专利名称：：用basp1基因和/或srd5a2基因中的甲基化胞嘧啶检测肝癌、肝癌风险、肝癌...的制作方法
技术领域：
：本发明提供以下方法、试剂盒和试剂通过鉴定和/或定量临床样品中的特定基因和/或其DNA片段的曱基化，来检测肝癌、肝癌风险、肝癌复发风险和肝癌恶化并监测肝癌随时间进展。
背景技术：
：肝癌自慢性肝病(慢性肝炎和肝硬化)发展而来，这种起因的大部分病例会伴随长期的肝炎病毒感染。在日本，超过95%的肝癌患者雍患长期的乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染，特别是超过80%的肝癌源自HCV相关疾病。肝炎患者通常在肝炎出现后的20-30年内变得更严重，并在进展为肝硬化后发展为肝癌。肝硬化前期(纤维化程度F3)和肝硬化(纤维化程度F4)尤其与高肝癌率有关，据称那些患者将在10年内发展为肝癌。发病的年龄为60岁以上，在老一代人中病例更多。也存在在发生肝炎后，在相对早的时期及在较年轻一代中发展为肝癌的病例。但对这种病例的起因尚未十分明确。过去，常规进行以下方法来检测肝癌:用现有的肿瘤标记AFP(a-曱胎蛋白)和PIVKA-II(维生素K缺乏诱发的蛋白-II)的免疫分析进行筛选，和通过高风险肝癌患者的回声测定(超声波检查)进行监测。，对于通过这些检测已被怀疑患有肝癌的患者，通过诊断成像、更详细的回声、CT(计算机层析X射线照相术)或MRI(磁共振成像)检测来证实肝癌的位置、大小和数量。此外，若有需要，通过活組织检查用病理检测来最终确诊肝癌。对已经确诊的肝癌进行治疗肝切除术、经导管动脉栓塞术(TAE)、穿刺治疗(经皮乙醇注射疗法(PEIT)、射频消融(RFA)和微波凝固治疗(MCT))。然而，由于没有除去病毒，以及即使经过治疗肝病也没有被治愈，因此肝癌复发率极高。如果通过目前的免疫分析和回声测定检测出早期肝癌(直径小于3cm、直径小于5cm和单一的或高度分化的肺瘤)，并经过适当治疗，则预后相对4交好。然而，用于免疫分析的现有的肿瘤标记AFP和PIVKA-II的灵敏度和特异性不够。尤其是对于早期肝癌，这两种标记的灵敏度明显很低(参见非专利文献l、2、3和4)。因此，很难检测早期肝癌，当检测到时大部分病例已经发展为晚期癌症(advancedcancer)，与其它癌症比较，肝癌患者5年内的存活率很低(参见非专利文献5)同时，当前在回声测定中仪器的改进使我们能够检测早期肝癌，但因为如下若干问题其不适合筛选高风险肝癌患者一次测定耗时30分钟左右、需要专门技能、依赖仪器性能和对普通医院的普及率较低。另外，由于很难检查整个肝，尤其是被其它器官遮住的部分和肝的内部，因此存在漏检肝癌风险。因此，仍没有足够令人满意的现有的用于检测肝癌尤其是早期肝癌的方法。近来分子生物学技术的发展正在阐明人癌细胞中没有任何遗传变化和任何核苷酸序列改变的DNA修饰的特征。基因变化、突变、扩增和缺损的特征作为代表性实例已众所周知。通过近来的表观遗传学(epigeneticalstudy)研究，已经报道在变异细胞(variable.cell)尤其是癌细胞中特定基因高度反常地曱基化。在高等真核细胞中，基因组DNA仅在CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上被曱基化，富含CpG的区域称为"CpG岛"，已知其在完整的人类基因组的大约一半上存在。通常CpG岛存在于启动子区，在这种情况下曱基化与基因表达调控密切相关。简言之，在未曱基化情况下，基因可表达(转录出mRNA)，但在曱基化情况下，通过某些调控系统的过程基因表达相反受到抑制。已知这种通过曱基化的基因表达调控对组织、发育、分化、疾病、性别或年龄具有特异性。特别地，由于在癌细胞或转化细胞中经常观察到受CpG岛上的异常的高度曱基化阻抑的基因表达，因此认为其与癌症发生有关。基于基础研究中的这些证据，迄今一直在变异癌症中进行关于CpG岛上异常的高度曱基化与癌症发生之间关系的临床研究。在肝癌中，一直在进行类似的临床研究，业已报道在肝癌患者的肺瘤组织中观察到特定基因的异常的高度曱基化(参见非专利文献6、7和8)。因此，可推断的是，将对癌细胞的特定基因或其DNA片段上的曱基化的鉴定用于诊断，对检测早期癌症而言非常有用。另外，曱基化被认为是与癌症发生直接相关的因素之一，它被认为是在癌症发生前发展；随癌症进展或恶化而改变；并且对不同患者或临床病症表现出不同概况。因此，曱基化的鉴定可能能够用于检测癌症前病灶、预测肝癌治疗后的复发、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展。然而，先前的临床研究结果是用确诊后的用于分析的肿瘤组织DNA样品来获得，因此不能满足用于检测早期肝癌或肝癌发生风险的筛选用途。使用组织的测定由于操作复杂和样品处理能力极低而不适于常规试验。另外，用于分析的多种基因和分析中使用单种基因选择不当，可造成灵敏度和特异性不足。因此，实践中很难将DNA片段曱基化的鉴定用于诊断癌症。同时，少量DNA在血液中循环，尤其是业已知晓癌症患者血液中DNA的量不断增力o(参见非专利文献9和10)。研究认为这是由于以下原因引起当胂瘤组织以异常速度不断增殖时，较老的细胞通过程序性死亡(细胞凋亡)或坏死而被破坏，其中的大量DNA释放到血液中，。因为来自变异组织或血液细胞的DNA以及源自肿瘤组织的DNA都包括在血液中，所以一直以来很难通过用常规技术来区分来源于特定肿瘤组织的DNA。但是，利用血液中的DNA来诊断癌症是极有前景的诊断实践应用。参考文献9[专利文献l]TetznerR等，WO2004/113567:24-25,2004[非专利文献l]NomuraF等，AmJGastroenterol94:650-4，1999[非专利文献2]MartinezCerezoFJ等，P、evEspEnfermDig84:311-4,1993HanSL等，Hepatogastroenterology52:348-512005[非专利文献5]OsakaCancerRegistry,Annualreport2006[非专利文献6]YuJ等，CellRes13:319-33,2003[非专利文献7]KanaiY等，Hepatology29:703-9，1999[非专利文献8]KondoY等，Hepatology32:970-9,2000[非专利文献9]LeonSA等，JImmunolMethods9:157-64,1975[非专利文献10]RenN等，WorldJGastroenterol12:3911-4,2006[非专利文献ll]HermanJG等，ProcNatlAcadSciUSA93:9821-6，1996.CottrdlSE等，NucleicAcidsRes32:el0,2004.[非专利文献13]EadsCA等，NucleicAcidsRes28:e32，2000.[非专利文献14]IizukaN等，Lancet361:923-929,2003[非专利文献15]TheGeneralRulesfortheClinicalandPathologicStudyofPrimaryLiverCancerLiver(用于原发性肝癌的临床和病理研究通用法则)，LiverCancerStudyGroupofJapan(日本肝癌研讨会)，第二版。Tokyo:Kanehara&CO"LTD,2003.发明简述本发明目的是解决通过使用常规肿瘤标记的免疫分析和对高风险肝癌患者的回声测定来筛选或监测肝癌中的问题；发现可高灵敏和高特异性地检测的新肺瘤标记，甚至发现很难通过常规方法检测的早期肝癌；并提供使用这些标记来进行的简单、准确和高通量的方法及其试剂盒和试剂。本发明还旨在提供通过用血液样品作为测量靶标用于易于自动化的肝癌检测的方法。另外，利用合适的新的肿瘤标记，来实现为高风险肝癌患者检测癌症前病灶和预测肝癌治疗后的复发，和实现为肝癌患者检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的i^良，这也是本发明目标。因此，发明人发现预料不到地可通过鉴定和/或定量临床样品中的一种或多种特定基因或其各自的DNA片段的甲基化，来高灵敏度、高特异性且容易准确地检测肝癌，尤其是早期肝癌；可容易地检测肝癌风险、肝癌治疗后的复发风险和肝癌恶化;.可容易地监测肝癌随时间的进展，据此发明人完成了本发明。简言之，本发明关键要点是用于检测肝癌、检测肝癌风险、检测肝癌治疗后复发、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的*的方法。更具体地，本发明涉及以下方法用于检测BASP1基因和/或SRD5A2基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性的曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法，该方法包括下述步骤(a)-(d)，其中患者样品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中肝癌特异性的甲基化胞嘧啶的存在和/或量是患者以下情况的指征罹患肝癌；肝癌风险增加；具有肝癌治疗后复发风险；具有恶性肝癌；或肝癌随时间进展，所述步骤如下进行(a)从来自患者的样品中分离基因组DNA;(b)提供用于化学处理或酶处理所述基因组DNA的试剂，以区分(differectiate)曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法扩增基因组DNA的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含曱基化胞嘧啶的区域；和(d)测定所述患者样品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含CpG序列的区域中的肝癌特异性曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量，其存在和/或量表明患者罹患肝癌、肝癌风险增加、具有肝癌治疗后复发风险、具有恶性肝癌或肝癌随时间进展。本发明另一目标是用于指示患者罹患肝癌、肝癌风险增加、具有肝癌治疗后复发风险、具有恶性肝癌或肝癌随时间进展的方法，所述方法通过用包括以下步骤(a)-(d)的方法检测患者样品中的BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT緣因或RASSFl基因中的至少两种基因中的含CpG序列区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量，以及通过与所述曱基化胞嗜咬的存在情况和/或量联合运用来进行(a)从来自患者的样品中分离基因组DNA;(b)提供用于化学处理或酶处理所述基因组DNA的试剂，以区分曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法扩增基因组DNA的BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因或RASSF1基因中的至少2种基因的含曱基化胞嘧啶的区域；和(d)测定所述患者样品中的BASPl基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT驢因或RASSF1基因中的至少2种基因的含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量，其存在和/或量表明患者罹患肝癌、肝癌风险增加、具有肝癌治疗后复发风险、具有恶性肝癌或肝癌随时间进展。本发明更具体的目标是上述方法中的任一种，其中PCR引物对中的任一个引物的核苷酸序列与基因组DNA核苷酸序列在包含可经历甲基化的胞嘧啶残基的区域处互补，并当所述胞嘧啶甲基化时可与所述基因组DNA的核苷酸序列特异性杂交。