一种调节核酸分子活性的方法

专利名称：：一种调节核酸分子活性的方法
技术领域：
：本发明涉及试剂，其调节(例如，抑制或者逆转)核酸分子(例如，适体(D或者L)，siRNAs，microRNAs，反义RNAs，包括上述分子的修饰形态(例如，2'F，2'0Me，2'B，2'1，2'NH等等))的药理学活性。更具体地说，本发明涉及试剂，其以不依赖于序列的方式结合治疗性或者诊断性核酸分子并且调节(例如，抑制或者逆转)它们的活性。本发明也涉及包括上述试剂的组合物及其使用方法。本发明的目标以及优点将在下面清楚地描述。图IA和图IB:在APTT分析中鱼精蛋白逆转因子IXa适体以及因子X适体的活性。鱼精蛋白(2.5iig)对于使用针对人因子IXa(图1A)的适体("Ch-9.3t")或者使用针对人因子Xa(图IB)的适体("llf7t")进行抗凝结处理的人血桨的凝固时间的影响。图2:鱼精蛋白逆转两种适体的活性。图3:PPA-DPA逆转VonWillebrandR9.3适体的活性。图4A-图4C:在猪抗凝结模型中鱼精蛋白逆转因子IXa适体。具体实施例方式本发明涉及试剂("通用解毒剂")(UAs)，其能调节核酸分子(NAMs)的药理学活性，包括治疗的以及诊断的NAMs。本发明更进一步地涉及通过对人或者非人哺乳动物施用这样的UAs以调节(例如，逆转/抑制)NAMs药理学作用的方法。另外，本发明涉及使用本发明的UAs以评估NAMs活性的方法。药理学的NAMs包括但不局限于，适体、siRNAs、microRNAs、反义RNAs、适体-siRNA嵌合体、mRNAs、核糖酶以及antagomirs，其结合想要的耙分子。适体靶分子一般地包括肽，蛋白质，糖蛋白，聚糖以及核酸，还有小分子量(有机)化合物。更具体地说，适体靶分子可以包括酶(例如，蛋白酶，包括因子VIIa，IXa，Xa，XIa，凝血酶以及蛋白质C)以及其酶原。适体靶分子也包括激素，受体(包括血小板受体，例如，糖蛋白(gp)IIbIIIa，GPIb-IX-V，GPVI，P2Y12，以及PARs)，粘着分子(例如，vonWillebrand因子以及胶原)代谢物，辅助因子(例如，组织因子，或者凝血因子Va以及VIIIa)，过渡状态同型物，以及药物，染料和毒素。可以使用SELEX方法制造适体(参见，例如，USPs5，270，163、5，817，785、5，595，887、5，496，938、5，475，096、5，861，254、5，958，691、5，962，219、6，013，443、6，030，776、6，083，696、6，110，900、6，127，119和6，147，204，也参见公开的美国申请号20030083294和其中引用的文献))。特异性针对于各式各样的靶分子的适体目前是可得到的(参见，例如，Gold等人，Ann.Rev.Biochem.64:763(1995)，Nimjee等人，An皿.Rev.Med.56:555-83(2005))。例如siRNAs，microRNAs以及反义RNAs等产品的细节以及在修饰基因表达中使用这些應s的方法已被描述，例如，见Dorsett和Tuschl，NatRevDrugDiscov.3(4):318-29(2004)，Fire等人，Nature391(6669):806-11(1998)，Grishok等人，Cell106(1):23-34(2001)，Lagos-Quintana，等人，Rna9(2):175-9(2003)，Leaman等人，Cel1121(7):1097-108(2005)，Martinez等人，Cell110(5):563-74(2002)，Meister等人，Rnal0(3):544-50(2004)，Meister和Tuschl，Nature431(7006):343-9(2004)，Pfeffer等人，Science304(5671):734-6(2004)，Tuschl，NatBiotechnol.20(5):446-8(2002)，Tuschl和Borkhardt，MolInterv.2(3):158-67(2002)。