编码疟疾抗原的腺病毒载体的制作方法

专利名称：编码疟疾抗原的腺病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够引发抗疟原虫生活周期中红细胞前期的免疫应答的重组腺病毒 载体。具体地，本发明提供了一种编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)之抗原的 重组猿腺病毒载体，并且还提供了包含所述载体的免疫原性组合物(例如疫苗)以及使用 这些组合物的方法。
背景技术：
疟疾一直是世界上的一个重大健康问题。据估计至少有30亿人(几乎是世界人口 的一半)生活在疟疾流行地区，每年报告有3亿到5亿的临床病例，约150万死亡病例[1]。 对有效疫苗的开发将是有助于减少此疾病问题的重要成果。红细胞前期疫苗接种法已在临 床试验中显示出一些效力，其具有针对此阶段疟疾生命周期中子孢子和随后的肝内裂殖体 的免疫性[2]。细胞免疫应答先前已显示出在红细胞前期免疫中的重要性，其中CD8+T细胞 和IFN γ的产生在抗肝脏阶段疟疾的保护中起着重要作用[3]。血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)是在子孢子上表达的抗原，其先前已显示 出诱导保护性CD8+T细胞应答[4]。TRAP已在疫苗临床试验中以融合蛋白质的形式进行了 广泛地试验，所述融合蛋白质是与含有来自数种疟疾抗原的其它B细胞、CD8+和CD4+T细 胞表位的多表位串融合的蛋白质，称为ME. TRAP[5,6]。在本领域中，已对基于质粒DNA或经修饰安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus Ankara, MVA)的编码ME. TRAP抗原的疫苗载体进行了试验(Moorthy等(2004) PLoS， Med 1(2) :e33)，显示出在引发-加强方案中使用时诱导高频率的效应T细胞。尽管如此，仍需要能够在人对象中预防恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)自 然感染并能够诱导更强的T细胞应答(尤其是CD8+类型)的改进的抗疟疾疫苗。在ME. TRAP 作为在DNA和痘病毒载体(例如MVA和鸡痘病毒)中插入物的临床试验中，应答主要是CD4+ 类型，其相比于CD8+T细胞应答很可能保护性较小。人血清型5的腺病毒载体先前已被用于约氏疟原虫(P. yoelii)小鼠疟疾模型，并 且已显示出突出的免疫原性和仅仅单次给药后的有效保护[7]。但是，妨碍此血清型用于 人体的一个主要限制是普遍存在AdH5，频繁的儿童期感染导致血清转化。为了避免预先存 在对AdH5的免疫性的问题，对利用不在人群中循环的猿来源的腺病毒血清型的兴趣正在 增加，许多研究证明了这些载体在SARS[8]和HIV[9，10]的小鼠和非人灵长类模型中引发 ⑶8+T细胞应答的能力。

发明内容
本发明现已表明，编码ME. TRAP抗原的猿腺病毒载体(特别是那些来源于黑猩猩 腺病毒分离株AdCh63的)可在长时间内引发CD8+T细胞应答以及抗TRAP的高效价抗体应 答。另外，可通过随后施用编码相同转基因的MVA载体来加强免疫原性，在恒河猴(一个用 作良好预测可能人免疫原性的物种)中观察到强免疫原性。还已经在人I期临床研究中证明了免疫原性。在小鼠攻击(challenge)模型中使用编码ME. TRAP的AdCh63载体进行研 究的保护效力出人意料地大于其它腺病毒载体。此小鼠模型中的效力在本领域中广泛地用 作对人中效力的有用的预测性指标。在一个方面中，本发明提供了一种重组复制缺陷型猿腺病毒载体，其编码包含血 小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的抗原。 在一个实施方案中，所述猿腺病毒载体包含猿腺病毒基因组，其中稳定整合了编 码至少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因，所述调节序列指导所述转基因在哺乳动 物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细 胞表位。在一个实施方案中，所述猿腺病毒基因组是黑猩猩腺病毒载体的基因组。在一个具体的非限定性实施方案中，所述猿腺病毒基因组可以是黑猩猩腺病毒分 离株63(AdCh63)的基因组。还可使用载体AdC68(也称为AdC9)或AdCh3载体，或者AdC6 或AdC7载体，但优选AdCh63载体。因此，本发明尤其涉及编码包含血小板反应蛋白相关粘 附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位之抗原的重组复制缺陷型AdCh63载体。在本发明的所有实施方案中，由所述猿腺病毒载体编码的抗原可包含ME. TRAP或 由其组成。在一个具体的非限定性实施方案中，本发明提供了一种编码ME. TRAP的重组复制 缺陷型猿腺病毒载体(尤其是AdCH63载体)，其中ME. TRAP的表达由调节序列驱动，所述调 节序列包含人CMV IEl基因的启动子以及包括内含子A在内的人CMV IEl基因的5'非翻 译区域的片段(在本文中也称为“长”HCMV启动子)。在第二个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含与一种或多种可药用 赋形剂、载体、稀释剂或佐剂相混合的根据本发明第一方面的猿腺病毒载体。在一个相关方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含与一种或多种可药用赋 形剂、载体、稀释剂或佐剂相混合的根据本发明第一方面的猿腺病毒载体。在一些具体的非限定性实施方案中，本发明提供了一种包含编码ME. TRAP的重 组复制缺陷型猿腺病毒载体(尤其是AdCH63载体)的免疫原性组合物或疫苗组合物，其 中ME. TRAP的表达由所述“长”HCMV启动子所驱动。在一个具体的非限定性实施方案中， 所述免疫原性或疫苗组合物包含所述腺病毒载体，其配制于IOmM组氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaClUmM MgCl2^O. 1% PS80.0. ImM EDTA、0. 5% 乙醇，pH6. 6 中，其适于皮内施用给人对象。在第三方面，本发明提供了一种在人对象中引发针对血小板反应蛋白相关粘附蛋 白(TRAP)的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用包含编码TRAP之重组猿腺病毒载体 (根据本发明第一方面)的免疫原性组合物或疫苗组合物，其数量足以引发所述对象中抗 TRAP免疫应答。在一个实施方案中，以单剂免疫接种的方式施用所述免疫原性或疫苗组合物。在第四方面，本发明提供了一种在人对象中引发针对血小板反应蛋白相关粘附蛋 白(TRAP)的免疫应答的方法，其包括i)给所述对象施用引发剂量的免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含编码TRAP 的重组猿腺病毒载体(根据本发明的第一方面)；和ii)给同一对象施用加强剂量的包含非腺病毒载体的免疫原性或疫苗组合物，所述非腺病毒载体编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)之抗原，其中所述加强剂 量在所述弓I发剂量后至少两周施用。在一个实施方案中，所述加强剂量可以在所述加强剂量后八周施用。如果需要，可以将一个或多个另外的加强剂量施用给同一对象，以优化在该对象 中引发的免疫应答。在一个实施方案中，步骤ii)中施用的所述非腺病毒载体是重组痘病毒载体，例 如经修饰安卡拉痘苗(MVA)。在第五方面，本发明提供了一种产品组合或药盒，其包含
