，破坏乳状液。在第三次萃取时获得快速相分离。将获得的有机萃取物集中并且在实验室旋转蒸发仪(rotavap)上真空浓缩。将浓縮物与两勺dicalitespeedplus混合，过滤并且用乙酸乙酯补成1.00L浓縮物。该浓縮物含114.4g(s)-二醇(7)。24将浓缩物样品干燥并且显示以下分析数据(HPLC):99.4%的面积纯度，由HPLC(柱子SupelcoSilABZ+,4.6x250mm,5(im,洗脱液20-90%乙腈/水+0.1%TFA，流速1mL/min，历时10min，在UV300nm检测，停留时间4.26min)测定；92.0%ee，由手性HPLC(柱子ChiralpakAD-H，洗脱液20%乙醇/80%乙腈，流速1mL/min，40。C,在UV237nm检测，停留时间18.14min(R-二醇)和20.86min(S-二醇))测定。^-丽R(DMSO-d6):10.15(s,IH)，9.18(s,IH)，8.44(s，1H),5.54(d,IH)，4.72(t,1H),4.63(dd,IH)，3.69(m，IH)，3.53(m,1H),1.25ppm(s，9H)。MS(离子喷雾)m/z240.1(M+H,M为239.1)。实施例4大规模多-酶促反应将50g的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨萄-吡嗪-2-萄-2-氧代-乙酯(178mmol)在150ml叔丁基甲基醚(TBME)中搅拌。随后，加入反应缓冲液，674mL20mM的2-(4-吗啉基)-乙磺酸，和100.1g的D-葡萄糖(658mmol)。将温度调节到29。C并且将pH调节到6.25。反应-脱乙酰基化-由2.01g脂酶AH的加入开始。紧接着，加入40mg的葡糖脱氢酶GDH102，201mg的酮还原酶KRED101和202mg的辅因子NADP以开始不对称还原。反应温度升高到37。C。通过l.ON氢氧化钠溶液的受控添加(pH-stat)将搅拌着的悬浮液维持在pH6.25(和37。C)。在11.2h后，在总共消耗354.1mL的l.ON氢氧化钠后，并且在完全转换后，将反应混合物再搅拌10.5h。为了萃取产物，将300g氯化钠加入到反应混合物中并且将pH调节到7.5。随后，将反应混合物用1L的乙酸乙酯萃取5次。相分离自发发生。将合并的有机相用无水硫酸钠干燥，蒸发并且在HV上干燥过夜。分离出44.76g(5)-N-[5-(l,2-二羟基-乙基)-吡嗪-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(4)(96.4%HPLC纯度，[SupelcoSilABZ+，250x4.6mm,洗脱液20-90%乙腈/水+0.1%TFA，历时10min，流速1mL/min，在UV300nm检测，停留时间5.3min]，ee〉99.9%[ChiralpakIA，250x4.6mm，5jim，洗脱液50%庚烷50%乙醇/甲醇1:1，历时20min，流速1mL/min，在UV240nm检测，对映体停留时间9.3禾卩10.9min])，为浅橙色、高粘性的油状物。25乙酸2-「5-(2，2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基l-2-氧代-乙酯的小规模还原将2mg的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯溶解在20plDMSO中，并且加入到含有20|iL的2-丙醇，1.5mL的100mM2-(4-吗啉基)-乙磺酸,pH6.0，3mg的NADPH和3mg的酮还原酶(参见表l)的反应瓶中。在2h后，将反应物用0.5ml乙酸乙酯萃取，并且经由手性HPLC分析([ChiralcelOD-H,250x4.6mm，Nr.146，洗脱液65%庚烷20%庚烷+0.1°/。TFA15%异丙醇，40。C，历时15min，流速1mL/min，在UV210nm检测，对映体停留时间6.2和7.2min]，结果见表2)。表2:形成相应的乙酰氧基醇(乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-羟基-乙酯)的选择的分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例6小规模多酶促反应将1mg乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(IIe)溶解在20piDMSO中，并且加入到含有20nL的2-丙醇，1.5mL的100mM磷酸钾，pH7.2,3mg的NADPH，30(iL的LipozymeCALBL[Novozyme]和2mg的酮还原酶(参见表2)的反应瓶中。在16h后，将反应物用0.5ml乙酸乙酯萃取，并且经由手性HPLC分析(ChiralcdAD-H，Nr.417，洗脱液90%乙醇10%甲醇，40°C，历时30min，流速1mL/min，在UV210nm检测，对映体停留时间9.2和10.2min]，结果见表3)。