或者，本发明优选实施方案为上述过程的方法，其中PCR引物对中的至少任一个引物可与不含可经历曱基化的胞嘧啶残基的区域特异性杂交，并且同时使用用于阻断由所述PCR引物进行的扩增的寡核普酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列与所述PCR引物的核苷酸序列部分地重叠，且在其它部分与基因组DNA核苷酸序列在包含可经历曱基化的胞嘧啶残基的区域处互补，当所述胞嘧啶未曱基化时，所述寡核苷酸可与所述基因组DNA核苷酸序列特异性杂交。12所述方法中的任一种的优选实施方案为，其中将用于使未曱基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂提供给基因组DNA来作为步骤(b)的化学处理，以使所述DNA的几乎所有未曱基化的胞嘧啶转化为尿嗜啶。亚硫酸氢盐的试剂，例如亚硫酸氢钠和/或亚石克酸钠和/或6-羟基-2,5，7，8-四曱基色满-2-甲酸。所述方法中的任一种的另外优选实施方案为，其中将限制酶提供给基因组DNA来作为步骤(b)的酶处理，所述限制酶不能消化含曱基化胞嘧啶识别位点但可消化不含曱基化胞嘧啶识别位点。优选血液样品，其中同时应用常用的肿瘤标记蛋白(例如AFP和/或PIVKA-II)的浓度值和/或不定的(freefloating)DNA量的浓度值，例如GSTP1基因的量。本发明方法优选用于测定早期肝癌。用于本发明的样品来源于人血清、血浆、全血、组织、血液细胞、排泄物或内分泌物/外分泌物。另外，本发明优选其中在步骤(c)中实施用荧光探针的实时PCR扩增的实施方案。本发明还涉及一种方法，其中PCR引物对可与不含可经历曱基化的胞嘧啶残基的基因组DNA核苷酸序列至少在其3'-端处特异性杂交，对于步骤(d)，通过序列分析或通过质谱来进行由所述PCR引物扩增的产物中曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量的测定。本发明优选包含两种核酸引物的以下引物对1)BASP1一MSF(SEQIDNo:l)和BASP1—MSR(SEQIDNo:2)2)SPINT2—MSF(SEQIDNo:3)和SPINT2一MSR(SEQIDNo:4)3)APC一MSF(SEQIDNo:5)和APC一MSR(SEQIDNo:6)4)CCND2一MSF(SEQIDNo:7)和CCND2一MSR(SEQIDNo:8)5)CFTR一MSF(SEQIDNo:9)和CFTR一MSR(SEQIDNo:lO)6)RASSF1—MSF(SEQIDNo:ll)和RASSF1—MSR(SEQIDNo:12)7)SRD5A2一MSF(SEQIDNo:13)和SRD5A2—MSR(SEQIDNo:14)8)BASP1一F(SEQIDNo:15)和BASP1—R(SEQIDNo:16)9)PINT2—F(SEQIDNo:17)和SPINT2一R(SEQIDNo:18)10)APC一F(SEQIDNo:19)和APC—R(SEQIDNo:20)11)CCND2—F(SEQIDNo:21)和CCND2一R(SEQIDNo:22)12)CFTR一F(SEQIDNo:23)和CFTR一R(SEQIDNo:24)13)RASSF1—F(SEQIDNo:25)和RASSF1—R(SEQIDNo:26)14)SRD5A2—F(SEQIDNo:27)和SRD5A2—R(SEQIDNo:28)15)SPINT2—HMF(SEQIDNo:29)和SPINT2—HMR(SEQIDNo:30)。本发明优选探针选自以下1)BASPl一TMP(SEQIDNo:31)2)SPINT2—TMP(SEQIDNo:32)3)APC—TMP(SEQIDNo:33)4)CCND2—TMP(SEQIDNo:34)5)CFTR一TMP(SEQIDNo:35)6)RASSFl一TMP(SEQIDNo:36)7)SRD5A2JTMP(SEQIDNo:37)8)SPINT2—HMBF(SEQIDNo:38)9)SPINT2_HMBR(SEQIDNo:39)。本发明另一目标是试剂盒，其用于检测肝癌特异性的曱基化胞嘧啶碱基的存在情况和/或量的方法中的任一种，或用于表明患者罹患肝癌或在将来可能罹患肝癌的方法中的任一种，所述试剂盒包含(a)上述引物对中的至少一对，和/或；(b)上述探针中的至少一种。本发明另外的目标是试剂，其用于检测肝癌特异性的曱基化胞嘧啶碱基的存在情况和/或量的方法中的任一种，或用于指示患者罹患肝癌或在将来可能罹患肝癌的方法中的任一种，所述试剂包括.(a)上述引物对中的至少一对，和/或；(b)上述探针中的至少一对。本发明另一目标是用于上述方法中的任一种的装置系统，所述系统包括(a)上述引物对中的至少一对，和/或；(b)上述探针中的至少一种。本发明还涉及上述引物或探针的以下用途用于检测患者样品中的HCC相关基因的含CpG序列区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧咬碱基的存在情况和/或量，或用于检测患者肝癌、肝癌风险增加、肝癌治疗后复发风险、恶性肝癌或肝癌随时间进展。通过用本发明测定方法容易并准确地检测临床样品的肝癌(尤其是早期肝癌)情况是可能的，通过预先检测肝癌风险和肝癌治疗后复发风险，预期有助于改进肝癌患者治疗的效果。作为另一用途，通过检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展，预期提供了用于确定肝癌疗程的指征。发明详述(l)肝癌特异性曱基化基因发明人通过比较由手术切离自肝癌患者的76例肿瘤组织和16例非肿瘤组织之间的基因表达水平，选出在肿瘤组织中其表达水平特异性降低的基因，也即其CpG岛很可能高度曱基化的基因，另外，选出在其启动子区确实具有CpG岛的23种肝癌特异性曱基化候选基因。接下来，通过为所述候选基因进行对来源于切离自早期肝癌患者的肿瘤组织的基因组DNA曱基化分析，选出两种肝癌特异性曱基化候选基因。另外，通过确证对肝癌患者血液中的所述两种基因具有特异性的肝癌来源的曱基化DNA片段的检测，最终将所述两种基因(SAST^(brainabundantmembraneattachedsignalprotein1,大月S富含的膜W十着4言号蛋白1)基因和57A^2(类固醇-5a-还原酶，a多肽2)基因)鉴定为肝癌特异性曱基化基因。所述两种基因SJ5P/基因和5TD^42基因都已#皮克隆，其cDNA(mRNA)序列业已登记在GenBank中(A4S尸7:NM—006317,S/Z^」么NM—000348)。然而，尚未表明所述两种基因的CpG岛以癌症特异性的方式高度曱基化。本发明发明人首次出人意料地发现所述两种基因在肝肿瘤组织中高度曱基化，但在非肿瘤肝组织中很少曱基化。也就是说，他们发现所述两种基因以肝癌特异性德方式高度曱基化,因而适合作为^r测肝癌的标记。同时，对于业已在先前的公开参考文献中"t艮道的12种肝癌特异性曱基化异常的基因，通过对来源于切离自早期肝癌患者的肿瘤组织的基因组DNA实施曱基化分析，选出9种肝癌特异性曱基化候选基因。另外，通过确证对肝癌患者血液中的所述9种基因中的5种基因具有特异性的肝癌来源的曱基化DNA片段的检测，最终将所述5种基因0S尸/AT2(丝氨酸蛋白酶抑制剂，kunitz型，2)基因、乂PC(腺瘤样息肉及结肠癌)基因、CCM)2(细胞周期蛋白D2)基因、CF77(嚢性纤维化跨膜传导调节蛋白，ATP-结合盒(binding-cassette))基因和iL4M尸7(Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族l)基因)鉴定为肝癌特异性曱基化基因。所述5种基因S尸/AT基因、^尸C基因、CCA^Z)2基因、CF77基因和/ASSF7基因已经全部克隆，其cDNA(mRNA)序列业已登记在GenBank(6TYA72:NM一021102」尸C:NM—000038、CCM)2:NM—001759、CF77:NMJ)00492、7AXS尸7:NM—007182)。有若干报道表明所述5种基因的CpG岛以肝癌特异性方式高度甲基化，但其甲基化频率不同,在HCV阳性肝癌中未曾有过报道。发明人首次发现所述5种基因在HCV阳性肝胂瘤组织中高度曱基化，但在非肿瘤肝组织中很少曱基化。也就是说，他们发现所述5种基因以HCV阳性肝癌特异性方式高度曱基化，因而适合作为检测肝癌(尤其是HCV阳性肝癌)的标记。可通过本发明检测的癌症优选肝癌，更优选肝细胞癌(HCC)，最16优选HCV阳性HCC。在本发明中，肝癌才企测是指判断受检查者是否被怀疑患有肝癌。当受检查者已被怀疑患有肝癌时，通过诊断成像和病理检测来确诊肝癌。本发明中检测肝癌风险是指判断受检查者在不久的将来有没有发展肝癌的高度可能。本发明中检测肝癌复发是指判断受检查者有没有在肝癌治疗后复发肝癌的可能。本发明中检测肝癌恶化是指判断受检查者的肝癌的发展是否高度恶化。本发明中监测肝癌随时间的进展是指判断受检查者的肝癌是否随时间进展。另外，本发明涉及以下方法利用临床样品并通过鉴定和/或定量所述样品中的SAS^基因和/或57A5^基因或其DNA片段上的曱基化或者所述样品中的上述7种基因A4S尸/基因、S朋W2基因、57W72基因、爿尸C基因、CCM)2基因、CKTR基因和7ASS/^基因中的至少2种或其DNA片段上的曱基化，来检测肝癌。本发明优选使用包含3种或更多种基因的组合，但更优选使用^ASP/基因、S^DX42基因或57W72基因。根据本发明，可将血液中常用的肿瘤标记蛋白的浓度值和/或血液中不定的DNA量与所述7种基因上的曱基化胞嘧啶的鉴定结果和/或定量值结合利用。常用的肿瘤标记蛋白优选AFP和/或PIVKA-n,特别是AFP。不定的DNA量优选为对GS7P7基因所测出的量。在亚硫酸氢盐(BIS)处理之前或之后的DNA可用作被测量的DNA，其中优选使用BIS处理后的DNA。临床样品原则上不受限制，只要是从受检查者中获得的即可。例如，血清、血浆、全血、组织、血液细胞、排泄物或内分泌物/外分泌物都可适用于本发明。优选血清、血浆和全血，尤其优选使用血清。活检材料和通过手术切除的组织是合适的组织样品，粪便和尿液是合适的排泄物样品，胆汁和胰液是合适的内分泌物/外分泌物样品。受检查者或患者也不受限制，只要是人类即可。本发明优选应用于高风险肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)，特别是HCV阳性高风险肝癌患者或肝癌患者。罹患肝癌并经过合适治疗的患者可包括在高风险肝癌患者中。(2)甲基化的鉴定和/或定量根据本发明，"特定基因的曱基化鉴定和/或定量"是指确定包含在临床样品中特定基因的启动子区的CpG岛上的CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基的曱基化情况和/或定量所述曱基化水平。用于鉴定和/或定量甲基化的方法优选甲基化特异性PCR(MSP)(参见非专利文献11)和/或HM-PCR(重曱基(HeavyMethyl)PCR)(参见非专利文献12)，其尤其优选用TaqMan探针的TaqMan-MSP和/或TaqMan-HM-PCR(参见非专利文献13)。对于扩增试剂，可使用根据公开方法自制的试剂，优选使用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)。MSP是指本发明方法，其中PCR引物对中的至少任一个引物的核香酸序列与基因组DNA核苷酸序列在包含可经历曱基化的胞嘧啶残基的区域处互补，并当所述胞嘧啶被曱基化时，可与所述基因组DNA核苷酸序列特异性杂交。特别地，当可经历曱基化的胞嘧咬被曱基化时，用可与含所述曱基化胞嘧啶的核苷酸序列特异性杂交的PCR引物进行PCR扩增，根据是否发生所述扩增来检测是否存在曱基化。HM-PCR是指本发明方法，其中PCR引物对中的至少任一个引物可与不含可经过曱基化的胞嘧啶残基的区域特异性杂交，并且同时使用用于阻断由所述PCR引物进行的扩增的寡核普酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列与所述PCR弓1物的核苷酸序列部分地重叠，且在其它部分与基补，当所述胞嘧啶未曱基化时，所述寡核苷酸可与所述基因组DNA核苦酸序列特异性杂交。