i)包含编码含有TRAP或其至少一个T细胞表位之抗原的猿腺病毒载体的引发组 合物，和ii)含有非腺病毒载体的加强组合物，其中所述非腺病毒载体也编码血小板反应 蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位。所述引发组合物优选包含猿腺病毒载体，其包含其中稳定整合了编码至少一个与 调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指导所述转基因在哺 乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一 个T细胞表位。在一个实施方案中，所述引发组合物和所述加强组合物可以都编码包含血小板反 应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的相同抗原。在一个具体的非限定性实施方案中，所述引发组合物和所述加强组合物可以都编 码 ME. TRAP。在又一个方面，本发明提供了一种用作疫苗的编码包含TRAP之抗原的重组复制 缺陷型猿腺病毒载体，特别是提供了一种包含其中稳定整合了转基因的猿腺病毒基因组 的猿腺病毒载体，所述转基因编码至少一个与调节序列有效连接的抗原，所述调节序列指 导所述转基因在哺乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白 (TRAP)或其至少一个T细胞表位。本发明还提供了编码包含TRAP之抗原的重组复制缺陷型猿腺病毒载体、尤其是 包含其中稳定整合了编码至少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因 组的猿腺病毒载体在制备用于在人对象中引发对血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)的 免疫应答之药物中的用途，所述调节序列指导所述转基因在哺乳动物细胞中表达，其中所 述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位。本发明还提供了编码包含TRAP之抗原的重组复制缺陷型猿腺病毒载体、尤其是 包含其中稳定整合了编码至少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因 组的猿腺病毒载体在制备用作抗疟疾疫苗的药物中的用途，所述调节序列指导所述转基因 在哺乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至 少一个T细胞表位。


图1显示了基于编码抗原ME. TRAP之黑猩猩腺病毒载体AdCh63的本发明示例性 腺病毒载体的构造。图Ia显示质粒pSG2ME-TRAP。图Ib显示通过利用AfeI和Sail消化从pSG2ME-TRAP上切下的4. 7kb片段。此片段含有HCMV启动子、内含子A、METRAP和BGH polyA序列。图Ic显示带有在HCMV和BGHpA控制下的丙型肝炎病毒的非结构区域(NS)的 preChAd63NSmut接受载体。图Id显示含有ME-TRAP抗原的前质粒pChAd63。图2显示了单次引发后AdCh63ME. TRAP的免疫原性。用1Χ101(ινρ的编码ME. TRAP 的猿腺病毒载体AdCh63和AdC9免疫接种了 6-8周龄的BALB/c小鼠。在免疫接种后第7、 12和60天，通过ELISpot分析血中的免疫原性。图3显示编码ME. TRAP的猿腺病毒载体AdCh63和AdC9对寄生虫攻击的无菌保护 和效力。用腺病毒(IXIOicVP)载体免疫接种了 BALB/c小鼠，然后在14天(η = 6)和60天 后(η = 6)通过静脉内施用1000个伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)子孢子进行攻击。
图4显示腺病毒-MVA引发-加强方案的免疫原性。用(5 X IO9Vp)编码ME. TRAP的 猿腺病毒载体AdCh63和AdC9免疫接种了 BALB/c小鼠。8周后，用MVA ME. TRAP (1 X 107pfu) 再次免疫所有小鼠，14天后通过流式细胞术评估(a)，在加强后63和182天通过ELISpot 评估T细胞应答(b)。在用MVA加强后28天还通过ELISA对IgG抗体的诱导进行了定量
(C)。图5显示腺病毒-MVA引发-加强方案对寄生虫攻击的无菌保护和效力。最 初用腺病毒(5X109vp)载体免疫接种BALB/c小鼠，随后在8周后用编码ME. TRAP的 MVA(IXlO7Pfu)加强。在14(a),63(b)和182(c)天后，通过静脉内施用1000个伯氏疟原 虫子孢子攻击小鼠。图6显示在恒河猴中AdCh63ME. TRAP引发、MVA ME. TRAP加强方案的免疫 原性。用AdCh63ME. TRAP (5 X 1010vp)肌内和皮内免疫接种恒河猴，在8周后用MVA ME. TRAP (2X 108pfu)加强。免疫后在血液中进行离体IFN γ ELISPOT (a)，经Ad-引发及 MVA-加强的免疫应答动力学显示血液中整体ME. TRAP应答(b)，在引发后第四周和加强后 第一周对跨越ME. TRAP整个序列的肽库的IFNy应答(c)。图7显示了在恒河猴中测试的两种不同的AdCh63ME. TRAP引发、MVA ME. TRAP力口 强方案。时间(T)以周计。在每一种情况下，引发疫苗均是AdCh63ME.TRAP(肌内或皮内施 用 5X IOicVp),8 周后用 MVA ME. TRAP(皮内施用 2X 108pfu)加强。图8也显示了在恒河猴中AdCh63ME. TRAP引发、MVA ME. TRAP加强方案的免疫原 性，其比较了 TRAP T细胞应答和抗体效价。图(a)显示在所附实施例中利用IFNYELIspot 测定的对TRAP肽库在所述接种疫苗研究时间过程的TRAPT细胞应答(T =以周计的时间)。 组1的对象接受8周和24周时MVA ME. TRAP的加强给药，而组2则接受8、16和24周时 MVA ME. TRAP的加强给药。使用AdCh63ME. TRAP进行单次免疫接种产生了约1000SFU/百万 PBMC的强T细胞应答。图(b)显示针对TRAP蛋白而测量的7个个体的抗体效价时程，证明 了用AdCh63ME. TRAP疫苗接种并用MVA ME. TRAP加强诱导了强的抗体效价。图9显示在人对象中AdCh63ME. TRAP的I期临床试验中T细胞免疫原性的时程，通 过对与疫苗插入物重叠的15聚体肽库(T9/96TRAP15聚体)进行的IFN γ ELIspot以及对与 20聚体肽(T9/96TRAP 20聚体)重叠的相同序列进行的IFN γ ELIspot进行评估。还显示了 对代表异源恶性疟原虫(P. falciparum)株的20聚体肽(3D7TRAP 20聚体)的应答以及对 ME多表位串中短的主要九聚物疟疾肽表位串的应答(Gilbert等，Nature Biotech. 1997， Nov 15，1280-84)(ME)。