表3:形成相应(S)-二醇(4)的选择的分析结果KRED转化率ee二醇酮还原酶面积％%10197.69910797.3>9911197.999.511297.8>9911397.9>9911497.398A1F97.5>99BID97.4>99B1E97.4>99实施例7N-「5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪-2-基l-2,2-二甲基-丙酰胺(IIf)的酶促还原将l.5g的N-[S-P-氯-乙酰基)-吡嗪-l基]-H二甲基-丙酰胺(实施例2,5.8mmol)放置在配备有pH电极、pH控制的计量泵和搅拌器的反应器中。随后加入反应缓冲液，300mL的lOOmM磷酸钾缓冲液和3.5g的D-葡萄糖(17.7mmo1)。将温度调节到30。C并且将pH调节到6.5。通过加入25mg的葡糖脱氢酶GDH102,100mg的酮还原酶KRED101和250mg的辅因子NADP，开始不对称还原。通过1.0N氢氧化钠溶液的受控添加(pH陽stat)，将pH维持在pH6.5(和30。C)。在46h后，在总共消耗5.79mL的1.0N氢氧化钠后，将反应物通过过滤而澄清。随后，将产物用0.4L的乙酸乙酯萃取。相分离自发发生。将有机相用无水硫酸钠干燥，蒸发并且在HV上干燥过夜。分离出1.42gOS)-氯醇(97.7%HPLC纯度，[SuplecosilAbz+,250*4.6mm,洗脱液35-90%乙腈/水+0.1%TFA,25。C，历时10.9min，流速1mL/min，在UV300nm检测，停留时间5.6min]，ee〉99.9%[ChiralcelOD-H，250*4.6mm,洗脱液85%庚烷15%乙醇+0.01M乙酸铵，25。C，历时25min，流速0.8mL/min，在UV302nm检测，对映体停留时间6.6和7.5min])，为浅黄色晶体。'H-NMR(DMSO-d6):10.21(s,1H),9.2(d,1H)，8.50(d,1H),6.10(d,2H),4.94ppm(d/tr,1H),3.92(d/d，2H),1.25ppm(s，9H)。MS(离子喷雾)m/z257.8(M+H，M为257.1)。实施例82aO-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-f5-n(S),2-二羟基-乙基V吡嗪-2-基l-丙酰胺(III)的制备步骤1:N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(12)的制备将N-[5-(l(S),2-二羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(46g，用溶剂稍微湿润，~170mmol)在四氢呋喃(275mL)中的溶液用2,2-二甲氧基丙烷(225mL,1.88mol)和一水合对甲苯磺酸(3.4g，17.9mmol)处理。将反应混合物在25。C搅拌16.5h。薄层色谱显示反应完全，形成极性较小的产物。将反应混合物真空浓縮，并且将残余物溶解在二氯甲垸(600mL)中。将有机层用饱和氯化钠水溶液(250mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)洗涤。每个水层用二氯甲垸(250mL)反萃取。将合并的有机层与硫酸钠(35mg)和NoritACharcoal(8g)—起搅拌，然后通过C盐垫过滤。将滤液真空浓縮至约250g的重量。将该物质用乙醚(300mL)处理，并且将混合物再次真空浓縮至约350g的重量，此时，结晶开始。将混合物在冰箱(4。C)中储存4h并且过滤。将固体在真空炉中于30。C干燥16h，得到白色晶体(32.3g，68%),mp144-144.5。C。收集来自母液的另外的收获物，得到纯度与第一批收获物相当的白色晶体(9.5g，20%)。采用手性柱的高效液相色谱分析显示，与真实外消旋物样品相比，两批收获物都是100%ee。将两批收获物合并，得到所需的N-[5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺。步骤2:5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基胺(13)的制备将N-[5-((S)-2，2-二甲基-[1,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(8.4g，30.7mmol)和碳酸钾(4.32g，31.2mmol)在甲醇(150mL)中的混合物在25。C搅拌16.5h，此时，薄层色谱显示向极性更大的产物的部分转化。为了避免在立体中心处的差向异构化，反应在完成前是不连续的。因此，在减压下于25。C除去溶剂。将得到的残余物从乙酸乙酯(50mL)再次真空浓缩。使用Biotage色谱(FLASH40L，二氧化硅，乙酸乙酯)纯化该物质。收集的较早洗脱的部分可用于回收未反应的原料新戊酰基酰胺，为白色固体(2.0g，24。/。)。