特别地，PCR引物可与不含可经历曱基化的胞嘧啶的核苷酸序列特异性杂交，也就是说，同时使用不依赖胞嘧咬曱基化的非曱基化特异性PCR引物和适用于阻断由所述PCR《1物进行扩增的寡核苷酸(阻断探针)。所述阻断探针与所述PCR引物部分重叠。因此，当所述阻断探针与靶标核苷酸序列杂交时，因所述PCR引物不能杂交，而扩增被阻断。所述阻断探针的其它部分与含可经历甲基化的胞嘧啶的核苦酸序列互补，因而当所述胞嘧啶未甲基化时，所述探针可与含所述未甲基化的胞嘧啶的核苷酸序列特异性杂交。因此，通过所述PCR引物进行扩增，并且只有当胞嘧啶被曱基化时，才可根据是否发生由所述PCR引物的进行所述扩增，来检测是否存在曱基化。另外，可应用其它方法来鉴定和/或定量本发明的曱基化，所述方法例如序列分析或质谱法，此处序列分析优选用Pyrosequencer(BiotageAG)。根据本发明，为了鉴定和/或定量特定基因的曱基化，有必要从临床样品提取DNA用于预处理。例如，市售试剂盒如MagNAPureLCDNA分离"i式剂盒I(RocheDiagnosticsGmbH)或QIAampDNABloodMidi试剂盒(QIAGENGmbH)，或按已知方法制备的试剂，可用于DNA提取。优选采用DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)从血清和血浆中提取DNA。用亚硫酸氢盐试剂处理提取的DNA，将DNA上未曱基化的胞嘧啶转化为尿嘧咬(BIS处理)。市售试剂盒如EpiTectBisulfite试剂盒(QIAGENGmbH)、EZDNA甲基化-Gold试剂盒(ZymoResearchCorporation)或DNA修饰试剂盒(Chemicor^International,Inc.)，或按已知方法制备的试剂，可用于BIS处理。通过核酸扩增方法如PCR,来扩增DNA的包含CpG岛的区域(所述DNA中未曱基化的胞嘧啶被所述BIS处理转化为尿嘧啶)，并用所述扩增产物来确证所述DNA，该DNA中未曱基化的胞嘧啶已被普遍(regularly)转化为尿嘧啶。19具体而言，上迷过程通过以下方法来进行用引物通过核酸扩增来扩增未被BIS处理转化为尿嘧啶的曱基化胞嘧咬的核普酸序列和转化为尿嘧啶的未曱基化的胞嘧啶的核苷酸序列；通过所迷扩增产物的电泳和/或序列分析来确证所述扩增产物。所述扩增产物的长度通常可低于1000bp,优选低于180bp，特别优选大约为IOObp。在本发明中，优选的引物对和通过所述引物对扩增所得的产物长度如表1所示。表l:用于肝癌特异性曱基化基因的MSP扩增的引物对<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在以上核酸扩增中，TaqMan探针如表2所示，所述探针与表l所述的引物对l-7同时使用，能够通过进行实时PCR来特异性鉴定和/或定量曱基化的胞嘧啶。用两种不同的荧光物质在其5，端和3，端标记这些探针。焚光物质的使用不受限制，只要它们是两种不同荧光物质即可。优选例如用FAM标记5，端，尤其是用TAMRA标记3，端。表2:为鉴定MSP扩增得肝癌特异性曱基化基因产物的TaqMan探针<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在上述核酸扩增中，阻断探针如表3所示，所述探针与表l所述引物对15同时使用，能够通过进行HM-PCR反应来特异性鉴定和/或定量曱基化胞的嘧啶。这些阻断探针用标记物质来保护。标记物质原则上不受限制，只要可用所述阻断探针来阻断DNA延伸反应即可，优选用磷酸盐标记。另外，所述阻断探针可用作单一试剂，优选一次使用两种探针。表3:用于肝癌特异性曱基化基因的HM-PCR的阻断探针<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本发明涉及上述引物和探针以及用于检测肝癌、检测肝癌风险、^r测肝癌治疗后复发、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展的方法。另外，本发明包括用于检测肝癌的试剂盒和试剂，试剂可包括引物和探针，而试剂盒可包含用于DNA提取、BIS处理和核酸扩增的试剂在其内。本发明包括用于检测肝癌、检测肝癌风险、检测肝癌治疗后复发、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展的装置系统，在该系统中利用用于检测肝癌、检测肝癌风险、检测肝癌治疗后复发、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展的方法、试剂盒、试剂、引物和探针本领域技术人员可易于理解的是，某些碱基可在上述引物中的SEQIDNo.l-I4的5，端中缺失或插入，所述引物包括在能扩增所述7种胞嘧啶特异性曱基化基因的引物的范围内。某些碱基可在上述引物中的SEQIDNo.l5-30的5，端缺失或插入，所述引物包括在能特异性扩增所述7种基因的引物的范围内。因此，本发明引物包括其中某些碱基在所述范围内的SEQIDNo.l-30中缺失或插入的引物。某些石咸基可在上述探针的末端缺失或插入，所述探针包含在可与用上述引物中的SEQIDNo.l-14和29-30扩增所得的产物中的核酸序列杂交的探针范围内，所述核苦酸序列包含曱基化的胞嘧啶，也就是说，所述探针保持所述探针原有的杂交特异性。因此，本发明探针包括其中某些碱基在SEQIDNo.31-37上缺失或插入的在上述范围内探针。另外，它们包含所述探针的互补链。某些碱基可在上述阻断探针的末端缺失或插入，所述阻断探针包含在能阻断由引物对15进行的扩增的探针范围内。因此，本发明的阻断探针包括某些碱基在SEQIDNo.38和39上缺失或插入的在所述范围内的阻断探针。实施例接下来，通过展示可实际上用已知样品实施的实施例来更详细地解释本发明。然而，本发明所延伸的范围不仅仅限于这些实施例。实施例l.肝癌特异性甲基化基因的鉴定利用"AffymetrixHumanGenomeU95ADNAChips",通过在手术切自肝癌患者的76例胂瘤组织和16例非肿瘤组织之间比较基因表达水平，我们选出在肿瘤组织中表达水平特异性显著降低2倍的101种基因，也就是说，这些基因的CpG岛很可能高度甲基化。从所述基因中进一步选出23种在其启动子区中实际含有CpG岛的肝癌特异性曱基化候选基因。接下来，用BIS处理从20例早期肝癌患者(分级为I期或II期的肝癌,肿瘤尺寸小于1.3-3.6cm)获得的各liig的肿瘤组织基因组DNA，用所述经BIS处理的DNA作为模板通过PCR扩增上述23种候选基因的包含CpG岛的区域，通过直接序列测定来检查曱基化情况。同样地，同时分析来自正常肝组织和白细胞的基因组DNA的曱基化情况作为对照样品。具体而言，作为曱基化分析结果，选出了4种在胂瘤组织中但不在正常肝组织和白细胞中高度曱基化的基因。进一步地，通过用相同的方法对切自新的20例肝癌患者(不同于上述肝癌患者)肝的每对肿瘤组织和非肿瘤组织的基因组DNA进行对上述4种基因的曱基化分析，确定了2种在所述肿瘤组织中但不在非肿瘤组织中高度曱基化的肝癌特异性甲基化候选基因。此外，通过确证在肝癌患者血液中对特异于所述2种基因的肝癌衍生的曱基化DNA片段的检观'h最终将所述2种基因0BAS尸7基因和S^)M2基因)鉴定为肝癌特异性曱基化基因。同时，我们选出12种在先前出版的文献中业已报道的肝癌特异性曱基化异常的基因。接下来，用BIS处理从20例早期肝癌患者(分级为I期或II期的肝癌，肿瘤尺寸小于1.3-3.6cm)获得的各l)ig的肿瘤組织基因组DNA,用所述经BIS处理的DNA作为模板通过PCR扩增上述12种候选基因中的包含CpG岛的区域，通过直接序列测定来检查曱基化情况。同样地，同时分析来自正常肝组织和白细胞的基因组DNA的曱基化情况作为对照样品。作为曱基化分析结果，选出9种在肿瘤组织中但不在正常肝组织和白细胞中高度曱基化的基因。进一步地，通过用相同的方法对切自新的20例肝癌患者(不同于上述肝癌患者)肝的每对肿瘤组织和非肿瘤组织的基因组DNA进行对上述9种基因的曱基化分析，确定了9种在所述肺瘤组织中但不在非肿瘤组织中高度曱基化的肝癌特异性曱基化候选基因此外，通过确证在肝癌患者血液中对特异于所述9种基因中的5种的肝癌衍生的曱基化DNA片段的检测，最终将所述5种基因GSP/M7基因、APC基因、CCM)2基因、CF77基因和W5^F/基因)鉴定为肝癌特异性曱基化基因。24实施例2.肝癌特异性曱基化基因的少量病例性能评估用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),从采自9例HCV阳性早期肝癌(高度分化的肝癌)和19例HCV阳性高风险肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)的1ml血清中才是取总DNA,制备50pl的DNA溶液。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，制得50]il经BIS处理的DNA溶液。接下来，用5pl所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性曱基化基因05AS尸/基因、5P/iW7基因、^尸C基因、CCWZ)2基因、C尸77基因、WMF/基因和基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过加入对各种基因具有特异性的TaqMan才笨针，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。A4S尸/基因、S尸/iW2基因、CC7VD2基因、C尸77基因和7^5^F7基因用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪器，实施实时PCR。对于每种基因，将5pl经BIS处理的DNA溶液加入到PCR反应混合物中，在该混合物中浓度如表4所示的引物对和TaqMan探针的混在1xMastermix中，在20jil总体积中进行PCR。对于A4S尸/、5P/AT2、CCM)2和iAS57^基因，如下进行PCR扩增:在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63。C45秒和72。C5秒的循环，接着在4(TC温热30秒。对于CFTR^基因，如下进行PCR扩增:在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、64。C60秒的循环，接着在40。C加热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测荧光信号。通过Fl/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50ial经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA,标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:对于BASP1、SPINT2、CCND2和RASSF1基因为1000、200、40和4pg/jal，对于CFTRJ^因为200、50和20pg/iil)制定。此外,将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估表4:肝癌特异性曱基化基因的MSP反应混合物的组成基因<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>^PC基因和^S7A^2基因用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪器，实施实时PCR。对于每种基因,在使表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCR^应混合物中后，加入5)il的经BIS处理的DNA溶液，所述反应混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸镁、375pMdNTP、2.5。