发明详述在下述段落中，更详细地描述本发明的多个方面。除非另有说明，与本发明的一个方面有关的被描述为优选的任何特征对于本发明的其它方面来说也是优选的。本发明人已经构建了表达异源抗原的猿腺病毒载体，所述异源抗原包含红细胞前 期疟疾(子孢子)抗原血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)，本发明人已观察到这些载体 在两个不同动物模型中能够引发强CD8+T细胞应答。使用表达TRAP抗原的猿腺病毒载体所 引发的T细胞应答水平出乎意料地高，特别是当在灵长类模型中进行测试时，这表明猿腺 病毒载体和TRAP抗原的组合在引发抗此红细胞前期疟疾抗原的免疫力上是特别有效的。因此，本发明的一个主要方面是提供一种重组复制缺陷型猿腺病毒载体，其编码 包含TRAP或其至少一个表位的抗原(优选TRAP的至少一个T细胞表位)。所述重组复制 缺陷型猿腺病毒载体通常包含其中稳定整合了编码至少一个与调节序列有效连接之抗原 的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指导所述转基因在哺乳动物细胞中表达，其中 所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位。腺病毒载体(尤其是猿腺病毒载体)是本领域中普遍已知的。多种复制缺陷型重 组猿腺病毒描述于WO 2005/071093中，其内容通过引用全文并入本文。本发明的猿腺病毒载体通常包含通过稳定插入转基因表达盒而修饰的猿腺病毒 基因组，所述表达盒包含编码TRAP抗原的核酸序列，所述TRAP抗原与能够指导所述TRAP 抗原在哺乳动物细胞中表达的调节序列有效连接。本发明的重组猿腺病毒载体通常是“复制缺陷型”，这意味着由于编码病毒复制所 必需的基因产物之基因的功能性缺失或完全移除，已使得它们无法复制。举例来说，可通过 移除El基因以及任选地E3区域和/或E4区域的全部或部分使得本发明的载体成为复制 缺陷型。所述猿腺病毒的天然E4区域可被人腺病毒的该区域如Ad5E4orf6所替换。“复制 缺陷型”猿腺病毒载体的一般特征是本领域中已知的，例如来自W02005/071093，其内容通 过引用并入本文。在一个特定的但非限定性的实施方案中，本发明的重组腺病毒载体可以基于黑猩 猩腺病毒分离株AdCh63。该特定病毒血清型是本领域已知的(例如来自WO 2005/071093), 但是之前从未被描述作为疟原虫属的红细胞前期TRAP抗原的疫苗载体。本发明人已观察 到表达TRAP抗原的AdCh63载体骨架的组合诱导出惊人的CD8+T细胞应答，并且具有引发 强TRAP-特异性抗体(IgG)应答的额外优点。本发明的载体可表达全长TRAP抗原或者其包含至少一个T细胞表位的片段。通 常，所述包含至少一个τ细胞表位的片段至少是9个氨基酸长，其可以是任意长度直至全长 的TRAP或ME. TRAP。例如，所述片段可以是9至200，或者9至100，或者9至50个氨基酸 长。T细胞表位在TRAP序列内的位置之前已在文献中进行过描述，并且是本领域技术人员 众所周知的。TRAP的示例性T细胞表位描述于下述出版物中Aidoo M, Lalvani A,Allsopp CE,Plebanski Μ,Meisner SJ,KrausaP,Browning Μ,Morris-Jones S,Gotch F,Fidock DA 等.Lancet. 1995 ；345 1003-7 ；Flanagan KL,Plebanski Μ,Akinwunmi P,Lee EA,ReeceffH, Robson KJ, Hill AV, Pinder Μ. Eur J Immunol. 1999 Jun ；29 1943-54 ；禾口 Flanagan KL, Plebanski Μ, Odhiambo K, Sheu Ε, MwangiT, Gelder C, Hart K, Kortok Μ, Lowe B, Robson KJ, Marsh K, Hill AV. Am J Trop Med Hyg. 2006Mar ；74 (3) :367_75，这些文献的内容通过引用全文并入本文，用于描述TRAP的已知T细胞表位。所述TRAP抗原可来源于任何疟原虫，但通常是来自于恶性疟原虫株的TRAP抗原。 所述TRAP抗原序列可来自于任何恶性疟原虫株，但是在一个特定的(非限定性的)实施方 案中，所述TRAP抗原来自于恶性疟原虫T9/96株。不同株的恶性疟原虫的TRAP抗原显示 高度的氨基酸序列同一性(通常在全长TRAP序列上大于90%)。因此，设想使用具有与恶 性疟原虫T9/96株的TRAP抗原的氨基酸序列同一性大于90%、大于95%或大于99%的任 何TRAP氨基酸序列。 TRAP抗原(或其T细胞表位片段)可单独表达或者与附加多肽序列共同表达，例 如作为融合蛋白。这些附加多肽序列可包含B细胞、⑶8+T细胞或⑶4+T细胞表位，尤其是 来自于除TRAP之外的恶性疟原虫抗原的B-细胞或T-细胞表位。一种特别有利的组合是 称为ME. TRAP的构建物，其包含与来自于其它红细胞前期恶性疟原虫抗原的B细胞、⑶8+T 细胞和CD4+T细胞表位的多表位串相融合的全长TRAP抗原(5、6)。文献中描述的(和SEQ ID NO :2所示的)ME. TRAP抗原含有来自恶性疟原虫T9/96株的全长TRAP序列。但是，应 理解此ME. TRAP构建物的TRAP部分可以被来自其它株恶性疟原虫的TRAP序列所替换。本 领域技术人员还会理解所述TRAP序列(和/或ME序列)可以被一个或多个氨基酸替换、 插入或缺失所修饰，而基本上不改变T细胞(或B细胞)免疫原性。在一个具体的非限定性实施方案中，所述ME. TRAP抗原可包含SEQ ID NO :2所示 的氨基酸系列或者由其组成。其它合适的TRAP抗原序列由Robson KJ等，Nature. 1988 ； 335 :79-82所描述，其通过引用并入本文。所述ME表位串由Gilbert SC等，Nat Biotechnol. 1997 ；15(12) :1280_4所描述，其通过引用并入本文。所述指导TRAP抗原表达的调节序列可包含转录起始序列、启动子序列或增强子 序列以及其组合。所述启动子序列通常是异源启动子(相对于腺病毒和所表达抗原均如 此)，并且可以是被真核RNA聚合酶(例如RNA polll)识别的任何启动子。优选的启动子是人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IEl)启动子，其由Chapman等 NAR, 19 :3979-3986所描述，其通过引用全文并入本文。此启动子可以以包含包括内含子A 序列在内的IEl基因的5'非翻译区片段的“长”形式使用，或者可以以不含内含子A序列 的“短”形式使用。通常，“长” CMV启动子是优选的，并且通常排除外显子B。但是，应理解 本发明并不限于使用所述“长"HCMV启动子来指导TRAP抗原的表达。可使用指导所述抗原 合适表达水平的其它异源启动子，包括表达水平基本上相当于使用所述HCMV “长”启动子 的启动子。合适的启动子包括例如小鼠CMV启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus, RSV)启动子、SV40早期/晚期启动子以及β肌动蛋白启动子。所述转基因表达盒(编码包含TRAP的抗原)通常还包含异源转录终止子序列。 可使用任何合适的RNAp0III终止子序列，例如BGH polyA序列。HCMV “长”启动子与BGH PolyA序列的组合是特别有利的，并且优选与AdCh63载体骨架一起使用。所述转基因表达盒(编码包含TRAP的抗原)通常被插入到猿腺病毒基因组的El 缺失区域中。但是，应理解所述转基因表达盒在所述载体中的插入位点的精确位置和方向 并不重要，只要1)所述转基因表达盒是功能性的，即在插入到腺病毒基因组后它能够指导 包含TRAP的抗原的表达，以及2)所述转基因的插入不妨碍腺病毒载体在合适宿主细胞系 中的复制和/或包装在感染性病毒颗粒中。