将在后洗脱的部分真空浓縮，得到5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基胺(3.7g，63%)，为淡黄色油状物。采用手性柱的高效液相色谱分析显示100%ee。步骤3:2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(14)的制备将2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-丙酸(如实施例1中制备,6.29g,19.01mmol)和AgV-二甲基甲酰胺(2滴)在二氯甲烷(70mL)中的溶液在2°C搅拌，然后用草酰氯(4.15mL,45.7mmol)处理。将混合物在2。C搅拌5min并且在25。C搅拌15min。然后将反应混合物真空浓缩。将残余物溶解在苯(25mL)中，并且重复蒸发。将得到的酰氯溶解在二氯甲烷(40mL)中，冷却到0。C，然后用由5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基胺(3.65g，18.95mmol),吡啶(4.6mL，56.9mmol)和二氯甲垸(40mL)组成的溶液处理。将混合物在不补充冷却浴的情况下搅拌16h。然后将反应混合物用1N盐酸水溶液(100mL)处理。分离各层，用二氯甲垸(75mL)萃取水层。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和饱和氯化钠水溶液洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并且真空浓縮。经Biotage色谱(FLASH40L,二氧化硅，1/1乙酸乙酯/己烷)，得到2(RH3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(8.9g,92%)，为白色泡沫(ES)+-HRMSm/e对于C24H3()C1N305S(M+H)+的计算值508.1668，实测508.1671。步骤4:2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-(l(S)，2-二羟基-乙基)-29吡嗪-2-基]-丙酰胺(III)的制备将2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(8.85g，17.4mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液用1N盐酸水溶液(50mL)处理。将得到的乳状反应混合物在25。C搅拌，在15min内，乳状反应混合物变澄清。在25。C继续搅拌16h。将反应物真空浓缩，并且用二氯甲烷(1x100mL然后2x50mL)萃取残余物。每一个有机萃取物用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)和饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并且真空浓缩。经Biotage色谱(FLASH40L，二氧化硅，1/1乙酸乙酯/己烷然后100%乙酸乙酯)，得到2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-环戊基-N-[5-(1(S),2-二羟基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(7.15g,88%)，为无色泡沫(ES)+-HRMSm/e对于C21H26C1N305S(M+H)+的计算值468.1355，实测468.1360。国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际形式霍夫曼-拉罗奇有限公司瑞士巴塞尔407062/136国际保藏机构依照条约第7.1款发出的在原始保藏情况下的收到在该页的底部确认I.微生物的鉴定保藏者给出的鉴定号国际保藏机构给出的编号R2599DSM19155II.具体说明和/或建议的分类名称上述I中鉴定的微生物伴随有()具体说明(x)建议的分类名称(可用时用x表示)III.收到和接受本国际保藏机构接受于2007-03-09(原始保藏日)！收到的上述I中鉴定的微生物。IV.转化请求的收到本国际保藏机构在(原始保藏日)收到上述I中鉴定的微生物，并且在(转化要求的收到日)收到将原始保藏物转化成布达佩斯条约下的保藏物的请求V.国际保藏机构名称德意志微生物保藏中心(DSMZ)具有代表国际保藏机构权力的人或授权官地址D-38124不伦瑞克员的签名Inhoffenstr.7B日期2007-03-141适用条约6.4(d)款，该日期是获得国际保藏机构的状态的日期。表DSMZ-BP/4(单独页)08/200631国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际形式霍夫曼-拉罗奇有限公司瑞士巴塞尔407062/136国际保藏机构依照条约第10.2款发出的存活证明在该页的底部确认I.