本发明涉及调节(例如，逆转或者抑制)NAM活性的方法，例如，通过改变它的构造并且因此改变它的功能和/或在空间上阻碍NAM与其靶分子的结合。根据本发明，UA可以和目标NAM接触，例如，在如此条件下以致它与NAM结合起来并且修饰NAM和其靶分子之间的相互作用。UA还可以通过电荷交互作用妨碍NAM与其靶分子的结合。对NAM和其靶分子之间相互作用的修饰可以源于，例如，作为被UA结合的结果而导致的对NAM结构的修饰。该UA可以结合游离的NAM和/或与其耙分子结合起来的NAM。本发明的UAs包括制药上可接受的一组带正电荷的化合物成员，包括蛋白质，脂质，和天然合成的多聚物，其可以在，例如，生物学流体中结合NAM。鱼精蛋白是一组蛋白质，其在水解反应中产生碱性的氨基酸而且在鱼的，例如鲑鱼的，精液中与核酸发生结合。鱼精蛋白可溶于水，通过加热不会凝结，并且包含精氨酸，丙氨酸和丝氨酸(大部分也包含脯氨酸和缬氨酸，并且许多包含甘氨酸和异亮氨酸)。几十年来，纯化形态的鱼精蛋白已经被用于中和肝素的抗凝血剂作用。本发明的UAs也包括鱼精蛋白变体(例如，+1810变体(Wakefield等人，J.Surg.Res.63:280(1996))以及鱼精蛋白的修饰形式，包括那些在公开的美国申请号20040121443中描述的。本发明另外的UAs包括鱼精蛋白片段，例如那些在USP6，624，141以及美国公开的申请号20050101532中描述的。一般地，本发明的UAs也包括调节肝素、其他的葡糖氨基聚糖类或者蛋白聚糖类(参见，例如USP5，919，761)的活性的肽。本发明更进一步地包括上述UAs在制药上可接受的盐，例如适当的包括硫酸盐。本发明UAs的例子可以包括在表1中描述的化合物类型，其中好几个包含了阳离子-NH基团，其确保了与磷酸二酯主链之间稳定的电荷-电荷相互作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本发明白々TheProtamines禾口原(Kossel，.Chem.330:J某些UAs，例如，鱼精蛋白，可以分离自天然的来iHistories(Longmans,NY(1928);Felix等人，Z.Physiol205(1963);Ando等人，Int.J.Prot.Res.1:221(1969);Felix，Adv.Prot.Chem.15:1(1960)。另外地，可以重组地、化学地或者合成地生产蛋白质性质的UAs。表l中描述的UAs是商业上可获得的和/或是使用本领域已知技术生产的。标准的结合分析，例如，可用于筛选本发明优选的UAs(例如，使用BIACORE以及等温的微量热检定分析法)。也就是说，试验化合物(例如，鱼精蛋白片段或者变体或者鱼精蛋白的修饰形态)可以在有利于结合的条件下和目标NAM(例如，适体，等等)接触，并且测定试验化合物实际上是否结合NAM。那些被发现能够结合NAM的试验化合物因此能在恰当的生物学测定(其取决于NAM以及它的靶分子)中被分析，以便决定是否该试验化合物可以影响NAM与其靶分子的结合和/或调节(例如，逆转)NAM的活性，或者在功能性测定中修饰NAM以及它的活性。