/。甘油和0.15单位ZO5(热稳定的DNA聚合酶)组成，在20jul总体积中进行PCR。对于APC基因，PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C10秒、64。C60秒和72。C5秒的循环，接着在4(TC温热30秒。对于S^D5^2基因，PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循环，接着在恥。C温热30秒。通过Fl/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50jLil的经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA,标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:对于乂尸C基因为200、50、20和4pg/^il，对于57D5X2基因为200、40、10和4pg/pl)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。表5:肝癌特异性甲基化基因的MSP反应混合物的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在上述9例HCV阳性早期肝癌患者和19例HCV阳性高风险肝癌患者中，通过Iizuka等(参见非专利文献14)所报道的方法用所述7种基因的曱基化DNA的量，来计算各基因的Fisher比。结果如表6所示。Fisher比越高，意味着基因在该分析结果中越有前景。因此，经证明5AS尸/基因为尤其有前景的基因。表6:通过Fisher比在携带HCV的早期肝癌患者与携带HCV的高风险肝癌患者之间进行的可离性的(separability)等级评定<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>对于通过ROC(receiveroperatingcharacteristic,4妄受者工作特性)分析评定的Fisher比等级的头4种的基因，通过检查所述基因检测早期肝癌的能力来评估性能。还一起评估了头两种基因(SAS尸7基因和S/W77基因)的2基因组合的性能，以及头2种基因与第四种基因C8AS尸/基因、S尸/iV77基因和57①X42基因)的3基因组合的性能。特别地，对于单种基因而言，用各基因的甲基化DNA的量GBAS7^基因的甲基化DNA的量指定为BASP1值，其它基因也如此指定)直接进行ROC分析；对于2基因组合和3基因组合而言，分别用通过将所述曱基化DNA的量输入到以下公式中计算得到的值来进行ROC分析BASP1值+SPINT2值(2基因组合)，0.1xBASP1值十SPINT2值十SRD5A2值(3基因组合)。结果如图l所示。作为以上ROC分析的结果，尽管没有具有足以用单一基因检测早期肝癌的性能的基因，但联合2种或3种基因显示出足以检测早期肝癌的高性能。特别地，联合BAS尸7基因和S尸/A^T2基因,可对于检测早期肝癌具有78%的灵敏度和95%的特异性；联合j5AS尸/基因、5P/AT2基因和57DM2基因，可具有89%的灵敏度和90%的特异性。因此，建议将对本发明业已发现的肝癌特异性甲基化基因的曱基化DNA量进行的测量用于检测早期肝癌。实施例3.肝癌特异性曱基化基因的大量病例性能评估用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),从采自以下患者的lml血清中提取总DNA并制备50pl的DNA溶液119例HCV阳性肝癌患者(包括25例分级为I期的早期肝癌(基于TheGeneralRulesfortheClinicalandPathologicStudyofPrimaryLiverCancer(原发性肝癌的临床和病理研究的一般规定)来分期，参见非专利文献15),其肿瘤尺寸小于3cm;和21例高度分化的早期肝癌)和80例HCV阳性高风险肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，制备50pI经BIS处理的DNA溶液。接下来，用5pl所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性曱基化基因(SAS尸/基因、5P/A72基因、vl尸C基因、CCiVD2基因、CF77基因、^A^尸/基因和57D5J2基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过加入对各种基因具有特异性的TaqMan探针，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。其间，按专利文献l所述方法，同时用liul所述经BIS处理的DNA溶液测量lml血清中的总DNA的量。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。^AS"尸/基因、5^/A72基因、CX7VP2基因、CF77基因和7MS57^基因用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪器，实施实时PCR。对于每种基因，将5pl的经BIS处理的DNA溶液加入到PCR反应混合物中，在混合物中将浓度如表4所示的^1物对和TaqMan探针混入lxMastermix中，在20pl总体积中进行PCR。对于SAS尸/、S尸/AT2、CCA/D2和7MS5F/基因，如下进行PCR扩增在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63"C45秒和72。C5秒的循环,接着在40。C温热30秒。对于CFT綠因，如下进行PCR扩增在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、64。C60秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测焚光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50pl的经BIS处理的DNA溶液中的甲基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:对于A4S尸/、5P/AT2、CCM^和iL45^F/基因为1000、200、40和4pg/inl，对于CF77^基因为200、50和20pg/pl)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的甲基化DNA的量。将血清29中所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。X尸C基因和57DM2基因用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪器，实施实时PCR。对于每种基因，在将表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCIL良应混合物中后，加入5pl的经BIS处理的DNA溶液，所述反应混合物由50mMTricine(pH8,3)、3mM乙酸镁、375)iMdNTP、2.5%甘油和0.15单位ZO5(热稳定DNA聚合酶)组成，PCR在20W总体积中进行。对于v4尸C基因，PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C10秒、64。C60秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。对于S7A5A2基因，PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。通过Fl/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50iil经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:对于APC基因为200、50、20和4pg尔l,对于SiD:^2基因为200、40、10和4pg/pl)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。在上述119例HCV阳性肝癌患者和80例高风险肝癌患者中，通过Iizuka等(参见非专利文献14)所报道的方法用所述7种基因的曱基化DNA的量，来计算各种基因的Fisher比。结果如表7所示。Fisher比越高，意味着基因在该分析结果中越有前景。因此，经证明5^SP/基因和S尸/iV72基因为尤其有前景的基因。用甲基化DNA的量对所述^45^/基因和57YAT2基因实施ROC分析。结果显示，仅用所述S^SP/基因可对于^r测肝癌具有50。/。的灵敏度和95%的特异性或62%的灵敏度和80%的特异性；仅用所述尸/iW2基因，具有38%的灵敏度和96%的特异性。因此，建议将对本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因中的5AS尸/基因和/或5P/iV72基因的曱基化DNA量进行的测量用于检测肝癌。表7:通过Fisher比在携带HCV的肝癌患者和携带HCV的高风险肝癌患者之间进行的分离性的等级评定<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>接下来，对于119例肝癌患者、25例分级为I期且肿瘤尺寸小于3cm的早期肝癌或21例高度分化的早期肝癌，通过用FLC(Fisherlinearclassifer,Fisher线性分类公式)分析检查所述7种基因中的种联合检测肝癌的能力，来评估所述基因组合的性能。具体而言，通过Iizuka等(参见非专利文献14)报道的方法用各种基因的曱基化DNA的量建立数据约简算法(reductionalgorithm),用所述算法计算肝癌检测的灵敏度、特异性和识别率，基于所述FLC分析的结果实施ROC分析。结果示于图2-4中。作为所述FLC分析和ROC分析的结果，对于119例肝癌患者，可联合3种基因5AS尸/基因、5TW72基因和CF77基因通过如下公式以70%的灵敏度、80%的特异性和74%的识别率来检测肝癌0.9586xBASP1值+0,2843xSPINT2值—0.0078xCFTR值十0.3180(若计算值<0,则确定为肝癌)。对于25例分级为I期且肿瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可联合3种基因A4S尸/基因、S尸/iW7基因和(X7VD2基因通过如下公式以52。/o的灵敏度、88%的特异性和79%的识别率检测早期肝癌-0.003091xBASP1值—0.006448xSPINT2值—0.000655xCCND2值十0.350734(若计算值<0，则确定为肝癌)。对于21例高度分化的早期肝癌，可联合3种基因A4S尸/基因、5P/AT2基因和RASSF1基因通过如下公式以67。/。的灵敏度、80%的特异性和77%的识别率检测早期肝癌-0.009564xBASP1值—0.004042xSPINT2值—0.001373xRASSF1值十0.595593(若计算值<0，则确定为肝癌)(表8-10)。如图2-4所示，所述^^测肝癌的能力超过了同时测量的常用的胂瘤标记AFP或PIVKA-II的能力(例如HCC携带者0=115)与HCV携带者(n=57)相比较AFP(截断200);灵敏度30%,特异性100%,识别率53%;PIVKA-II(截断40。/o);灵敏度60%,特异性85%，识别率68%)。因此，建议将对本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的曱基化DNA量进行的测量用于检测肝癌，尤其是早期肝癌。此外，将同时测量的AFP和PIVKA-II与上述种个基因联合成9种因子，通过检查所述9种因子中的2种或3种联合检测肝癌的能力，来评估所述因子组合的性能。