本发明的猿腺病毒载体通常以感染性病毒颗粒的形式提供和使用，所述颗粒包含 编码所述TRAP抗原的重组腺病毒基因组。可以使用细胞系在组织培养物中培养复制缺陷 型腺病毒，以产生高滴度的感染性病毒颗粒，所述细胞系反式提供了所缺少的对于病毒复 制和包装而言所必需的基因产物。可以将腺病毒骨架(基因组)序列克隆进细菌质粒载体 中，以便于使用标准重组DNA技术进行克隆和操作。这些质粒代表相应腺病毒载体的“分子 克隆”，其含有完整的重组腺病毒基因组。在对所述质粒载体进行限制性酶消化以移除细菌 序列并暴露出反向末端重复之后，所得核酸可用于转染合适的宿主细胞系，所述宿主细胞 系提供了病毒基因组序列所缺失的必需功能基因(例如El基因产物)，从而产生纯的重组 病毒颗粒。一个合适的例子是HEK 293细胞系，其支持El缺失腺病毒的生长。另一个合适 的细胞系是称为PerC6的细胞系。 尽管本发明主要涉及可以在免疫原性组合物(例如疫苗)中施用的重组猿腺病毒 颗粒，但是，应理解，包含在质粒载体形式中的带有稳定整合的TRAP(或ME. TRAP)表达盒的 猿腺病毒骨架的相应质粒载体也构成本发明的一部分。这些质粒载体可用于生产高滴度的 包含编码TRAP (或ME. TRAP)抗原之重组腺病毒基因组的腺病毒颗粒。免疫原件组合物本发明还提供了包含根据本发明第一方面的猿腺病毒载体的免疫原性组合物。这 些组合物通常包含感染性腺病毒颗粒形式的猿腺病毒载体，其与一种或多种可药用赋形 齐U、稀释剂、载体或佐剂相混合。在一个实施方案中，所述组合物可以是疫苗组合物，其适于人施用并且可用于引 发至少抗所述TRAP抗原的保护性免疫应答(例如通过⑶8+，经常是细胞毒性T细胞)。所述的有关本发明第一方面的猿腺病毒载体的优选特征也适用于本发明的组合 物。本发明的组合物通常被配制成液体剂型，其包含在合适液体载体中的腺病毒颗 粒，所述载体例如水性载体如IOmM组氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaClUmM MgCl2、0. 1% PS80、 0. ImM EDTA、0. 5%乙醇，pH6. 6，不含内毒素的PBS或者任意其它合适的载体。优选剂型被 配制成用于肌内或皮内施用，但是不排除其它给药途径，例如经口、静脉内、粘膜、透皮等。 用于人施用的免疫原性组合物或疫苗组合物通常含有滴度在1-3X IO11vPAiI的病毒颗粒。引发免疫应答的方法可将包含本发明猿腺病毒载体的组合物施用给人对象，以引发针对所编码TRAP 抗原的免疫应答。本发明人已表明，本发明的载体(特别是编码ME.TRAP抗原的AdCh93 或AdC9载体)可在动物模型中引发强CD8+T细胞应答。尤其是在小鼠攻击模型中使用编 码ME. TRAP的AdCh63载体所显示出的保护效力出人意料地大于其它腺病毒载体。在此模 型中的效力在本领域中被广泛人为是可用作对人效力的有用的预测性指标，因此包含编码 ME. TRAP之AdCh63的疫苗可用于保护人对抗疟疾。事实上，本发明人已经证明了包含编码 ME. TRAP之AdCh63的示例性疫苗在人中具有免疫原性。因此，本发明提供了根据本发明的组合物(尤其是包含编码ME. TRAP抗原之 AdCh63载体的组合物)以单次免疫接种的形式或更广泛给药方案(例如引发-加强方案) 之一部分的形式向人对象的施用。接受本发明猿腺病毒载体免疫接种的人对象可以是希望对疟疾免疫的任何人对象。对于单次免疫接种方案，对象通常将接受1 X IO8至5X IOki病毒颗粒的剂量。此 剂量一般是皮内施用，但也不排除涉及其它剂量和给药途径的其它治疗方案。引发-加强方案通常包括在第一时间点施用引发剂量的表达包含TRAP(尤其是 ME. TRAP)之抗原的重组猿腺病毒，然后在第二时间点施用加强剂量的编码包含TRAP(或 ME. TRAP)之抗原的非腺病毒载体。所述第一和第二时间点间隔至少两周，通常间隔约8周。
用于施用加强剂量的非腺病毒载体可以是编码包含TRAP (或ME. TRAP)之抗原的 任何非腺病毒载体。合适的实例包括病毒载体，特别是重组痘病毒载体(例如MVA)以及质 粒DNA载体。优选的(但非限定性的)组合利用编码ME. TRAP抗原的重组AdCh63进行引发给 药，利用编码ME. TRAP的MVA进行加强给药(例如剂量范围为1 X IO7至1 X 108pfu)。在一 个优选的(但非限定性的)方案中，两次给药都是皮内施用，并且引发给药和加强给药的间 隔为8周。通过本文所述的疫苗和接种方案诱导的T细胞可用于预防或治疗疟疾。但是它们 还有其它用途。它们可用于产生用于疟疾诊断的试剂，例如使用T细胞来诊断疟疾感染。或 者，所用的T细胞可能在用于疟疾免疫疗法的T细胞转移方案中是有价值的。另外，可将免 疫接种后个体产生足够免疫应答的能力用作免疫能力的度量，以排除特定的免疫或遗传缺 陷。参考下列非限定性实验实施例会进一步理解本发明。实施例1AdCh63ME. TRAP 载体的产生AdCh63ME. TRAP是表达ME-TRAP的复制缺陷型腺病毒载体，其用于疫苗接种以预
防疟疾。AdCh63ME-TRAP由下列组成猿腺病毒，含有表达一系列已知细胞毒T细胞(CTL) 的基因序列的黑猩猩腺病毒血清型63，与完全红细胞前期抗原即血小板反应蛋白相关粘附 蛋白(TRAP)融合的来自恶性疟原虫红细胞前期抗原的表位。构成ME-TRAP的‘多表位’部分的各个CTL表位代表多种潜在的保护性靶抗原，其 被包括在内以确保所接种人群中的大多数对疫苗的免疫应答。TRAP是高丰度的红细胞前期 抗原。接种了经照射的子孢子且被保护免受疟疾的人志愿者产生抗TRAP的T细胞应答，使 其成为用于包括在疟疾疫苗之中的有力候选者。疫苗插入片段的核酸序列显示为SEQ ID NO :1。使用质粒pChAd63ME-TRAP作为产生AdCh63ME_TRAP的起始材料。为了产 生此质粒，通过同源重组将ME-TRAP表达盒克隆进线性化的前腺病毒接受载体(pre adeno-acceptor vector)中。此质粒的构建示于图1中。用AfeI和SalI切割质粒pSG2ME_TRAP (图la)，切下4. 7kb的含有HCMV启动子、 METRAP和BGHpolyA序列的片段。将也含有HCMV启动子、内含子A和BGH polyA序列的所得ME-TRAP 4. 7kb片段 (图lb)重组进preChAd63NSmut接受载体中，所述载体带有在HCMV和BGHpA控制下的丙型肝炎的非结构区域(NS)(图lc)。PChAd63载体来源于克隆在质粒载体中的野生型黑猩猩 腺病毒63基因组，其在pChAd63病毒骨架的不同区域带有下述修饰1)病毒基因组的El区域(455bp至3421bp)缺失
2) 27207bp 至 31788bp 的 E3 区域缺失3) 33834bp 至 36216bp 的 E4 区域缺失4) 33319bp 至 34200bp 的 Ad5E4orf6 插入通过HpaI和SnabI的切割使得接受载体ChAd63 (c) NSmut线性化。通过在大肠杆 菌(E.coli)中的同源重组将ME-TRAP表达盒克隆进前腺病毒载体中。用约30ng线性化的 接受载体(AHpaI, ASnabI)和约 IOOng 消化的 pSG2ME_TRAP ( Δ AfeI、Δ Sail)共转染 BJ 5183细胞。在4. 7kb片段和前腺病毒ChAd63NSmut接受载体之间发生的重组导致4. 7kb片 段(含有HCMV启动子、ME-TRAP基因和BGH polyA序列)插入到腺病毒载体中，其利用了 HCMV启动子和BGH polyA序列之间存在的同源性。通过使用HindIII和EcoRI的限制性消 化分析鉴定了阳性克隆。图Id是含有ME-TRAP抗原的新型ChAd63载体的图。显示出了 HindIII和EcoRI 位点。通过限制性酶分析和测序进行了对质粒DNA的鉴定。对于含ME-TRAP的片段，在琼 脂糖凝胶电泳上观察到了预期的Hindlll-EcoRI限制性酶切特征。利用不同寡聚物进行了 测序分析，证实ME-TRAP插入片段的序列是正确的。原代病毒储液(PVS)的制备HEK 293细胞的制备I质粒DNA线性化丨转染引发腺病毒感染I收获腺病毒人胚肾293 (HEK 293)细胞系是经剪切的人5型腺病毒DNA转化的原代人胚胎肾 细胞的永生化细胞系。