本发明的UAs可用于，例如，逆转NAMs(例如，适体，等等)的抗凝血剂以及抗血栓形成作用，这些NAMs靶向至凝结途径的组分，特别是组织因子(TF)/因子VIIa(FVIIa)、因子VIIIa(FVIIIa)/因子IXa(FIXa)、因子Va(FVa)/因子Xa(Fxa)酶复合物以及血小板受体，例如GPIIb-IIIa以及GPVI，涉及促进血小板活化的因子，例如Gas6，vonWillebrand因子，胶原，涉及促进或者维持血纤维凝结形成的因子，例如PAI-l(血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂1)或者组织凝血活酶XIIIa(FXIIIa)，以及涉及促进或者阻止血纤维凝结形成的附加因子，例如ATIII(抗凝血酶III)，凝血酶或者凝固作用因子XIa(FXIa)的拮抗剂。以足够调节(例如，逆转)NAM活性的剂量施用本发明的UAs。存在好几个临床情况，其中能够迅速地逆转抗血栓形成的NAM活性或者抗凝血剂NAM的活性是合乎需要的。第一种情况是当抗凝血剂或者抗血栓形成的治疗导致出血时，包括颅内的或者胃肠的出血。第二种情况是当已经接受抗血栓形成治疗的病人需要的紧急手术时。在需要紧急冠状动脉旁路移植术并处于GPIIb/IIIa抑制剂有效作用之下进行经皮的冠状动脉介入的病人中，这些临床情况以低的百分率出现。在这些情况中，当前的实践将允许化合物(如小分子拮抗剂，例如依替巴肽)的清除，其可能费时2-4个小时，或者血小板输注(用于阿昔单抗治疗)。第三种情况是在心肺转流术期间使用抗凝血剂NAM。转流术病人倾向于发生外科手术之后的流血。在所有情况下，通过解毒剂(例如，本发明的蛋白质调节剂)对于化合物的抗凝血剂作用的急性反转允许改善的、以及很可能的更安全的、对于抗凝血剂或者抗血栓形成化合物的药物控制。同样地，在处于抗血栓形成的病人巻入意外伤害或者遭受颅内出血以及失血而不能被停止的时候，本发明的UAs可被使用。本发明的UAs可被用于想要控制NAM活性的任何情况。耙向至抗血栓形成的和抗凝血剂NAMs仅仅是一个例子。本发明的UAs还可以用于，例如，调节(例如，逆转)那些靶向至白细胞介素的NAMs的免疫抑制作用，例如，在易受传染的病人中。该UAs可用于，例如，逆转那些靶向至处于自身免疫性发展风险中的病人体内的CTLA4的NAMs的免疫剌激作用。本发明的UAs还可以用来抑制那些激活免疫系统的NAMs。如果，例如，由于NAMs与免疫激活细胞结合起来而导致的过度激活免疫反应，病人因此进入全身性休克，本发明的UAs可用于逆转该效果。本发明的UAs可用于调节(例如，逆转)NAMs的效用，该NAMs靶向至涉及在骨骼肌和/或自主神经节(例如，烟碱的乙酰胆碱或者烟碱性胆碱功能受体)进行神经冲动传送的受体。可以生产这样的NAMs，以便在麻醉期间引起肌肉松弛或者瘫痪。那些阻碍乙酰胆碱受体活性的试剂(那些产生神经肌肉阻抑的试剂)通常用在外科手术期间，最好是用在病人在外科手术之后，使肌肉机能可以尽快彻底恢复，以便减少并发症，并且改善病人在手术场地的周转。因此，已经做出了许多努力去生产具有可预测的药物动力学的试剂，以使试剂活性持续时间与外科手术操作的预期持续时间相匹配。另外地，本发明的UAs可用于对神经肌肉阻断剂活性提供所期望的控制，并且因此减少对于病人生理机能的依赖以提供神经肌肉阻滞剂的反转。本发明的UAs可用于调节(例如，逆转)那些耙向至生长因子(例如PDGF或者VEGF)的NAMs的效用。这样的NAMs可被用于治疗肿瘤以及治疗炎症性增生性的疾病。既然生长因子在正常细胞生存以及增殖中具有系统性作用，如果不紧密地调控，NAM治疗可以导致健康的组织被破坏(例如，接受靶向至血管生成素I的NAM的病人容易出血)。本发明的UAs可用于提供必要的调控。