保藏者II.微生物的鉴定名称霍夫曼-拉罗奇有限公司国际保藏机构给出的编号62/136DSM19155地址瑞士巴塞尔4070保藏或移交日期、2007-03-09III.存活声明上述II中鉴定的微生物的活性是在2007-03-092测试的在该日，所述微生物是(x)3存活()3不再存活IV.进行存活测试的条件4V.国际保藏机构名称德意志微生物保藏中心(DSMZ)具有代表国际保藏机构权力的人或授权官地址D-38124不伦瑞克员的签名Inhoffenstr.7B日期2007-03-14表示原始保藏的日期，或者进行新的保藏或移交的日期，即最近的相关日期(新保藏的曰期或移交的日期)。在第10.2(a)(ii)和(iii)款所指的情况下，指最近的存活测试。在可用栏中画x在要求填入信息或测试结果为阴性时填入。表DSMZ-BP/9(单独页)08/200权利要求1.用于制备式I化合物的方法，其中R是低级烷基羰基或氨基保护基并且R1是羟基或卤素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不对称还原，其中R2是低级烷基羰基氧基或卤素。2.根据权利要求l的方法，其特征在于，R'是羟基并且Fe是乙酰氧基。3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述酶促水解和所述酶促不对称还原是采用近平滑假丝酵母(Ca"^/a，rap^7a^)种的酵母进行的。4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述酶促水解是通过水解酶进行的，所述水解酶选自酯酶、蛋白酶和脂酶，并且随后的酶促不对称还原是通过一种或多种氧化还原酶进行的。5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述酶促水解是通过脂酶进行的。6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述脂酶从南极假丝酵母(Ca"A<ia,产碱杆菌属的禾中(爿/ca/z'ge"&s)或洋葱伯克霍尔德氏菌(5wr狄o/(ien.acep鎖'o)获得。7.根据权利要求4的方法，其特征在于，将酮还原酶或醇脱氢酶用作氧化还原酶。8.根据权利要求4或权利要求7的方法，其特征在于，将选自KRED101,KRED107,KRED111,KRED112,KRED113,KRED114,A1F，B1D和B1E中的一种酮还原酶与葡糖脱氢酶GDH102组合用作氧化还原酶。9.根据权利要求l的方法，其特征在于，Ri和I^是氯。10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述酶促不对称还原是通过一种或多种氧化还原酶进行的。11.根据权利要求10的方法，其特征在于，将酮还原酶或醇脱氢酶用作氧化还原酶。12.根据权利要求l至ll中任何一项的方法，其特征在于，R是低级烷基羰基。13.根据权利要求1至12中任何一项的方法，其特征在于，R是叔丁基羰基。14.式IIc的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中^是低级烷基羰基氧基或卤素。15.根据权利要求14的式IIc的化合物，其中f是乙酰氧基或卤素。16.式Ic的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>17.用于制备式m化合物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>所述方法包括根据权利要求1至12所述的方法，接着a)将式Ia的二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R是低级垸基羰基或氨基保护基，与2,2-二甲氧基丙垸反应以形成縮醛，并且在碱性条件下将所述胺脱保护，获得式IV的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>b)将式IV的胺与式V的羧酸或其活化衍生物缩合，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>获得所述的酰胺；并且c)在酸性条件下水解所述的縮醛。18.如上所述的新的方法和化合物,全文摘要本发明涉及用于制备式I的2-氨基-[5-(1-羟基-2-羟基或卤代-乙基)]-吡嗪衍生物的生物催化的不对称还原，式I中，R是低级烷基羰基或氨基保护基并且R¹是羟基或卤素。所述化合物是制备葡糖激酶激活剂的关键中间体。文档编号C12P17/10GK101641447SQ200880009751公开日2010年2月3日申请日期2008年3月26日优先权日2007年4月4日发明者史蒂文·保罗·汉隆,恩斯特·库普弗,汉斯·艾丁,萍王,舒联合,鲁姆·尼古拉耶夫·拉迪诺夫申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司