该细胞特别易感于人腺病毒，并且支持ElA缺失的复制缺陷型腺病 毒的生长。HEK 293 细胞获得自 BioReliance，Todd Campus, West of Scotland Science Park, Glasgow G200XA。HEK 293细胞系作为贴壁细胞培养。细胞在添加有谷氨酰胺和10%合格胎牛血清 (FBS)的DMEM中于无菌情况下培养，不添加抗生素。为产生PVS，利用化学成分确定的阳离子脂质体转染试剂Lipof ectamine 2000 (来自Invitrogen)将5 μ g PmeI线性化质粒DNA转染进对数期的HEK 293细胞(接 种后18小时)。限制性酶PmeI和特定缓冲剂购自New England Biolabs (NEB)。该缓冲剂中的 BSA确定为US来源。4个单位的PmeI (10000U/mL)用于线性化IygW DNA。使用无菌水来 稀释。将不含胎牛血清(FBS)的Dulbecco' s改良Eagles培养基(DMEM)用于转染阶段 (FBS的存在降低转染效率)。在第10天收获转染的细胞，此时观察到了最大细胞致病作用 (CPE)。通过三次冻融从细胞收获病毒，并与细胞上清液合并在10%无菌甘油中，最终体积 为4. lmL。将PVS小管速冻并保存在-80°C。将6个月的再次试验日期分配给此储备液。
前工作载体储备液A的制备将一管HEK 293细胞解冻，并在添加了谷氨酰胺的含10% FBS的DMEM中扩增，在 5次传代后产生2个Cellbind转瓶的均勻分散的贴壁细胞。在感染当天，使用重组胰蛋白 酶将1个转瓶中的细胞重悬，并计数。细胞密度为1.06X 105细胞/cm2。在113毫升接种体 中，用原始病毒储备液感染第二个转瓶中的细胞，感染复数(MOI)为0.64pfu/细胞。将所 需量的储备液病毒(1.25mL)在湿冰上解冻，并用细胞培养基(01^11加谷氨酰胺和2% 8幻 稀释至115mL。 将转瓶手动转动一次，然后置于设定在37°C的孵箱中以0. Irpm旋转的转瓶组上， 孵育48小时。每天检查转瓶CPE的存在。典型CPE伴随细胞的转动。检查对照细胞培养 物没有CPE。在一轮病毒复制并出现总CPE后(48小时)，收获病毒感染的转瓶。将病毒感染 的细胞轻轻重悬于培养基中，形成细胞悬液，然后以2000rpm在20°C离心15分钟使细胞沉 淀。除去上清，将细胞沉淀重悬于8. Oml的细胞裂解缓冲液(在CBF纯化水中制备的IOmM Tris, 135mMNaCl, ImM MgCl，pH7. 9)中。然后将细胞沉淀转移到50mL聚丙烯管中。将细胞 沉淀冻融三次(在IPA/干CO2浴中冷冻，然后在37°C水浴中解冻)。以3000rpm在4°C下 再次离心30分钟澄清细胞裂解物。以小的等分试样在-80摄氏度下速冻上清(细胞裂解 物)。从细胞裂解物中取样进行感染滴定(3. 34 X 108pfU/mL)。分析感染和未感染细胞上 清(均为100毫升)样品的生物负载(均为阴性)。工作载体储备液(WVS) 1和2的制备使用前工作载体储备液(前WVS)制备了工作载体储备液1 (WVSl)，并使用WVSl制 备了 WVS2。两者都包括在Cellbind转瓶中均勻贴壁的HEK293细胞中的一轮病毒复制。计 算WVS2的量使得每批生产使用彡10%的总WVS2。对于WVS1，使用14个转瓶的细胞密度为 1. 29 X 105/cm2的HEK 293细胞进行病毒扩增；对于WVS2，使用29个转瓶的1. 54X 105/cm2 的细胞密度。对于WVSl和WVS2来说，制备规格都是相同的。用添加谷氨酰胺和2% FBS的 DMEM将病毒接种物(分别为前WVS或WVS1)稀释至113mL/转瓶(对于WVS1)以及稀释至 20mL/转瓶保持2小时然后稀释至113mL/转瓶(对于WVS2)。最终MOI分别是1. 01 (对 于WVS1)和8.6pfu/细胞(对于WVS2)。将转瓶手动转动一次，然后置于设定在37°C的以 0. Irpm旋转的转瓶组上，分别孵育48小时和71小时。每天检查转瓶CPE的存在。两者的 方法中都包括了含未感染HEK 293细胞的阴性对照转瓶以用于对比和细胞计数。WVSl在感染后48小时收获，而WVS2在感染后71小时收获。将病毒感染的细胞轻 轻重悬于细胞上清中，形成细胞悬液，然后将其倾倒进离心管中，以2000rpm在20°C下离心 15分钟使细胞沉淀。除去细胞上清，将每个转瓶的各细胞沉淀重悬于8. Oml细胞裂解缓冲 液(10mMTris，135mM NaCl, ImM MgCl，pH7. 9)中。然后，将细胞沉淀悬液汇集到聚丙烯管中。 将管冻融三次(在IPA/干冰浴中冷冻，然后在37°C水浴中解冻)。通过在4°C以3000rpm 再次离心30分钟澄清所得细胞裂解物。合并含有病毒(WSV1或WSV2)的上清(细胞裂解 物)，取样，分为等分试样并在-80°C速冻。对于每种储备液制备112mL和236mL的终体积。制备AdCh63ME-TRAP的大量收获临床批次使用WVS2制备三批大量收获批次的AdCh63ME-TRAP。每个批次由来自WVS2的一 轮病毒复制组成。该过程类似于如上所述制备WVS2，初始接种20mL/转瓶，保持2小时，然后加满到113mL/转瓶的终体积，但是在细胞裂解过程中在第一次冷冻/融解循环后添加 Benzonase酶。如上所述用含2% FBS和谷氨酰胺的DMEM稀释病毒接种物(WVS2)，将其以 20毫升2-3pfu/细胞的MOI的量加入到HEK293转瓶中。将瓶手动转动一次然后置于设定 在37°C的孵箱中的以0. Irpm旋转的转瓶组上孵育共71小时。每日检查转瓶CPE的存在 情况，在总CPE出现后收获病毒感染的转瓶。将病毒感染的细胞轻轻重悬于培养基中以形 成细胞悬液。从每个转瓶中取出2. 5mL细胞悬液和上清的样品，并合并。将其标记为大量 收获前合并物批次1、2或3。取这些“大量收获”样品用于最终的合并，以产生用于工艺中 的腺病毒外部试验和用于逆转录酶的大量收获样品。然后在20°C下以2000rpm离心30分 钟将所剩悬液沉淀。除去细胞上清，将每个转瓶的细胞沉淀重悬于8. Oml的细胞裂解缓冲 液(IOmM Tris,135mM NaCl, ImM MgCl, pH7. 9)中。然后，将细胞沉淀悬液合并并分配到聚 丙烯管中。所述管经历一轮冻融(在IPA/干冰浴中冷冻，然后在37°C水浴中解冻)。最小 冷冻时间为30分钟。然后，在纯化前加入Benzonase酶以降解残余的宿主细胞DNA (每8mL 细胞裂解物1500个单位)。将细胞裂解物与Benzonase酶在20士2°C下在设置为全速的旋 转摇床上孵育25-35分钟，之后进行如上所述的另外两轮冻融。通过在4°C下以3000rpm再 次离心30分钟澄清细胞裂解物。使用无菌吸管取出细胞裂解物上清以测定合并的体积，分 为等分试样并在-80°C下速冻。进行下游处理以制备纯化的收获批次解冻 BHL(54_128mL)I CsCl分步梯度(1或2次运行/批次)ICsCl平衡梯度(1次运行/批次)I配制(缓冲液交换)I 稀释和聚集体过滤(0. 45 μ )I作为单个纯化批次速冻腺病毒颗粒在氯化铯(CsCl)中具有独特的密度，这使得其可以通过在Beckman Optima超速离心机中进行的密度梯度超速离心而从大多数污染物病毒以及宿主细胞蛋白 和DNA中纯化出来。缺少被包装DNA的病毒颗粒(空衣壳)可以与完整病毒粒子分离开来， 因为它们密度较小。通常，分步梯度超速离心之后，可见较低的“感染性”病毒颗粒条带，其 上面的条带含有空衣壳。通过平衡CsCl密度梯度超速离心20小时进一步纯化来自第一分 步梯度的收获物。纯化的批次量受到离心管和转子(Bechman SW40)可容纳的大量收获物 体积的限制。选择大量收获物批次等分试样的量使得该量适于转移到该处理，在每个纯化 批次开始时解冻合适量的大量收获物。将来自1和2初始分步梯度离心运行之间的病毒收 获物用作第二平衡离心步骤的起始材料。从而在一系列重复的纯化处理过程中进行大量收 获物批次的纯化。总共由3个大量收获物批次制得了初始的小批次(用于毒性和稳定性研 究)和10个纯化批次。