本发明的UAs可用于调节(例如，逆转)那些靶向至小分子，例如葡萄糖的NAMs的效用。使用本发明的调节剂可以避免在接受葡萄糖靶向的NAMs以便调节葡萄糖吸收的病人中的低血糖。该UAs还可以用来调节直接针对E2F家族成员的NAMs的活性，该家族中的某些是原增生性的，该家族中的某些是抑制性的。本发明的UAs可用于在细胞周期中想要的时刻"关掉"这样的NAMs。本发明的UAs还可以用来逆转带有放射性的或者细胞毒素性部分的NAMs与耙组织(例如，肿瘤组织)的结合，例如，促进此类部分从病人组织中的清除。类似地，本发明的UAs可用于逆转标记有可检测的部分(使用在，例如，成像或者细胞分离或者分类)的NAMs与靶细胞或者组织的结合(参见，一般地，Hicke等人，J.Clin.Invest.106:923(2000);Ringquist等人，Cytometry33:394(1998))。这些反转可用于加快可检测的部分从病人组织中的清除。本发明的UAs还可以用于体外环境以便调节(例如，抑制)NAM(例如，适体，等等)对于靶分子的效用。例如，本发明的一种UA可用于调节(例如，逆转)NAM对于存在于靶分子混合物中的一种特定靶分子的效用。本发明的UAs可以配制成为药物组合物，其可以包括，除该UA之外，制药上可接受的载体，稀释剂或者赋形剂。该组合物的确切特性将依赖于，至少部分地，该UA的性质以及给药途径。本领域技术人员可以容易地确定其最恰当的剂量，并且可以随UA、病人以及所寻求的效果而变化。一般地，视情况而定该UA可以IV，IM，IP，SC，或者局部地形式给药。此外，因为该解毒剂的活性是持久的，一旦达到了通过该解毒剂而对NAM调节的想要的水平，可以终止输注该解毒剂，听凭剩余的解毒剂净化该人或者动物。如有需要，允许利用NAM对人或者动物作后续重复处理。引入包括编码蛋白质性质UA的序列的构建体后，本发明的蛋白质性质的UAs还可以在活体内生产(Harrison,BloodRev.19(2):111-23(2005))。本发明的某些方式将在下面以非限制性例子的形式更加详细地进行说明。说明APTT以及其它凝结测定的文献:Quinn等人，J.Clin.Lab.Sci.13(4):229-238(2000)在此引用作为参考。这些综述描述了各种各样的凝结测定的参数以及生物化学机理，包括APTT、PT以及凝血酶时间测定，以及它们在诊断凝血病中的应用。实施例1数百万的个体已经接受了鱼精蛋白，一组正电性的蛋白质，以便逆转肝素的血液稀释效果，特别是在心肺转流术手术之后。关于一种结合人凝血酶的RNA适体的晶体结构的研究显示，适体在类似的位置与凝血酶结合起来，正如同肝素一样。既然肝素的活性可以利用鱼精蛋白来逆转，为了检验适体也许具有其他的类似于肝素的性质的假设，进行了一项研究以便确定是否适体活性可以用鱼精蛋白来中和。为了检验这种可能性，利用两个不同的适体对人血浆进行抗凝固处理，一个适体针对人因子IXa(命名为CH-9.3t(37nt，2'氟嘧啶修饰的ssRNA分子，并在5'末端上具有一个胆固醇部分，3'idt)9.3t(除没有载体之外和CH-9.3t—样))以及第二个适体针对人因子Xa(命名为11f7t(37nt长，2'氟嘧啶修饰的RNA分子))。如图1所示，正如同在aPTT分析中测量到的，对人血桨添加适体(150nMCh9.3t和250nM11f7t)显著地增加了凝固时间。就因子IXa适体来说，凝固时间从大约34秒的基线值增加到大约87秒(图1A)。在已经利用因子IXa的适体抗凝固之后，对血浆添加鱼精蛋白(2.5iig)会在添加之后5分钟内使凝固时间回复正常。这一逆转至少维持一小时。类似地，在aPPT分析中，因子Xa的适体(250nM)将正常人血浆的凝固时间从大约28秒增加到大约97秒。