结果显示，可联合2种因子万^S尸7基因和AFP通过如下公式以75。/。的灵敏度、82%的特异性和78%的识别率检测肝癌:一0.000478xBASP1值一0.000011xAFP值十0.001089(若计算值<0，则确定为肝癌)。还可联合A45P/基因、5P/7VZ2基因和^P尸通过如下公式以79。/。的灵敏度、82%的特异性和80%的识别率检测肝癌-0.000476xBASP1值-0.000017xSPINT2值-0.000010xAFP值十0.001789(若计算值<0,则确定为肝癌)。对于25例分级为I期且肿瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可联合三种标记A4S尸/基因、SiW72基因和PIVKA-II通过如下公式以60Q/。的灵敏度、82%的特异性和74%的识别率检测早期肝癌-0.002106xBASPl值-0.005210xSPINT2值十0.000069xPIVKA-lKi+0.001390(若计算值<0，确定为肝癌)。对于21例高度分化的早期肝癌，可联合3种标记J尸C基因、S尸/A^2基因和AFP通过如下公式以67。/o的灵敏度、88%的特异性和81。/。的识别率检测早期肝癌—0.002538xAPC值-0.003626xSPINT2值-0.013544xAFP值十0.852581(若计算值<0，则确定为肝癌)(表8-10)。因此，建议的是，测量本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的曱基化DNA的量，并使所述测量值和常用的肿瘤标记AFP或PIVKA-II联合，可进一步提高检测肝癌的能力，尤其是早期肝癌。另外，将同时测量的血清中的DNA量、AFP、PIVKA-II和上述7种基因联合成10种因子，通过检查所述10种因子中的3种联合检测肝癌的能力来评估所述因子组合的性能。结果显示，可通过如下各公式以87%的灵敏度、80%的特异性和85%的识别率检测肝癌对于&iS尸7基因、S尸/A/T2基因和血清中的DNA量的组合，公式为-0.000219xBASP1值-0.000016xSPINT2值-0.015627x血清中的DNA量十0.618672(若计算值<0，则确定为肝癌)；对于BAS尸7基因、SM5v42基因和血清DNA的量的组合，公式为0.000220xBASPl值-0.000564xSRD5A2值-0.015633x血清中的DNA量十0.613763(若计算值<0,则确定为肝癌)；对于5ASP7基因、AFP和血清DNA的量的组合，公式为—0.000224xBASP1值-0.000010xAFP值-0.015610x血清中的DNA量十0.617716(若计算值<0，则确定为肝癌)。对于25例分级为I期且肿瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可联合3种标记5D/^y^基因、S尸/AT2基因和血清中的DNA量通过如下公式以84%的灵敏度、88%的特异性和86%的识别率检测早期肝癌-0.021150xSRD5A2值—0.007102xSPINT2值一0.052594x血清DNA量+2.091284(若计算值<0,则确定为肝癌)。对于21例高度分化的早期肝癌患者，可联合3种标记57I)5y42基因、S尸/AT2基因和血清中的DNA量；3种标记S尸/AT2基因、AFP和血清中的DNA量；和3种标记5P/AT2基因、PIVKA-II和血清中的DNA量分别通过如下公式以86。/。的灵敏度、90。/。的特异性和89。/。的识别率检测早期肝癌-0.001553xSRD5A2值一0.002923xSPINT2值—0.029064x血清中的DNA量十1.305493(若计算值<0，则确定为肝癌)；公式—0.003378xSPINT2值—0.00911233xAFP值-0.027178x血清中的DNA量十1.393957(若计算值<0，则确定为肝癌)；和公式-0.002833xSPINT2值十0.000061xPIVKA-II值-0.029513x血清中的DNA量+1.384308(若计算值<0,则确定为肝癌)(表S-IO)。因此，建议的是，测量本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的曱基化DNA的量，并使所述测量值与血清中的DNA量联合，使所述测量值、血清中的DNA量与AFP值联合，或使所述测量值、血清中的DNA量与PrVKA-II值联合，可进一步提高检测肝癌，尤其是早期肝癌的能力。表8:通过联合肝癌特异性甲基化基因、常用的肿瘤标记和血液DNA的量检测肝癌的能力HCC的119个病例7种曱基化DNA标记(从7种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>2种常规标记+7种曱基化DNA标记(从9种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>DNA的量+2种常规标记+7种曱基化DNA标记(从10种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表9:通过联合肝癌特异性甲基化基因、常用的肿瘤标记和血液中的DNA量检测肝癌的能力早期HCC(TNM分类为1期且肿瘤尺寸小于3cm〗的25个病例7种曱基化DNA标记(从7种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>2种常规标记+7种甲基化DNA标记(从9种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>DNA的量+2种常规标记+7种甲基化DNA标记(从10种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表10:通过联合肝癌特异性甲基化基因、常用的肿瘤标记和血液中的DNA量检测肝癌的能力早期HCC(高度分化)的21个病例7种甲基化DNA标记(从7种标记中挑选)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例4.通过定量直接测序来定量曱基化的DNA对于上述7种肝癌特异性甲基化基因SAS尸/基因、S^D5Z2基因、S尸/W72基因、J尸C基因、CCA^)2基因、CF77基因和/A^^7基因，通过定量直接测序对以下来源的基因组DNA中的包含CpG岛的区域进行甲基化分析所述基因组DNA来源于切自20例肝癌患者的肝的每对肿瘤组织和非肿瘤组织。具体而言，用BIS处理从组织提取的1吗基因组DNA，用所述经BIS处理的DNA作为模板，用表ll所述引物对PCR扩增上述7种基因的包含CpG岛的区域。PCRA应溶液由100pl终体积中的如下物质组成26.7ng的经BIS处理的DNA、用等体积TaqStart抗体(ClontechLaboratories,Inc.)在室温预处理5分钟的2单位的热稳定DNA聚合酶(TOYOBOCO.,LTD)、67mMTris-HCl(pH8.8)、16.6mM硫酸铵、0.01%Tween20、200dNTP、各lpM的引物对和1.5或3mM氯化4美通过用GeneAmpPCR系统9600(AppliedBiosystems)为PCR扩增仪如下进行DNA扩增在95。C初始变性2分钟，接着是5个95。C变性25秒、7(TC退火45秒和72。C延伸45秒的循环，接着是40个95。C变性25秒、65。C退火50秒和72。C延伸45秒的循环。浓缩PCR产物，在琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶切取扩增产物的目标带，用QIAquickGel提取试剂盒(QIAGENGmbH)分离。接下来，通过用PyrosequencerPSQ96MA和Pyrogold试剂(BiotageAG)以所述分离的产物作为模板进行定量直接测序，来检查包含CpG的区域的曱基化情况。表ll:扩增肝癌特异性甲基化基因的包含CpG岛的区域的PCR反应物组成<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>由定量直接测序得到的曱基化分析结果如表12-14所示。曱基化的量通过以下方式显示高于75%的情况下附以"***(3个星号)"、低于75%且高于50%的情况下附以"**(2个星号)"、低于50%且高于25%的情况下附以"*G个星号)，，和低于25%的情况下没有星号。如表12-14所示，通过对上述7种肝癌特异性曱基化基因的包含CpG岛的区域进行定量曱基化分析，可明确地区分肝癌患者的肿瘤组织和非肿瘤组织以及HCV携带者(高风险肝癌患者)组织。也就是说，证明了通过所述定量测序所进行的对所述肝组织DNA的7种肝癌特异性曱基化基因的包含CpG岛的区域的曱基化分析，可用于鉴定和识别肝癌。另外，比较了表12-14所示的在高度分化的HCC和分化不完全的HCC之间的CF77基因的曱基化DNA的量，分化阶段(恶性阶段)与曱基化DNA的量正相关(p0.05)。因此，建议定量曱基化分析可用于作为肝癌恶化的指征。il^:通过定量直接测序的甲基化分析结果肝癌患者/肿瘤组织<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表13:通过定量直接测序的甲基化分析结果肝癌患者/非胂瘤組织ID分化类型HCB/HBV感染肿瘤尺寸(cm)TMN分级甲基化DNA.的量(。/4)BASP1S刚T2APCCCND2CFTRRASSF1S画1高度HCV14D23.28.024.332.0*18.019.5Z0.82高度HCV3.5H28.1*7.5IfU17.920.119.318.93高度HCV3.4n6.317.330.5*22.712.518.04中度—162S.2'12.631.1'25.7'17.439.7*22.25中度HCV3狂20.46.918.622.315.128.2*17.46中度一2.5D29.5*6.715,422.19.223.815.97中度HCV"n20.89.21"25.7*1"18.823.0豕高度HCV1.8iZ3.7S.l16.621.116.227.8,19,2中度HCV/HBV3.4IV24.7U.221.336.7'23.022.926.5'10高度HCV1.4i29.2*M23.819.814.933.3*21.9n高度HCV3.7D27.6*6.913.324.817.818.521.112高度HCV5.4II10.01(619.021.419.921.813中度HCV1.2121.9.418.62(821.319.917.S"中度HCV8.1II20.810.813.814.918.740,6'23.215中度一3.5ID22.8ll.l15.228.5*1"37.7*21.216高度HCV細VD2SV11.814.826.1*22.921.627.5*17高度氾V2.3HI17.810.718.820.7Hi19.924.818中度HCV4.5in19.75,813.131.9*16.817.218.619高度HCV3.8in21.4ll.l11.927.8*20.016.02"20低度HCV1.2ID19.09.4".8J*15.024.72S.3*表14:通过定量直接测序甲基化分析结果HCV携带者(高风险肝癌患者)/肝组织IDHCB/HBV感染曱基化DNA的量(％)BASP1S刚T2APC圆CFTR瞧S画21HCV16.99.413.030.7*加.I23.519.222HCV17.437.2*18.328."实施例5.通过HM(重甲基)-PCR定量曱基化DNA对于上述7种肝癌特异性曱基化基因中的S尸/iV72基因，通过HM-PCR对以下来源的基因组DNA的含CpG岛区域进行甲基化分析所述基因组来源于从10例肝癌患者获得的胂瘤组织基因组DNA和从9例肝癌患者获得的非肿瘤组织。具体而言，用BIS处理从组织提取的1pg的基因组DNA，制备75pd的经BIS处理的DNA溶液。