不连续CsCl超速离心在14mL超净离心管(Beckman)中使用3个不同的CsCl密度手工制备分步梯度。 在CBF纯水中IOmM Tris pH7. 9中制备氯化铯溶液。起初将2ml 1. 25g/L CsCl溶液添加 到每个管中，并用2ml 1. 35g/L CsCl形成底层。最后用最大密度的CsSl溶液(0. 5ml的 1. 50CsCl)形成底层。在1个小时使用时间内使用冷却的溶液制备分步梯度。将大量收获物批次细胞裂解物的各样品在冷水(4-10°C )中解冻。将约8. 5mL细 胞裂解物手动置于CsCl梯度的顶层。将管迅速(< 1小时)以ISOOOOg离心3小时。在 离心过程中，上方的细胞碎片区域、空衣壳材料的扩散带以及下方的感染性病毒的窄细条 带相分离。通过用与Iml注射器相连的16G水平针刺穿每个管的侧壁来收获下方的条带。 每个管平均收集0.6ml病毒，将其合并并且如果需要保存在4-10°C。最大保持时间是4小 时。平衡CsCl超速离心使用相同的离心管进行平衡超速离心。最初用6mL密度为1. 35的CsCl填充这些 管，并用1.0-1. 5mL收获自第一超速离心步骤的病毒合并物铺在其上层。将在注射用水中 制备的磷酸盐缓冲盐水加满作为缓冲液。以150000g在10°C下将病毒离心20小时。这得到 了扩散的模糊上方条带以及下方的完整病毒颗粒的窄细条带。还可观察到在该窄细条带两 侧各有一条模糊的条带。如上所述使用16G水平针和注射器收获感染性病毒颗粒的主要窄 细条带。每个管收获0. 5至1. OmL的病毒，在最后通过缓冲液交换配制之前将其在4-10°C 的冷盒中保存最多2小时。配制成最终缓冲液使用一次性聚丙烯预装PD-10柱，通过在S印hadex G25上色谱脱盐将CsCl纯化 的病毒合并物进行缓冲液交换至最终的配制缓冲液(A438)，所述PD-10柱含有8. 3mL在 水中的Sephadex G25，其中含有0. 15% Kathon作为抗微生物剂(GE Healthcare的A聚 体shamBiosciences部门)。在消毒前建立6倍柱体积的水洗条件，从柱洗脱液中除去> 99. 5%的 Kathon。水洗之后，用0. 5M氢氧化钠对柱消毒最少20分钟，使用5倍柱体积的磷酸盐缓冲 盐水中和氢氧化钠。最后，以配制缓冲液(3倍柱体积)配制缓冲液(A438) :10mM组氨酸、 35mM NaClUmM MgCl清洗柱。使用注射用水制备0. ImM EDTA.0. 5% (ν/ν)乙醇、7. 5%蔗 糖、0. 1% PS80pH6. 6。针对病毒样品(< 1. 5mL)和收集体积(< 2. 25mL)建立条件，使得 在终产品最大患者剂量中的最终CsCl浓度比相当于皮下注射氯化铯的大鼠LD50的经调节 重量还要低>61og。使用一系列柱5)进行每个纯化批次的缓冲液交换，从而可应用和 收集特定的体积。从每个柱收集作为单个级分的病毒峰，将这些级分合并以产生浓缩的纯 化批次。在质量控制(QC)病毒颗粒测定中，将该批次用冰冷的A438稀释至2-3X10"^/ mL，并用0. 45微米过滤器(Millipore Millex HV直径33mm PVDF盘式过滤器)过滤以除 去大的病毒聚集体。将每个纯化批次在异丙醇/干冰中速冻并保存在-80°C。最大保持时 间是配制后1小时。最终剂型置于0. 6mL玻璃瓶中。每瓶AdCh63ME_TRAP含有1. 3 X lO^vp/mL，其配 制于 IOmM 组氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaCl、ImMMgCl2、0. 1 % PS80、0. ImM EDTA、0. 5% 乙醇， pH6.6(此滴度由260nm下的吸收度测定)。AdCh63ME_TRAP的使用剂量通常是皮内施用IX IO8VP至5X IOltVp。相应于任何更新的浓度，所施用的体积可以不同。实施例2-测试AdCh63ME. TRAP载体
材料与方法免疫接种小鼠6至8周龄的雌性BALB/c小鼠购自牛津大学John Radcliffe医院的生物医学 服务单位，全部动物均符合英国内政部动物保护法案计划许可(Animals Act Project License)的条款。进行皮内免疫接种，其之前已显示出比其它途径(例如皮下、肌内)更好 地引发免疫原性[11]。以IX IOltl病毒颗粒(v. p.)的剂量施用腺病毒进行包括单次引发 的实验，以及以5X IO9Vp的较低剂量施用腺病毒进行引发-加强方案。以IXlO7Pfu的剂 量使用MVA加强T细胞应答。所有载体在免疫接种前均重悬于不含内毒素的PBS中。恒河猴中T细胞应答的免疫接种和分析通过三角肌中肌内注射(恒河猴id号0033、1029、2013和4073)以及皮内(id 号0043、2009和6015)两个不同途径施用5X IOicVp剂量的AdCh63ME. TRAP免疫接种恒河 猴。在8周后通过皮内免疫接种2X IO8Pfu剂量的MVA ME. TRAP对所有恒河猴进行加强免疫。通过用跨越整个ME. TRAP区域的4肽库刺激T细胞来进行离体IFN y ELISpot。通 过将各合并物的应答相加并减去仅含有DMSO的未刺激样品的背景值而计算得到总TRAP应答。病毒载体实验中所用的所有病毒载体AdCh63、AdC9和MVA表达如上所述的转基因 ME. TRAP [5、12]。如本文其它部分所述，插入片段ME. TRAP是2398bp的编码789个氨基酸的 蛋白质的杂合转基因。ME串含有位于许多其它B细胞和T细胞表位之间的BALB/c H_2Kd 表位Pb9[13]。如上所述构建并扩增猿腺病毒载体AdC9 (SAdV) [14]。如实施例1中所述进行AdCh63ME. TRAP的制备和载体生产。已经使用此方案成功 产生良好滴度的AdCh63，可基于替代的猿腺病毒载体骨架使用类似方案来产生ME. TRAP载 体。离体IFN γ ELISP0T在IPVH膜平板(Millipore)上培养ACK-处理的脾细胞或PBMC18-20小时，所述 平板具有终浓度为ι μ g/ml的优势免疫表位H-2Kd限制性表位Pb9(SYIPSAEKI)。如上所述 进行 ELISPOT [15]。ELISA如上所述通过ELISA分析了抗TRAP区域的IgG抗体[16]。对于该实验，在利用腺 病毒-MVA引发-加强方案免疫接种4周后，从至少3只BALB/c小鼠的组获得了血清。寄生虫攻击自雌性疟蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺中分离出伯氏疟原虫(Plasmodium berghei) (ANKA株系克隆234)子孢子(spz)。将寄生虫重悬于RPMI-1640培养基中，每个 小鼠通过静脉内途径接受总共lOOOspz。从第5至第20天，每天取血液样品；用吉姆萨对 涂片染色，并筛选红细胞内裂殖体的存在。存活定义为血液中完全没有寄生虫。统计分析
使用单向或双向ANOVA和Bonferroni验后检验分析流式细胞术样品的统计学 显著性° 使用 windows 下的 GraphPad Prism 4. 03 版(GraphPad Software, San Diego California, USA, www. graphpad. com)进行所有统计学检验。MM