如图1B所示，鱼精蛋白(2.5iig)的给药在5分钟内完全地逆转了因子Xa适体的活性(也参见图2)。实施例2表2包括了源于UA对照适体实验的数据摘要(参见上面的实施例l(Bi-9.3t)(37nt，2'氟嘧啶修饰的ssRNA，在5'末端上具有生物素))。表2-普通的解毒剂对比适体实验<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>的变量敏感，大量研究显示它对某些血小板受体缺陷(主要是GPIb-IX-V以及GPIIbIIIa)以及VWF缺陷最敏感(参见图3)。实施例4实验的细节将家猪(2.5-3.5kg)随机地分配到治疗组。对于所有组，通过氯胺酮(22mg/kg)以及乙酰丙嗪(1.lmg/kg)的肌肉注射诱发麻醉。将一个导管放入耳静脉中，通过它使用芬太尼维持麻醉，首先使用100g/kg的快速注射，然后使用60gkg—1h—1的连续输注。然后给猪插管并且机械地通气。放置食道的或者直肠的温度探针以及SP02监视器之后，给股动脉以及静脉插套管。动脉的管路用作平均值以便连续地监视平均动脉血压和心率，以及为了ACT的评估而除去血样。在确定基线ACT值之后，静脉管路用来施用因子IXa适体(0.5mg/kg)。在适体给药之后5、15和30分钟时从动脉的管路吸取血样。利用HemochronJr.SignatureMicrocoagulationSystem(ITC，EdisonN.J.)测量ACT值。对于包括解毒剂给药的实验，在适体注射30分钟之后通过股静脉导管施用40毫克鱼精蛋白(lOmg/mL)超过五分钟。对于所有的动物，在适体给药之后的35、40、55、60、75和90分钟采集连续的血样。所有的数据点在每个动物中重复做两次。在实验结束时，通过股静脉使用正丁巴比妥(175mg/kg)对家猪实施安乐死。根据由国家健康研究中心出版的关心和利用实验动物指南，所有的动物接受人道的治疗，正如同Duke大学动物关心和利用委员会批准的那样。题在一些心血管手术的操作期间，立即的抗凝作用和迅速的逆转是必要的，最常见的是心肺转流术(CPB)，这正如同在冠状动脉旁路移植术(CABG)期间使用的。没有有效的抗凝作用将会形成血液凝块，并且血液不会在身体外的回路中循环。无论如何，经过手术过程后，这些值必须回到治疗前的水平，以便防止从外科手术位置的大出血。在体外利用APTT成功地确定鱼精蛋白能逆转因子IXa和因子Xa适体的活性至少60分钟之后，在活体内检验了鱼精蛋白逆转适体抗凝作用的能力。如图4A所示，使用0.5mg/kg的因子IXa适体成功地对家猪实施了抗凝固，这一点通过从105秒之后的ACT的一个立即的增加而证明。在没有施用解毒剂的时候，抗凝作用的水平逐渐地减少，与分子的90-分钟半衰期一致(Rusconi等人，Nat.Biotechnol.22(1):1423-1428(2004))。然而，施用10mg/kg的鱼精蛋白(大约每只动物40mg)，在五分钟之内由ACT测量的凝固时间迅速地回到治疗前的基线水平，显示出对抗凝作用的彻底逆转(图4B)。另外，这一逆转在整个实验时期内是持久的(至少一个小时)，逆转后获得的所有ACT值都低于足够的抗凝作用所需要的水平(图4C)。因此，因子IXa适体的快速注射导致立即的抗凝作用，其被鱼精蛋白成功地逆转。实施例5为了逆转适体的功能，解毒剂不得不通过高度的亲合力与适体结合而能与靶蛋白竞争。通过等温的滴定量热法(ITC)已经研究了适体9.3t与大量聚合物和多阳离子分子的结合亲合力。在测量中，UA溶液通过计算机控制的微量调节注射器在PBS中的298K滴定进入适体9.3t。结合常量以及一些热力学参数概括在表3中。