接下来，用引物对15(SEQIDNo.29和30)和2种阻断探针(SEQIDNo.38和39)以1pl39(13.3ng)的所述经BIS处理的DNA溶液为模板进行HM-PCR。在所述HM-PCR期间，用对5P/7VZ2基因具有特异性的TaqMan探针(SEQIDNo.32)通过实时PCR进行曱基化DNA定量。用LightCycler⑧TaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增4义，实施实时PCR。将ljLil的经BIS处理的DNA溶液加入到PCRA应混合物中，在该混合物中将0.5pM引物对、20pM阻断探针和0.1jiM的TaqMan探针混入lxMastermix中，在20pl总体积中进行PCR。PCR扩增如下进行在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、58。C60秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的58。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测把基因的扩增，用标准曲线计算75inl经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA浓度，标准曲线用同时测量的标准品制定(按以下系列稀释人工曱基化DNA:1000、200和40pg/pl)。如表15所示，可通过用100pg/jal作为截断值以80%的灵敏度和88.9%的特异性来区分肿瘤组织与非肿瘤组织。因此,建议的是，将以下分析用于检测和识别肝癌由HM-PCR对肝组织DNA的肝癌特异性曱基化基因(即M/iV77基因)的含CpG岛区域的甲基化进行的分析。表15:通过HM-PCR进行的曱基化分析的结果IDCp浓度pg/zn)Met(%)HCC131.915.98E+0260.6HCC532.553.95E+0240.1HCC633.512.13E+0221.6HCC732.095.34E+0254.2HCC1133.352.36E+0223.9HCC12HCC2734.151.41E+0214.3HCC4334.551.09E+0211.1HCC64HCC11934.27L30E+0213.2非-HCC139.544.32E+000.4非-HCC5非-HCC6非.-HCC733.192.61E+0226.5非，HCC12非-HCC27非-HCC43非-HCC6A非-HCC119标准品5rm31.1A9.86E+021000标准品lng33.572.05E+02200标准品200pg37.181.98E+0140CP:交点Met:曱基化率实施例6.通过测量肝癌特异性曱基化基因检测肝癌风险用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),从采自31例HCV阳性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后随访2年以上的患者)的1ml血清中提取总DNA，制备50pl的DNA溶液。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，并制备50pl经BIS处理的DNA溶液。接下来，用5lil所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性曱基化基因(A4S尸/基因、6P/A72基因和57A^2基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过一起加入对各种基因具有特异性的TaqMan探针，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。其间，按专41利文献l所示方法，同时用ljal所述经BIS处理的DNA溶液测量lml血清中的总DNA量。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。SAS尸7基因和S尸/AT2基因用LightCyderTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyderII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。对于每种基因，将5iLil的经BIS处理的DNA溶液加入到PCR^应混合物中，在该混合物中将浓度如表4所示的引物对和TaqMan探针混入1xMastermix中，在20jil总体积中进行PCR。PCR扩增如下进行在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测焚光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50pi经BIS处理的DNA溶液中的甲基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工甲基化DNA:1000、200、40和4pg/pl)制定。另外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。在将表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反应混合物中后，加入5iil的经BIS处理的DNA溶液，该反应混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸4美、375iaMdNTP、2.5%甘油和0.15单位Z05(热稳定DNA聚合酶)组成，PCR在20pl总体积中进行。PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C15秒、66°C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的66。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50pi的经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA,标准曲线用同时测量的标准品制定(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:200、40、10和4pg/Vl)。此外，将溶液中所述甲基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。对于上述31例HCV阳性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后随访2年以上的患者)，用数据约简算法来实施对^^测肝癌风险的临床评估，所述算法已在用大量病例进行肝癌特异性甲基化基因性能评估的期间建立(实施例3)。具体而言，将各基因的曱基化DNA的量和同时测量的血清中的DNA量进行对数变换，接着通过所述数据约筒算法值的差异在手术后2年内重新发展为肝癌(复发性HCC)的8个病例(多中心肝癌发生群体multicentrichepatocarcinogenesispopulation)和在2年内在任何器官均没发生转移和复发的23个病例(未复发群体)。结果表明，根据以下联合3种标记SASP/基因、S尸/A72基因和血清中的DNA量的公式，多中心肝癌发生群体比未复发群体具有明显更低的分值(pO.05):—0.042965xBASP1值-0.187008xSP證2值-2.600843x血清中的DNA量十9.331859(表16)。同样地，业已表明根据以下联合3种标记MA5^基因、5TY7V72基因和血清中的DNA量的公式，多中心肝癌发生群体比未复发群体具有明显更低的分值(pO.Ol):—0.112025xSRD5A2值-0.199992xSPINT2值-2.696542x血清中的DNA量十9.867470(表16)。两个群体的随访期之间并没有显著性(significance)(p=0.741)。另外，当对同样的31例肝癌进行肝癌风险研究时，即通过根据联合3种标记BylS尸7基因、S尸/A^2基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值-2.600843x血清中的DNA量+9.331859计算所得的分值，将该31个病例分为分值》0的病例(12例)和分值<0的病例(19例)，分值>0的所有12个病例均没有复发HCC，但分值〈0的19个病例中有8个(42.1。/。)复发HCC(Fisher确切检验p0.05)。另外，通过联合3种标记S/A^2基因、5TW72基因和血清中的DNA量的公式—0.112025xSRD5A2值—0.199992xSPINT2值一2.696542x血清中的DNA量十9.867470得到的准确的相同结果。因此，建议的是，测量本发明业已发现的肝癌特异性甲基化基因的曱基化DNA的量，并将所述测量值及血清中的DNA量联合，可使我们能够检测肝癌复发、HCC复发的风险。表16:对联合肝癌特异性曱基化基因和血清DNA量的肝癌风险检测的临床评估<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>实施例7.通过测量肝癌特异性甲基化基因检测肝癌复发风险用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)，从采自81例HCV阳性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后随访1年以上的患者)的1ml血清中提取总DNA,并制备50nl的DNA溶液。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，并制备50pl经BIS处理的DNA溶液。接下来，用5pl所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性曱基化基因(SAS7^基因、5P/A72基因和^S7ZX^2基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过将对各种基因具有特异性的TaqMan探针一起加入，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。其间，按专利文献l所述的方法，同时用lpl所述经BIS处理的DNA溶液测量lml血清的总DNA量。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。对于每种基因，将5^1的经BIS处理的DNA溶液加入到PCR反应混合物中，在该混合物中将浓度如表4所示的引物对和TaqMan探针混入lxMastermix中，在20jil总体积中进行PCR。PCR扩增如下进行在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50jiil经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/pl)制定。另外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并换算为1.ml血清中的甲基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。在将表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反应混合物中后，加入5iil的经BIS处理的DNA溶液，该反应混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸镁、375dNTP、2.5%甘油和0.15单位Z05(热稳定DNA聚合酶)组成，PCR在20W总体积中进行。PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C15秒、66。C45秒45和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的66。C延伸反应后检测焚光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycIer软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50p的经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品制定(按以下系列稀释人工曱基化的DNA:200、40、10和4pg/jul)。另外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述甲基化DNA的量用于统计分析和临床评估。对于上述81例HCV阳性肝癌患者(在采集血清并治愈性肝癌切除后随访l年以上的患者)，用数据约简算法来实施对4企测肝癌复发风险的临床评估，所述算法已在用大量病例进行肝癌特异性曱基化基因性能评估的期间建立(实施例3)。具体而言，将各基因的甲基化DNA的量和同时测量的血清中的DNA量进行对数变换，接着通过所述数据约简算法计算分值，随后通过t-检验用平均值分析以下两种病例之间的所述分值的差异在肝癌手术后1年内没有复发肝癌的68个病例(未复发肝癌群体)和在l年内出现复发的13个病例(早期肝癌复发群体)。结果表明，根据以下联合3种标记5AS尸/基因、S尸/W72基因和血清中的DNA量的公式，早期肝癌复发群体比未复发肝癌群体具有明显更低的分值(p〈0.05):—0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值一2.600843x血清中的DNA量十9.331859(表17)。此外，当对同样的81例肝癌进行肝癌复发风险研究时，即通过根据联合3种标记5ASP/基因、67YA^2基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值—2.600843x血清中的DNA量+9.331859计算所得的分值，将所述81个病例分为分值>0的病例(17例)和分值〈0的病例(64例)，分值>0的所有17个病例中均没有早期肝癌复发，但分值<0的64个病例中有13个(20.3%)发展为早期肝癌复发(Fisher确切检验p二0.06)。此外，通过联合3种标记S^Z)5^2基因、S尸/A^2基因和血清中的DNA量的公式-0.112025xSRD5A2值-0.199992xSPINT2值—2.696542x血清中的DNA量十9.867470,得到的准确的相同结果。因此，建议的是，测量本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的曱基化DNA的量，并将所述测量值与血清中的DNA量联合，可使我们能够检测早期肝癌复发的风险。表17:对联合肝癌特异性曱基化基因和血清中的DNA量的肝癌复发风险检测的临床评估组合肝癌早期复发N平均值*标准差平均标准误差BASP+SPINT+DNA(对数转换)不复发复发6813-1.622687-3.8061982.47664281.88548790.30033700.5229403*p<0.005实施例8.通过测量肝癌特异性曱基化基因监测肝癌随时间的存活率用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),从采自87例HCV阳性肝癌患者(经历治愈性肝癌切除的患者)的lml血清中提取总DNA,并制备50pl的DNA溶液。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，并制备50W经BIS处理的DNA溶液。—接下来，用5pl所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性曱基化基因(^457^基因、5TWr2基因和57^D^42基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过将对各种基因具有特异性的TaqMan探针一起加入，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。其间，按专利文献l所述的方法，同时用lnl所述经BIS处理的DNA溶液测量lml血清的总DNA量。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。^4S尸7基因和S尸/7V72基因用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。对于每种基因，将5iil的经BIS处理的DNA溶47液加入到PCFA应混合物中，在该混合物中将浓度如表4所示的引物对和TaqMar^罙针混入1xMastermix中，在20pl总体积中进行PCR。PCR扩增如下进行在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测焚光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50pl经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/W)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。在将表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反应混合物中后，加入5pl的经BIS处理的DNA溶液，该反应混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸镁、375dNTP、2.5%甘油和0.15单位Z05(热稳定DNA聚合酶)组成，PCR在20pl总体积中进行。PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的66。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50iil经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA，标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工甲基化的DNA:200、40、10和4pg/Vl)制定。此外，将溶液中所述甲基化DNA的量乘以50,并换算为1ml血清中的甲基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。对于上述87例HCV阳性肝癌患者(经历治愈性肝癌切除的患者)，用数据约简算法来实施对监测肝癌随时间的存活率的临床评估，所述算法已在用大量病例进行肝癌特异性曱基化基因性能评估的期间建立(实施例3)。具体而言，将各基因的曱基化DNA的量和同时测量的血清中的DNA量进行对数变换，接着通过所述数据约简算法计算分值，随后比较以下两种病例之间的肝癌手术后随时间的存活率分值>0的病例(22例)和分值<0的病例(65例)。结果如图5所示，根据联合3种标记5AS尸/基因、5"尸/A^72基因和血清中的DNA量的公式—0.042965xBASP1值—0.187008xSPINT2值—2.600843x血清中的DNA量+9，331859的计算，分值>0的22个病例比分值〈0的65个病例具有明显更高的存活率(总存活率p=0.0289，无病存活率p=0.0372)。总存活率表示一种表达患者在随访期的存活率的方法，其不考虑包括肝癌复发在内的死亡原因(死于其它疾病、老死、因肝硬化但不是肝癌而食管静脉曲张发作、其它癌症、交通事故或自杀的患者也包括在内)。无病存活率(无复发存活率)表示一种表达在随访期内在存活患者中是否观察到肝癌转移或复发的方法。总存活率手术后的某天(某时间点)的存活患者的百分率。无病存活率在某天(某时间点)在存活患者中无肝癌转移或复发的患者的百分率。因此，建议的是，将本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的甲基化DNA的量的测量，以及将所述测量值与血清中的DNA量的联合,用于监测肝癌手术后随时间的存活率。实施例9.通过测量肝癌特异性甲基化基因检测肝癌*用用于血清和血浆的DNAExtractorSP试剂盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd,),从采自M9例HCV阳性肝癌患者的1ml血清中提取总DNA,并制备50^的DNA溶液。用自制的试剂经BIS处理所述DNA溶液，并制备50pl经BIS处理的DNA溶液。接下来，用5pl所述经BIS处理的DNA溶液对7种肝癌特异性甲基化基因(A4S尸/基因、57W57基因和57D5AZ基因)各实施曱基化特异性PCR(MSP)。在所述MSP中，通过将对各种基因具有特异性的TaqMan探针一起加入，由实时PCR来进行曱基化DNA的定量测定。其间，按专利文献l所述的方法，同时用lpl所述经BIS处理的DNA溶液测量lml血清的总DNA量。曱基化DNA的定量实际上按照以下方法实施。A4S尸/基因和S尸/A^2基因用LightCyclerTaqManMaster试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH)作为扩增试剂，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。对于每种基因，将5pl的经BIS处理的DNA溶液加入到PCR反应混合物中，在该混合物中将浓度如表4所示的引物对和TaqMan探针混入1xMastermix中，在20jtd总体积中进行PCR。PCR扩增如下进行在95。C初始变性10分钟，接着是50个95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的72。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测耙基因的扩增，用标准曲线定量50jul经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA,标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/W)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。用自制的试剂作为扩增试剂，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作为核酸扩增仪，实施实时PCR。在将表5中所示浓度或量的引物对、TaqMan探针、乙酸钾(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反应混合物中后，加入5pl的经BIS处理的DNA溶液，该反应混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸镁、375pMdNTP、2.5%甘油和0.15单位Z05(热稳定DNA聚合酶)组成，PCR在20pl总体积中进行。PCR扩增如下进行在95。C初始变性2分钟，接着是50个95X:i5秒、66。C45秒50和72。C5秒的循环，接着在40。C温热30秒。在每一循环的66。C延伸反应后检测荧光信号。通过F1/F3分析模式在LightCycler软件(RocheDiagnosticsGmbH)中监测靶基因的扩增，用标准曲线定量50pl经BIS处理的DNA溶液中的曱基化DNA,标准曲线用同时测量的标准品(按以下系列稀释人工甲基化的DNA:200、40、10和4pg/pl)制定。此外，将溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并换算为lml血清中的曱基化DNA的量。