小鼠中AdCh63ME. TRAP单次引发后的免疫原性单次免疫接种后，腺病毒载体能够诱导强的长期CD8+T细胞应答。图2显示了均 编码ME. TRAP转基因的AdCh63和AdC9之间的比较。转基因的ME串中优势免疫性H_2Kd 限制性表位Pb9(SYIPSAEKI)的存在使得我们能够评估所述病毒载体引发的免疫应答的效 力。我们实验室的结果表明AdC9是免疫原性最强的载体之一，其能够诱导强于人血清型 AdH5的⑶8+T细胞应答。图2显示AdCh63ME. TRAP在60天的时期内诱导类似于AdC9的应 答。在免疫接种7天后的早期，AdCh63⑶8应答明显高于AdC9，后来则没有观察到显著的差 异。任何病毒载体疫苗的重要目的是诱导强记忆性CD8+T细胞应答的可能性，在这一点上 AdC9和AdCh63ME. TRAP两种载体均显示出类似的免疫原性，甚至是在60天的长时间后。小鼠中对伯氏疟原虫攻击的保护该研究结果首次表明，用腺病毒载体单次免疫接种可在伯氏疟原虫子孢子攻击后 引发高水平的对疟疾的无菌保护。最初实验表明例如AdH5、AdC7和AdC9的载体在仅一次 免疫接种(以IXlOiciv. p.的剂量)后就能够保护高百分数的小鼠。图3显示免疫后不久 在第14天(a)和免疫施用和攻击之间60天的长时期后(b)AdCh63ME. TRAP与AdC9保护水 平的比较。尽管两种载体随时间表现出类似的免疫原性(图2)，但AdCh63ME.TRAP引发的 保护水平在两个时间点都超出AdC9。特别重要的是，我们发现在免疫接种后第14天的攻 击后，AdCh63保护所有小鼠免受感染达15天，在实验结束时6只小鼠中仅有1只小鼠被感 染。AdC9显示了较低水平的短期(图3a)和长期(图3b)保护。引发-加强方案已有报道称，与单次施用载体或用其它载体(例如DNA或FP9，然后用MVA)的引 发-加强方案相比，用AdH5引发并随后用编码相同转基因的MVA加强(A-M方案)增加了 免疫原性[11]。因此，我们测试了使用将猿腺病毒载体与8周后痘病毒载体MVA相组合的 引发-加强方案的方法。图4显示由AdCh63-MVA和AdC9_MVA方案引发的⑶8+T细胞应 答(图4a、b)和抗体应答(图4c)之间的比较。免疫接种后不久(图4a)，AdCh63显示了 高水平的CD8应答，尽管AdC9的应答更有效，但是没有发现统计学差异。对长期应答的分 析显示了引发-加强方案相对于单次引发的巨大优势。如图4b所示，CD8应答甚至在加 强后第60天仍保持很高(> 25000SFC/百万PBMC)，这与单次疫苗接种后同一时间点的水 平(< 10000SFC/百万PBMC，图2)形成了对比。MVA加强后6个月，免疫原性水平仍高于 10000斑点/百万PBMC，在两种所测试的猿腺病毒载体之间没有发现显著差异。尽管保护效力依赖于该体系中的细胞免疫应答，但腺病毒载体还提供了诱导强转 基因特异性抗体应答的额外优点[17]。由于抗体提供了除细胞免疫应答之外的额外保护， 此特征在该腺病毒用于人体中疫苗用途时可能非常重要。通过对A-M引发-加强方案引发 的IgG进行定量来评估了体液应答。如图4c所示，所测试两种方案的抗体应答很高，使用 AdCh63-MVA组合导致了比AdC9明显要高的IgG水平。因为引发-加强方案改善了免疫原性水平，所以利用依次疫苗接种的相同策略分析了无菌保护的水平(图5)。在两种方案中加强之后短时间间隔和长时间间隔时均发现了 显著的水平。但是，AdCh63-MVA方案在所测试的所有时间点均超出了 AdC9-MVA。有意思的 是，AdCh63-MVA方案在100%的动物中引发了短期的无菌保护。尽管该保护作用随时间而 降低，但是其仍保持高水平，甚至在加强免疫接种6个月后两种方案均惊人地诱导高水平 的保护(图5c)。恒河猴中的免疫原性 在许多现有技术的例子中，观察到在非人灵长类或人中测试时载体疫苗的效力与 小鼠中的应答相比出现降低。因此，在恒河猴中测试了类似于如上所述的在小鼠中的引 发-加强方案。用根据实施例1制备的5 X IOicVp剂量的AdCh63ME. TRAP疫苗免疫接种了 7只恒 河猴。皮内或肌内施用疫苗，但是在这些途径之间没有观察到免疫原性差异，如数据所示。 在使用AdCh63ME-TRAP免疫接种后的不同时间，进行使用异源病毒载体即编码ME-TRAP的 MVA的加强免疫接种(参见图7)。数据表明(图8)AdCh63ME-TRAP在恒河猴中具有很高的 免疫原性，恒河猴是一种被普遍认为可用于预测人体中疫苗免疫原性的物种。单次免疫接 种后，在ELISP0T测定中观察到平均T细胞应答为约1000SFU/百万PBMC，其为之前与此疫 苗插入物在人体中保护相关的水平(Webster等，PNAS 2005102 =4836-41) 0另外，免疫接种 诱导得到强的抗体效价。使用MVA的异源加强免疫接种可以将T细胞和抗体应答都提高到 甚至更高的水平。来自选定时间点的T细胞表型的有限分析表明CD8和CD4T细胞均被该 免疫接种方案所诱导，这些可能是表达Y干扰素、TNF和IL2的多功能细胞。如图6a所示，用AdCh63ME. TRAP引发产生强的T细胞应答，其在疫苗接种后第4 周达到峰值。令人感兴趣的是，除了一只(4073)之外的所有恒河猴都是幼年的，其体重为 3_4kg，而较年老且较重的动物No. 4073 (大于IOkg)则在引发后显示出特别好的免疫应答。 重要的是，可通过使用MVA ME. TRAP的随后免疫接种来加强T细胞应答，在比较引发的峰 值和加强后的峰值时，在一些例子中发现多达五倍的差异。在比较对跨越整个ME. TRAP区 域的肽库的免疫应答后，进行另外的观察。T细胞应答主要集中于AdCh63引发后的合并物 T2(图6b)。但是，MVA加强提供了在对ME. TRAP的免疫应答中宽度增加的额外优点，这时 并不主要集中在T2，而是针对整个ME. TRAP序列(图6c)。重要地，恒河猴中诱导的这些 强T细胞应答很可能是针对疟疾抗原所曾经诱导的T细胞应答中最强的，其比目前为止进 行的任何临床试验中对ME. TRAP所诱导T细胞应答都高得多。因为针对TRAP诱导的T细 胞应答的量级与人临床试验中所测得的保护的量相关(Webster等PNAS ;DimaChie et al Infection and Immunity)，所以我们预测此疫苗方案应该会比目前为止在人体中测试的 任何ME. TRAP疫苗更加有效。AdCh63ME. TRAP 在人中的用途已经在I期人临床试验中评价了猿腺病毒载体AdCh63ME. TRAP,以检验AdCh63ME. TRAP单次免疫以及包括上述腺病毒并随后8周后MVA加强的引发-加强方案在人中的安全 性和免疫原性。所招募的所有志愿者都是健康成年男性。因为这是首次在人中评价黑猩猩腺病毒 载体，第一组接种者接受IO8Vp的非常低剂量的疫苗。这可能与施用给恒河猴的5X IOltVp 的剂量形成对比，在先前人腺病毒载体疫苗试验中使用1-10X IOicVp的典型剂量。在此IO8Vp的低剂量时，最初的8个志愿者中局部和全身安全性都是优秀的。这些个体中有四 个接受了 2X IO8Pfu剂量的编码ME-TRAP的MVA的加强免疫接种。在图9中显示了作为平 均应答的这四个志愿者中T细胞免疫原性的时程。通过离体Y-干扰素ELISPOT测定了对 与疫苗插入物重叠的15聚体肽库即T9/96TRAP 15聚体以及对具有20聚体肽重叠的相同 序列即T9/96TRAP 20聚体的免疫原性。还显示了对代表异源恶性疟原虫的20聚体肽即 3D7TRAP 20聚体的应答。最后，ME显示了对ME多表位串中主要九聚物疟疾肽表位的短串 的应答(Gilbert 等，Nature Biotechnol. 1997Nov ；15 1280-4)。这些结果显示，即使在所用的非常低的剂量下，在人体中用AdCh63ME-TRAP单次 免疫接种4周后也观察到可检出的对TRAP的T细胞应答。另外，这些应答可通过MVA疫苗 强烈地加强，表明通过腺病毒载体在人体中引发记忆T细胞。本文引用的所有专利、专利申请和出版的参考文献均 通过引用全文并入本文。尽 管已参考一些优选实施方案对本发明进行了特别的展示和描述，但是本领域技术人员应理 解，在不脱离权利要求所涵盖的本发明范围的情况下，可进行形式和细节上的多种改变。参考文献1 Snow, R. W.，Guerra, C. A.，Noor, Α. M.，Myint, H. Y. and Hay, S. I.，The global distribution of clinicalepisodes of Plasmodium falciparum malaria. Nature 2005. 434 :214-217.2 Hill,A. 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权利要求