在所选定的聚合物之中，PAMAM树枝状聚合物，PPA-DPA30k以及PLL显示了与适体9.3t显著的亲合力；然而，在8.47X105M—'条件下适体9.3t与PPA-DPA8k的结合常数是低得多的。没有观察到对于天然的聚胺、精胺以及亚精胺的显著结合。这些结果与体外以及体内研究一致，这些研究显示具有对于适体的强大亲合力是通用解毒剂的基本的标准。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>通过利用来源于MicroCal，LLC的恒温的以及完全电脑操作的MCS-ITC热量计实施等温的量热法测量(ITC)。在298K下超过2个小时的时间内每5分钟滴定10yL的等量部分进入量热的单元。为了每个系统研究进行空白试验，其中滴定剂被滴定入仅仅包含PBS的单元以便允许对于由于已造成的稀释导致的热效应进行校正。利用Origin5.0软件包的定制化ITC模块以及最小二乘法拟合程序进行数据分析以便使数据适合于恰当的结合模型。权利要求一种调节与靶分子结合并且引起药理学功效的核酸分子(NAM)活性的方法，所述方法包括在通用解毒剂(UA)结合至所述NAM并且修饰所述NAM与所述靶分子之间的相互作用的条件下，使所述NAM与通用解毒剂(UA)接触。2.根据权利要求l的方法，其中所述方法是逆转或者抑制所述NAM的活性的方法。3.根据权利要求1的方法，其中所述NAM是适体、siRNA、microRNA、核糖酶或者antagomir。4.根据权利要求3的方法，其中所述NAM是适体。5.根据权利要求l的方法，其中所述靶分子是肽，蛋白质，糖蛋白，聚糖或者核酸。6.根据权利要求5的方法，其中所述靶分子是酶，激素，受体，粘着分子，代谢产物，或者辅助因子。7.根据权利要求5的方法，其中所述靶分子是因子VIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，凝血酶或者蛋白质C。8.根据权利要求1的方法，其中所述UA是制药上可接受的带正电荷的蛋白质，脂质，或者天然的合成聚合物，或者其制药上可接受的盐。9.根据权利要求8的方法，其中所述UA是鱼精蛋白或者其片段。10.根据权利要求1的方法，其中所述UA逆转所述NAM的免疫系统激活效应。11.根据权利要求2的方法，其中所述UA逆转所述NAM的抗凝血剂与抗凝血酶功效。12.根据权利要求2的方法，其中所述UA逆转所述NAM的免疫抑制功效。13.根据权利要求2的方法，其中所述UA逆转所述NAM的乙酰胆碱受体阻碍活性。14.根据权利要求l的方法，其中所述接触是在活体内实施。15.根据权利要求14的方法，其中在对需要的病人给药之后，所述UA是在活体内生产，其中构建体包括编码所述UA的核酸序列。16.根据权利要求15的方法，其中所述UA是鱼精蛋白，并且所述NAM是针对人因子IXa或者人因子Xa的适体。17.根据权利要求14的方法，其中所述接触是在哺乳动物中实施的。18.根据权利要求17的方法，其中所述哺乳动物是人。19.一种筛选候选UA的方法，包括使试验化合物与NAM接触并且测定所述试验化合物是否与所述NAM结合，其中与所述NAM结合的试验化合物是候选UA。全文摘要本发明涉及试剂，其调节核酸分子的药理学活性，特别地，该试剂以不依赖于序列的方式结合治疗性或者诊断性核酸分子，并且调节(例如，抑制或者逆转)它们的活性。本发明也涉及包括这样的试剂的组合物及其用法。文档编号C12N15/85GK101702917SQ200880017825公开日2010年5月5日申请日期2008年3月31日优先权日2007年3月30日发明者凯姆·里恩,布鲁斯·A·撒兰格,汤·苏特鲁比·兰姆,沙巴·昂尼申请人:杜克大学