将血清中的所述曱基化DNA的量用于统计分析和临床评估。对于上述149例HCV阳性肝癌患者，用三种肝癌特异性曱基化基因、血清中的DNA量和数据约简算法来实施对检测肝癌进展的临床评估，所述算法已在用大量病例进行肝癌特异性曱基化基因性能评估的期间建立(实施例3)。具体而言，用Pearson相关系数检验(Pearson，scorrelationcoefficienttest)来评估肺瘤尺寸与曱基化DNA的量、血清中的DNA量或以下分值之间的相关性，所述分值通过在对数变换甲基化DNA的量和血清中的DNA量后由所述数据约简算法计算得到。结果，SJS尸J基因的曱基化DNA的量趋向于与肿瘤尺寸正相关(F0.216,pO.01)(表18)。此外，以下分值趋向于与肿瘤尺寸负相关(F-0.235,p<0.005，r=-0.244,p<0.005)(表18):由联合3种标记SAS"尸/基因、5TW72基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值-2.600843x血清中的DNA量+9.331859计算得到的分值，或由联合3种标记57DW2基因、5P/iV72基因和血清中的DNA量的公式—0.112025xSRD5A2值—0.199992xSPINT2值—2.696542x血清中的DNA量十9.867470计算得到的分值。因此，建议的是，将本发明业已发现的肝癌特异性曱基化基因的甲基化DNA量的测量，或者将所述测量值与血清中的DNA量的联合，用于检测肝癌—的肿瘤尺寸、肝癌的进展。表18:对用肝癌特异性甲基化基因的曱基化DNA的量或联用肝癌特异性甲基化基因和血清中的DNA量检测肝癌逸艮的临床评估<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>工业适用性本发明用于检测和诊断肝癌(尤其是用于肝癌筛选测定、检测癌症前病灶、检测肝癌治疗后复发风险、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展)，并且可用于临床诊断、制药工业、试剂工业和医疗器械工业附图简述图1.ROC分析对肝癌特异性曱基化基因的性能评估结果。图2.FLC分析和ROC分析对肝癌特异性曱基化基因的性能评估结果检测肝癌的能力(BASP1+SPINT2+CFTR,灵敏度70%,特异性80%，识别率74%)。图3.FLC分析和ROC分析对肝癌(早期肝癌I期且肿瘤尺寸小于3cm)特异性曱基化基因的性能评估结果检测早期肝癌的能力(BASP1+SPINT2+CCND2,灵敏度52°/。，特异性86%,识别率78%)图4.FLC分析和ROC分析对肝癌(早期肝癌高度分化)特异性甲基化基因的性能评估结果检测早期肝癌的能力(BASP1+SPINT2+RASSF1,灵敏度67%,特异性80%,识别率77%)。图5.肝癌特异性曱基化基因和血清中的DNA量的测量值与肝癌手术后存活率(总存活率和无病存活率)之间的关系的临床评估结果；A:总存活率，在rogrank检验(logranktest)中P=0.0289;B:无病存活率，在rogrank检验中P=0.0372。权利要求1.用于检测BASP1基因和/或SRD5A2基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法，所述方法包括下述步骤(a)-(d)(a)从来自患者的样品分离基因组DNA；(b)提供用于化学处理或酶处理所述基因组DNA的试剂，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；(c)用PCR方法扩增所述基因组DNA的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含甲基化胞嘧啶的区域；和(d)测定来自所述患者的样品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中的含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量；其中所述患者样品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中肝癌特异性的甲基化胞嘧啶的存在和/或量是所述患者以下情况的指征罹患肝癌；肝癌风险增加；具有肝癌治疗后复发风险；具有恶性肝癌或肝癌随时间进展。2.用于指示患者以下情况的方法罹患肝癌、肝癌风险增加、具有肝癌治疗后复发风险、具有恶性肝癌或肝癌随时间进展，所述方法通过检测所述患者样品中的以下基因中的至少两种基因的含CpG序列区域中的肝癌特异性曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量来进行BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT錄因或RASSF1基因，所述方法包括以下步骤(a)-(d):(a)从来自所述患者的样品分离基因组DNA;(b)提供用于化学处理或酶处理所述基因组DNA的试剂，以区分曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法扩增所述基因组DNA的以下基因中的至少2种基因的含曱基化胞嘧啶的区域BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT驢因或RASSF1基因；和(d)测定所述患者样品中的以下基因中的至少2种基因的含CpG序列的区域中的肝癌特异性曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因或RASSF1基因。3.权利要求1或2的方法，其中PCR引物对中的至少任一个引物的的胞嘧啶残基的区域处互补，并且当所述胞嘧啶曱基化时与所述基因组DNA中的所述核苷酸序列特异性杂交。4.权利要求1或2的方法，其中PCR引物对中的至少一个引物与不含可经历曱基化的胞嘧啶残基的区域特异性杂交，并且同时使用用于阻断由所述PCR引物所进行的扩增的寡核苦酸，其中所述寡核苷酸与所述PCR引物的核苷酸序列部分地重叠，且在其它部分与所述基因组DNA的核苷酸序列在包含可经历曱基化的胞嘧啶残基的区域处互补，当所述胞嘧啶未曱基化时，所述寡核苷酸可与所述基因组DNA的所述核苷酸序列特异性杂交。5.权利要求l-4中任一项的方法，其中使用荧光探针实施实时PCR扩增来作为步骤(c)。6.权利要求1或2的方法，其中PCR引物对可与不含可经历曱基化的胞嘧啶残基的基因组DNA核苷酸序列至少在其3'-端处特异性杂交，并通过序列分析或通过质谱来实施步骤(d)的产物中曱基化胞嘧啶的存在情况和/或量的测定。7.权利要求1或2的方法，其中通过给所述基因组DNA提供用于使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂来实施步骤(b)的化学处理，8.权利要求7的方法，其中用于使所述DNA中的未曱基化的胞嘧咬转化为尿嘧啶的所述试剂为含亚硫酸氢盐的试剂。9.权利要求8的方法，其中所述含亚硫酸氬盐的试剂包含亚硫酸氢钠和/或亚疏酸钠和/或6-羟基-2,5，7,8-四曱基色满-2-曱酸。10.权利要求1或2的方法，其中通过给所述基因组DNA提供限制酶来实施步骤(b)的酶处理，所述限制酶不能消化含曱基化胞嗜咬的识别位点但能够消化不含甲基化胞嘧啶的识别位点。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中同时测定所述样品中常用的肿瘤标记蛋白的浓度值和/或不定的DNA的量。12.权利要求ll的方法，其中常用的肿瘤标记蛋白为AFP和/或PIVKA-II。13.权利要求ll的方法，其中将GS丁P1基因的量作为所述样品中的不定的DNA的量来测量。14.权利要求1-10中任一项的方法，其中肝癌为早期肝癌。15.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述样品来源于人血清、血浆、全血、组织、血液细胞、排泄物或内分泌物/外分泌物。16.包含以下组合的两个引物的引物对1)BASP1一MSF(SEQIDNo:l)和BASPl一MSR(SEQIDNo:2)2)SPINT2一MSF(SEQIDNo:3)和SPINT2一MSR(SEQIDNo:4)3)APC一MSF(SEQIDNo:5)和APC—MSR(SEQIDNo:6)4)CCND2一MSF(SEQIDNo:7)和CCND2一MSR(SEQIDNo:8)5)CFTR一MSF(SEQIDNo:9)和CFTR一MSR(SEQIDNo:10)6)RASSF1一MSF(SEQIDNo:l1)和RASSF1一MSR(SEQIDNo:12)7)SRD5A2一MSF(SEQIDNo:13)和SRD5A2—MSR(SEQIDNo:14)8)BASPl一F(SEQIDNo:15)和BASPl一R(SEQIDNo:16)9)SPINT2—F(SEQIDNo:17)和SPINT2一R(SEQIDNo:18)10)APC一F(SEQIDNo:19)和APC—R(SEQIDNo:20)11)CCND2一F(SEQIDNo:21)和CCND2—R(SEQIDNo:22)12)CFTR一F(SEQIDNo:23)和CFTR一R(SEQIDNo:24)13)RASSF1—F(SEQIDNo:25)和RASSFl一R(SEQIDNo:26)14)SRD5A2一F(SEQIDNo:27)和SRD5A2—R(SEQIDNo:28)15)SPINT2—HMF(SEQIDNo:29)和SPINT2—HMR(SEQIDNo:30)。17.选自以下的探针1)BASPl一TMP(SEQIDNo:31)2)SPINT2一TMP(SEQIDNo:32)3)APC—TMP(SEQIDNo:33)4)CCND2一TMP(SEQIDNo:34)5)CFTR一TMP(SEQIDNo:35)6)RASSFl一TMP(SEQIDNo:36)7)SRD5A2一TMP(SEQIDNo:37)8)SPINT2—HMBF(SEQIDNo:38)9)SPINT2一HMBR(SEQIDNo:39)。18.用于权利要求l-15中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒由以下组成(a)权利要求16的引物对中的至少一对，和/或；(b)权利要求17的探针中的至少一种。19.用于权利要求1-15中任一项的方法的试剂，所述试剂由以下组成(a)权利要求16的引物对中的至少一对，和/或；(b)权利要求17的探针中的至少一种。20.用于权利要求1-15中任一项的方法的装置系统，所述装置系纟克由以下《且成(a)权利要求6的引物对中的至少一对，和/或；(b)权利要求17的探针中的至少一种。21.权利要求16或17的引物或探针的以下用途用于检测患者样品中的HCC相关基因的含CpG序列区域中的肝癌特异性曱基化胞嘧啶碱基的存在情况情况和/或量，或用于检测患者肝癌、肝癌风险增加、肝癌治疗后复发风险、恶性肝癌或肝癌随时间进展。全文摘要本发明提供用于检测肝癌的新型方法。该方法通过对临床样品中特定基因和/或其DNA片段的甲基化的鉴定和/或定量，并通过将所述甲基化DNA的值与血液中存在的肿瘤标记值和/或DNA量结合，从而高灵敏度、高特异性且简单准确地检测肝癌，尤其是早期肝癌。本发明还通过同样的方法检测癌症前病灶、检测肝癌治疗后复发的风险、检测肝癌恶化和监测肝癌随时间的进展。就特定基因而言，提及了BASP1基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因、RASSF1基因和SRD5A2基因。文档编号C12Q1/68GK101675171SQ200880014389公开日2010年3月17日申请日期2008年3月1日优先权日2007年3月2日发明者三浦俊昭,冈正朗,森部丰辉,滨本义彦,玉造滋,饭塚德男申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司