一种重组复制缺陷型猿腺病毒载体，其编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的抗原。
2.根据权利要求1的猿腺病毒载体，其包含其中稳定整合了编码至少一个与调节序列 有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指导所述转基因在哺乳动物细 胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表 位。
3.根据权利要求2的猿腺病毒载体，其中所述猿腺病毒基因组是黑猩猩腺病毒载体的 基因组。
4.根据权利要求3的猿腺病毒载体，其中所述猿腺病毒基因组是黑猩猩腺病毒分离株 63 (AdCh63)、AdCh68 (AdC9)、AdC3、AdC6 或 AdC7 的基因组。
5.根据前述任一项权利要求的猿腺病毒载体，其中所述抗原包含ME.TRAP或由其组成。
6.根据权利要求2至5中任一项的猿腺病毒载体，其中指导所述转基因表达的调节序 列包含CMV启动子。
7.根据权利要求6的猿腺病毒载体，其中所述调节序列包含HCMVIEl基因的启动子和 包括内含子A在内的HCMV IEl基因的5'非翻译区的片段。
8.根据权利要求1至7中任一项的猿腺病毒载体，其包含包装在感染性病毒颗粒中的 猿腺病毒基因组。
9.一种免疫原性组合物，其包含与一种或多种可药用赋形剂、载体、稀释剂或佐剂相混 合的根据权利要求1至8中任一项的猿腺病毒载体。
10.一种疫苗组合物，其包含与一种或多种可药用赋形剂、载体、稀释剂或佐剂相混合 的根据权利要求1至8中任一项的猿腺病毒载体。
11.一种在人对象中引发抗血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)的免疫应答的方法， 其包括给所述对象施用足以在所述对象中引发抗TRAP之免疫应答的量的权利要求9的免 疫原性组合物或权利要求10的疫苗组合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述免疫原性组合物或疫苗组合物以足以引发抗 TRAP的T细胞介导应答的量施用。
13.根据权利要求11或12的方法，其中所述免疫原性组合物或疫苗组合物作为单剂免 疫接种施用。
14.一种在人对象中引发抗血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)的免疫应答的方法， 其包括i)给所述对象施用引发剂量的权利要求9的免疫原性组合物或权利要求10的疫苗组 合物；和 )给同一对象施用加强剂量的包含非腺病毒载体的免疫原性或疫苗组合物，所述非 腺病毒载体编码含有血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)的抗原，其中所述加强剂量在 所述弓I发剂量至少两周后施用，由此在所述对象中引发抗TRAP的免疫应答。
15.根据权利要求14的方法，其中所述加强剂量在所述加强剂量8周后施用。
16.根据权利要求13至15中任一项的方法，其中在步骤ii)中施用的非腺病毒载体是重组痘病毒载体或质粒DNA载体。
17.根据权利要求16的方法，其中所述重组痘病毒载体是经修饰安卡拉痘苗病毒 (MVA) ο
18.一种产品组合或药盒，其包含i)含有重组复制缺陷型猿腺病毒载体的引发组合物，所述腺病毒载体编码包含血小板 反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的抗原；和 )含有非腺病毒载体的加强组合物，其中所述非腺病毒载体也编码包含血小板反应 蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的抗原。
19.根据权利要求18的产品组合或药盒，其中所述猿腺病毒载体包含其中稳定整合 了编码至少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指 导所述转基因在哺乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白 (TRAP)或其至少一个T细胞表位。
20.根据权利要求18或19的产品组合或药盒，其中所述引发组合物和所述加强组合物 都编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的相同抗原。
21.根据权利要求18-20中任一项的产品组合或药盒，其中所述引发组合物和所述加 强组合物都编码ME. TRAP。
22.—种用作疫苗的重组复制缺陷型猿腺病毒载体，其编码包含血小板反应蛋白相关 粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位的抗原.
23.根据权利要求22的用作疫苗的猿腺病毒载体，其中所述载体包含其中稳定整合 了编码至少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指 导所述转基因在哺乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白 (TRAP)或其至少一个T细胞表位。
24.编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位之抗原的 重组复制缺陷型猿腺病毒载体在制备用于引发人对象中针对血小板反应蛋白相关粘附蛋 白(TRAP)的免疫应答的药物中的用途。
25.编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或其至少一个T细胞表位之抗原的 重组复制缺陷型猿腺病毒载体在制备用作抗疟疾疫苗的药物中的用途。
26.根据权利要求24或25的用途，其中所述猿腺病毒载体包含其中稳定整合了编码至 少一个与调节序列有效连接之抗原的转基因的猿腺病毒基因组，所述调节序列指导所述转 基因在哺乳动物细胞中表达，其中所述抗原包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)或 其至少一个T细胞表位。
全文摘要
本发明提供了能够引发抗疟原虫生活周期中红细胞前期的免疫应答的重组腺病毒载体。特别地，本发明提供了一种编码包含血小板反应蛋白相关粘附蛋白(TRAP)之抗原的重组复制缺陷型猿腺病毒载体，并且还提供了包含所述载体的免疫原性组合物(例如疫苗)以及使用这种组合物的方法。
文档编号C12N15/861GK101848729SQ200880019586
公开日2010年9月29日 申请日期2008年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者斯特凡诺·科洛卡, 杰拉尔丁·奥哈拉, 里卡尔多·科尔泰塞, 阿图罗·雷耶斯, 阿德里安·伊尔 申请人:Isis创新有限公司;欧卡罗斯有限公司